口蹄疫灭活疫苗的生产工艺概述
2011,45(1):41～44/厍大亮,等中国兽药杂志
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口蹄疫灭活疫苗的生产工艺概述
厍大亮,李冬
(中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点实验室国家口蹄疫参考实验室
家畜疫病病原生物学国家重点实验室,兰州 730046)
[收稿日期]2010-02-28 [文献标识码]A [文章编号]1002-1280(2011)01-0041-04 [中图分类号]S859.797
[摘 要] 灭活疫苗仍然是当前防控口蹄疫使用的主要疫苗,因此研究灭活疫苗生产工艺具有
非常重要的现实意义。详细论述了口蹄疫灭活疫苗生产过程,并对近年来生产工艺方面的一些研究进展做了简要介绍。
[关键词] 口蹄疫灭活疫苗;生产工艺;质量控制
DescriptiononFootandMouthDiseaseVaccineProcess
SHEDa-liang,(KeyLaboratoryofAnimalVirologyofMinistryofAgriculture,N-mLaboratoryofChina,StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicBiology,LanzhouVmyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046;China)
Abstract:IthemainvaccinesinFMDcontrolprogrammes.Developmentof
inactivatedmouthdiseaseisofgreatrealisticsignificance.ThearticleDiscussedindetailtheproductionpofFMDinactivatedvaccinesandreviewedtheadvancedstudiesontheimportantstepstodevelopFMDinactivatedvaccines.
Keywords:inactivatedfoot-and-mouthdiseasevaccines;process;qualitycontrol
口蹄疫(FMD)灭活疫苗是利用常规技术制造的以灭活病毒为抗原的一类疫苗,是通过实验筛选的田间毒株作为疫苗种毒,经病毒培养系统大量增值,对获得的病毒灭活处理添加佐剂制成的疫苗1],灭活疫苗因其安全有效而被广泛应用。1 灭活疫苗的生产工艺1.1 细胞培养 BHK-21细胞系于1962年问世,现已成为制备FMD疫苗所需病毒抗原的理想细胞系,被广泛应用于FMD疫苗生产。在疫苗生产中,抗原能否获得满意效价很大程度取决于细胞的形态及生长状况,因此细胞培养是疫苗生产中十分重要的环节。疫苗生产中BHK-21细胞的培养方法主要有转瓶培养和悬浮培养两种。1.1.1 转瓶培养 转瓶培养是将种子细胞用消化
[
液分散成单个细胞后加营养液震荡,使细胞分散于
营养液中,再将此营养液按一定比例分装于若干圆柱形细胞瓶中,给细胞瓶加塞扎口后放置于转瓶机上37℃旋转培养,使营养液中的细胞附着于瓶壁,交替接触营养液而分裂增值。传统的消化液采用
[2]
EDTA-胰酶,沈青等报道以柠檬酸钠-胰酶作消化液,只需一次加30mL浸润整个细胞面后倒掉即可,缩短了消化时间,减少了细胞在用力震荡时受到的伤害。使用柠檬酸钠-胰酶消化BHK-21细胞连续传代超过百代,细胞仍然形态一致,活力良好。细胞分种率一般在1∶6到1∶12之间,低于1∶7分种不利于企业成本控制,同时细胞培养容易老化影响其活力。高于1∶9分种率则会影响细胞的密度,培养时间也会延长,而且会影响到细胞连续传代
作者简介:厍大亮(1979年-),男,甘肃金昌人,研究实习员,硕士,从事动物传染病及病原分子流行病学研究。通讯作者:李冬。E-mail:[email protected]
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的稳定性,因此控制在1∶7到1∶9较为理想。
转瓶培养因其所需设备简单,操作方法容易掌握,培养的细胞形态良好而在我国被广泛的采用,但这种方法也有一些缺点,例如:细胞瓶单位体积的产量比较低;工作人员的劳动强度很大;不易控制污染。
1.1.2 悬浮培养 悬浮培养中细胞附着于生物反
应器中的微载体上生长,动物细胞的外层是脆性较大的质膜,所选反应器应务必减小剪切力以降低对细胞的伤害。悬浮培养细胞过程中,既要使细胞的培养条件达到最优化,尽可能消除或减轻环境对细胞的影响以维持细胞高存活力,又要充分考虑细胞表达产物的后续纯化。用于细胞培养的生物反应器主要分搅拌式生物反应器和非搅拌式生物反应器两种
[4]
,其中非搅拌式反应器因产生的剪切
力较小而在细胞培养中表现出了较强的优势。
细胞培养基是细胞赖以体外生长、增殖、分化的重要因素。目前,用无血清培养基的污染,题,,如金精三羧酸(ATA)、锌离子、抗氧化剂和细胞因子等,在一定程度上可阻止因采用无血清培养基而导致的细胞凋亡
[5]
即可收取病毒液,病毒液经菌检及效检合格后方可
进入下一环节。实践证明病毒液反复冻融使细胞破裂,充分释放包含的病毒粒子,可提高病毒效价。转瓶病毒培养属劳动密集型方法,较难控制污染且容易散毒,但生产的病毒液效价比较高。
悬浮培养法增值病毒是当反应器中悬浮培养
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的细胞数达到3×10/mL时接毒,约20～30h后
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收毒,病毒液的TCID50可达7～8。悬浮培养属技术密集型方法,较易控制污染、制备病毒方便快捷、病毒相对不易扩散。1.3 抗原的浓缩与纯化 为使灭活疫苗诱发有效的免疫应答、减少非病毒蛋白引起的动物过敏等不良反应、减少疫苗使用量,就必须对抗原进行浓缩和纯化。现在适宜于大规模生产应用的浓缩纯化方法主要有以下两种:①生产当中常用的动筛,如要求146S完整,须在两者之间找到一个平衡点。应用超滤系统可使病毒浓缩达100倍以上。②沉淀法主要有PEG(聚乙二醇)沉淀法和PEO(聚乙烯氧化物)沉淀法,PEG沉淀法可充分除去变应原成分,PEO沉淀法可使FMDV浓缩达1000倍。1.4 抗原的灭活 甲醛曾是FMD疫苗生产中应用最为广泛的灭活剂,但经研究发现,病毒液中的水解乳蛋白等物质能抑制甲醛的灭活作用而导致灭活不彻底。上世纪80年代以来多数疫苗生产厂家改用乙烯亚胺类衍生物(aziridine)作为灭活[10]剂,其中二乙烯亚胺(BEI)因毒性较小,现在被广泛使用。2000年世界动物卫生组织(OIE)向各国推荐使用1mmol/LBEI两次灭活法,即20～37℃灭活24h后再加一次BEI灭活24h,经多年应用效果较好。2006年OIE又推荐了3mmol/LBEI两次灭活法,BEI用量增加到3mmol/L,26℃分两次共灭活48h,灭活剂用量加大使疫苗安全性更高,温度降低有利于保持病毒粒子146S完整[11]
性。
研究表明乙烯亚胺类衍生物与甲醛相比,不仅毒性大而且灭活后病毒稳定性差,甲醛灭活的弗氏佐剂疫苗有效期可达10年,而BEI灭活的同类疫苗有效期仅2年左右。另有研究表明SAT2型FM2DV经乙烯亚胺类衍生物灭活后再经甲醛处理,稳
。悬浮培养中细胞依附于微载体生长,理想
的微载体应有利于细胞的快速附着和扩展,有利于细胞高密度生长,不干涉代谢产物的合成和分泌,并能使细胞易于脱落
[6]
。
1.2 病毒的生产 制备种毒的毒株需具备的条件
有:良好的免疫原性、抗原的广谱性以及对BHK-21细胞和实验动物有良好的的适应性。由于FM2DV的变异性强,为保证免疫效果应定期检验种毒
与流行毒株的抗原关系,根据检验结果确定是否更换制苗种毒。筛选到符合条件的毒株经乳鼠和BHK-21细胞驯化适应后低温保存,使用前应对种
毒进行毒力测试,TCID50应不低于8.0,LD50应不低于7.0
[7]
。大规模生产商品疫苗用FMDV抗原的
技术有2种:转瓶病毒培养法、悬浮病毒培养法。
以转瓶培养增值病毒时,选取培养2～3d、形态良好致密的单层BHK-21细胞接入种毒,37摄氏度培养0.5h～2h使病毒吸附于细胞后加入维持液继续培养,当细胞病变达90%(CPE)以上时,
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定性明显提高。甲醛与BEI协同作用可将灭活效力提高100倍并且缩短了灭活时间,既改善了疫苗
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的安全性又保护了抗原完整性,因此这种方法值得在生产中推广。
灭活终止后应立即在抗原中加入阻断剂中和多余的乙烯亚胺类衍生物,常用的阻断剂为硫代硫酸钠或焦亚硫酸钠溶液。1.5 乳化 早期的FMD疫苗都采用氢氧化铝作为佐剂,人们发现氢氧化铝佐剂疫苗的不足之处在于:对牛效果较好,而对猪效果差;只能增强TH1型免疫反应,而不能增强细胞介导免疫(CMI);注射
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局部有红斑、肿胀和硬结。现在多使用的油佐剂疫苗对猪、牛都具有免疫效力,主要诱导产生Th2型反应。油佐剂在使用时一般预先将乳化剂(如山梨醇苷单油酸脂)和液状石蜡混合,加入水相抗原,经乳化制成油包水型乳剂,再加入含聚山梨脂的水相抗原进行乳化,制成较复杂的双相(水包油包水型)乳剂疫苗。黏稠度低,,[14]
。近年来MontanideISA205佐剂的使用
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。“即用型”油佐剂的研究也取得了很大的进展,例如十八烯酸酯和甘露糖醇酐可以与抗原混合乳化成物理性质稳定
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且黏度小的双相乳剂,而且不需要乳化设备。
常用的疫苗乳化设备有胶体磨、高压均质机和高剪切均质机。这三种乳化设备各有特点:胶体磨的结构决定了其处理量小,且高速摩擦容易产热,会对疫苗的物理性状产生影响,所以常用于实验室或小规模生产。高剪切均质机与高压均质机常用于大规模生产。高剪切均质机成本较低且操作方便。高压均质机独立于反应罐,以管道分别于配苗罐和储罐连接,相关设备相对复杂,因为属于高压设备,需专业操作人员操作和看管。从乳化效果来说高压均质机乳化的疫苗结构更加均一且不易分层,因此高压均质机是FMD疫苗生产中使用最广泛的乳化设备。
乳化均质工艺对产成品的影响主要表现在产品的物理性状方面,其中佐剂选择、水相与油相的配比、混合均匀程度、混合物的温度及均质乳化时均质机压力等至关重要。在实际操作中,应选择适宜的乳化均质压力,压力过小则影响产品稳定性,但压力过大则缩短设备的使用寿命。2 灭活疫苗的质量控制
FMD疫苗的生产应按照制苗规程并在GMP标准下严格实施。GMP要求车间不同洁净级别的房间应存在压力差,为防止病毒粒子外溢,生产病毒的区域应为负压。进入洁净区的空气应通过HEPA过滤器过滤除菌,整个生产过程完全控制在可蒸汽消毒的的反应罐,管道或者无菌间(具有可冲洗及消毒的密闭墙壁,地板,屋顶)里。生产区限制在一个安全的区域内,材料和人员经过消毒后方可离开生产区。生产线由一系列密闭的不锈钢反应罐构成,这些反应罐由不锈钢管道与辅助设备如过滤器等连接起来,既排除任何活FMDV粒子或外来物污染终产品,也排除了FMDV。FMD。2.1疫苗所涉及到的所《中国兽。2.2 抗原效价的检测 FMDV抗原效价检测是疫苗生产中质量控制的重要环节。牛FMD灭活疫苗采用BHK-21单层细胞接种FMD病毒后测定TCID50来确定抗原效价。猪FMD灭活疫苗抗原效价检测采用乳鼠接种法测其LD50。现在很多实验室和疫苗公司采用敏感而重复性好的蚀斑测定法测定病毒的感染性。2.3 安全性检验 灭活完成后,每批灭活抗原样品应通过敏感单层细胞传代或乳鼠接种试验,以判定灭活抗原的安全性。敏感单层细胞传代时通常传2～3代应无细胞病变(CFU)。样品接种乳鼠后连续观察7日应全部健康。
欧洲药典规定,牛FMD灭活疫苗制苗病毒液灭活安检时,用至少6月龄健康易感牛,按2mL/头的剂量,分别于舌部皮下注射3头牛,联续观察6日应均不引起典型症状。猪FMD灭活疫苗制苗病毒液灭活安检时用30～40日龄健康易感仔猪,按2mL/头的剂量,分别于耳后肌肉注射3头仔猪,连续观察14日应均不引起典型症状。2.4 成品检验 成品检验主要包括对动物的无害性和疫苗中是否残留活病毒两部分。按照OIE标准,可以用牛同时进行牛FMD灭活疫苗毒性和非感染性试验,选3头血清阴性的健康牛,每头舌背面皮内接种疫苗20个点,每点0.1mL,至少观察4
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d,然后每头皮下注射3倍剂量的疫苗,再继续观察6d,如果有动物出现FMD症状,则试验失败,如果
动物表现任何不适,疫苗也不合格。猪FMD灭活疫苗毒性检验使用2只豚鼠和5只小鼠,每只豚鼠接种2mL疫苗,每只小鼠接种0.5mL疫苗,观察7d。如无动物死亡且无明显的局部和全身性反应,则检验合格。
效力检验:效力试验的目的是检验疫苗的效果,必须严格执行国家监察当局制定的切合实际需要的效力标准。根据2004年版OIE标准,效力检
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验方法有两种。一种是50%保护剂量(PD50)测定法,该法规定常规预防用疫苗每免疫剂量不少于3个PD50,应急或环状免疫用疫苗每免疫剂量不少于6个PD50。另一种是抗蹄部泛化感染保护百分率测定法,该法规定免疫保护率必须达12/16。其他试验,包括用病毒中和试验和ELISA法测定免疫血清的保护性抗体,也可以用于疫苗效力检验。但[18]
学相关性时,2.5 无菌检验不同的检验标准1997年版的欧洲药典,我国则主要依据2001年版《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》。3 灭活疫苗的发展趋势
上世纪六十年代以来发达国家通过建立疫苗储备库以应对FMD突发事件,早期的FMD疫苗库只储备成品疫苗。因成品疫苗保存期有限,1976年丹麦建立了世界上第一个抗原储备库,以超低温储备高浓度FMD灭活抗原,这种方法使抗原保存期限大大延长。随后无疫情国家认识到疫情发生的潜在威胁,纷纷建立自己的抗原(或疫苗)储备库。现代疫苗库解决了抗原保存期限的问题,但如疫情爆发,需将抗原配制成苗,紧急情况下不能及时控制疫情,为此有学者提出可将储备的抗原和预先配置好的佐剂分层装在一个容器内进行保存,在紧急需要时可现配现用,当然这种预先配置好的佐剂是一种新型、不需高压研磨或均质,只要将其与抗原混匀轻轻震荡,即可乳化成疫苗的佐剂。
近年来随着分子生物学的飞速发展出现了许多新型FMD疫苗,但这类疫苗因自生存在的免疫原性弱等缺陷,尚不具备与传统灭活疫苗竞争市场
的实力。目前科研人员正在不断改进FMD灭活疫苗的生产工艺,通过这些工作,FMD灭活疫苗的质量会更加稳定,免疫效果也将会更好。可以预见在未来几年里灭活疫苗在防控FMD方面仍将起到举足轻重的作用。参考文献:
[1] 宁宜宝.兽用疫苗学[M].北京:中国农业出版社,2008:239
-244.
[2] 沈青,许士杰,沈铭强.简单、实用、高效的细胞培养技术
[J].中国兽药杂志,2005,39(6):52-53.
[3] 兰虎云.谈谈口蹄疫灭活疫苗生产质量控制[J].云南畜牧
兽医,2008,3:43.
[4] 张前程,张凤宝,姚康德,等.动物细胞培养生物反应器研究
进展[J].化工进展,2002,21(8):560-563.
[5] 陈昭烈.[J].生物工程进展,
1998,(6):17-[6PieletandGrowthof
-Novel,Charged-surfaceMi2-freeConditions[J].Cyto-technology,101-109.
7] 谢庆阁.口蹄疫[M].北京:中国农业出版社,2004:182-183.
[8] 薛英,王延,王玉红,等.BHK-21细胞的悬浮驯化及其在
悬培条件下对口蹄疫A型病毒的培养[J].广东畜牧兽医科技,2008,1(33):35-36.
[10]BrownF,KramerE,BrownF.
InactivationofVirusesbyAziri2
dines[J].Vaccine,2001,20:322-327.
[11]卢永干.我国口蹄疫灭活疫苗生产工艺的技术进步[C].第
11次全国口蹄疫学术研讨会论文集,辽宁大连:2007:948-950.
[12]BartelingSJ.DevelopmentandPerformanceofInactivatedVac2
cinesagainstFootandMouthDisease[J].RevSciTech,2002,21(3):577-588.
[13]沈克飞,曹兰,尹继刚,等.免疫佐剂研究进展[J].动物医学
进展,2007,28(增):34-36.
[14]VallietR.ImprovedTechniqueforthePreparationofWater-in-OilEmulsionsContainingProteinAntigens[J].Biotechniques,1996,20(5):797-800.
[15]BarnettPV,CarabinH.AReviewofEmergencyFoot-and-mouthDisease(FMD)Vaccines[J].Vaccine,2002,20(11/12):1505-1514.
[16]张淑刚,张永光.口蹄疫灭活疫苗研究进展[J].动物医学进
展,2008,29(12):43-47.
[17]中国动物卫生与流行病学中心,译.陆生动物诊断试验和疫苗
手册[M].第5版.北京:中国农业出版社,2004:105-108.
[18]McCulloughKC,DeSimoneF,BrocchiE,etal.Protectiveim2
muneReponseagainstFoot-and-mouthDisease[J].JVirol,1992,66(4):1835-1840.