Cre_loxp位点特异性重组系统在转基因植物中的应用

福建农业学报23(2) :211～217,2008

Fuj ian J ournal of A g ricultural Sciences

文章编号:1008-0384(2008) 02-0211-07

Cre/lox p 位点特异性重组系统在转基因植物中的应用

邱淑萍1, 2, 陈在杰1, 王　锋1

(1. 福建省农业科学院福建农业遗传工程重点实验室, 福建　福州　;

2. 福建师范大学生命科学学院, 福建福州　350007摘　要:的引入或删除, 已成为植物遗传操作中的重要工具。, 并着重阐述Cre/lox p 。关键词:位点特异性重组; p ; 基因删除; 定点整合中图分类号:Q 1文献标识码:A

Q IU Shu 2ping 1,2, CH EN Zai 2jie 1, WAN G Feng 1

(1.

Fuj ian Key L aboratory of Genetic Engineering f or A g riculture , Fuj ian A cadem y of A g ricul 2tural Sciences , Fuz hou , Fuj ian 　350003, China; 2. College of L i f e S ciences , Fuj ian N ormal

Universit y , Fuz hou , Fuj ian 　350007, China )

Cre/lox p site 2specif ic recombination technology on transgenic plants

Abstract :Site 2specific recombination technology has been developed and widely applied for plant genetic manipula 2tions. It can successf ully delete marker genes f rom a transgenic plant or site 2specifically integrate a gene to a pre 2de 2termined genomic location in a precise , single 2copy pattern. This article reviews the Cre/lox p site 2specific recombi 2nation technique and its applications for marker gene deletion and precise gene integration.

K ey w ords :site 2specific recombination ; Cre/lox p ; transgenic plant ; gene deletion ; site 2specific integration

　　在重组酶的催化下, 两段DNA 序列的特异位点处发生整合并共价连接, 称为位点特异性重

组[1]。位点特异性重组系统由介导基因重组的重组酶和相应的特异性位点组成。重组酶是源于细菌或酵母, 可识别特异位点发生精确重组的一类酶。根据序列的同源性及催化氨基酸的特性, 重组酶可分为酪氨酸和丝氨酸两个家族[2]。重组酶Cre 、Flp 、R 以及Xis 均属于酪氨酸家族, lox p 、f rt 、rs 和att p 为相应的特异性位点, 这些特异性位点DNA 序列各异, 但大体结构相似, 一般均由几十个碱基组成, 含有一个6～8bp 的核心区域和一对反向重复序列。

位点特异性重组系统始于对λ噬菌体溶源化的过程研究, 之后人们对其他位点特异性重组系统的重组酶、识别位点、重组机理等进行了深入的研究[3-4]。特异性重组系统在控制植物外源DNA 序列的整合中有着重要的作用, 它能产生基因的定位

收稿日期:2008-03-25初稿; 2008-05-28修改稿

删除[5]、倒位、外来基因的整合[6]以及染色体易位[7]等, 如果结合同源重组技术, 还可实现内源基因的替换及切除[8]。已证明在植物中有效的位点特异性重组系统包括大肠杆菌噬菌体p1的Cre/lox p 系统[9]、接合酵母的R/rs 系统[10]、酿酒酵母的Flp/f rt 系统[11]和大肠杆菌噬菌体λ的Xis/att p 系统[12]。其中, Cre/lox p 是在植物中研究的最为深入和广泛的一个位点特异性重组系统[13-16]。

1　Cre/lox p 位点特异性重组系统的

结构及重组机制

Cre/lox p 位点特异性重组系统是Steinberg 等

首先在大肠杆菌噬菌体p1中发现的, 由Cre 重组酶和lox p 位点两部分组成[17]。Cre 重组酶是噬菌体p1编码的分子量为3815kD 的蛋白质, 能够识别特异的DNA 序列(lox p ) 并进行特定的剪切和拼接。该蛋白由较小的N -末端和较大的C -末端

作者简介:邱淑萍(1981-) , 女, 硕士研究生, 从事植物基因工程研究

通讯作者:王锋(1963-) , 男, 博士, 研究员, 从事植物基因工程研究(E 2mail :wf @fjage. org ) 基金项目:福建省自然科学基金(B01220003)

212福建农业学报第23卷

两个结构域组成, N -末端与lox p 系列的识别有关。C -末端具有一个“Arg -His -Arg -Tyr ”的四联体结构, 是cre 基因的活性中心, 和DNA 的结合及DNA 的切割有关[18]。Cre 酶的特异识别位点lox p 是一种典型的回文序列结构, 长34bp , 包括两个13bp 的反向重复序列和8bp 的非对称间隔序列[19]。重组反应是在DNA 的两个lox p 位点间进行, 整个过程没有DNA 的合成和丢失。重组反应既可以发生在体内、体外的细胞中, 也可以在无细胞体系中进行。

Cre/lox p 重组、连接、分离的过程, 骤:①lox p 个Cre 酶亚基, 当lox p 位点3′-PO 4共价结合形成“Holliday 结构”时, 便导致了DNA 链的切割; ②切割后产生的5′-O H 可与另一切割部位的3’-PO 4结合发生链的交换, 形成一个的中间产物, 继而产生结构的异构化, 这时另外1个Cre 酶进行第2次链的切割和交换; ③联会复合体解体, 重组酶和重组产物被释放(图1) [20]。

Cre/lox p 重组反应的模式并非单一的形式, 8bp 非对称间隔区决定了lox p 位点具有方向性, 根

据两个lox p 位点的方向不同又介导三种不同的重组反应:①2个lox p 位点处于同一个分子上, 方向相反时, 两个lox p 位点间的DNA 片段重组后发生倒位; ②2个lox p 位点处于同一个分子上, 方向相同时, 两lox p 位点之间的DNA 片段重组后被剔除; ③2个lox p 位点是在不同分子上, 则可使DNA 发生易位(图2) [13]。

更为重要的是, 选择标记基因的存在引起了人们对其安全性方面的关注, 同时还限制了通过多次转化的方法对转基因作物进行进一步的改良[21]。解决这些问题的最根本途径, 就是去除转基因植物中的选择标记基因。因此, 去除选择标记已成为国际上植物基因工程领域的一个趋势。

目前, 已有一些方法可获得不带选择标记基因的转化植株, 主要有转座子成分介导法[22], 位点特异性重组系统(如Cre/lox p 系统) 介导法及共转化方法[23]等。Dale 和Ow (1990) [13]最早在烟草细胞中进行了位点特异性重组的研究, 结果表明植物细胞具有支持Cre/lox p 重组系统的能力, 虽然重组只是发生烟草原生质体上, 但它为Cre/lox p 系统应用于转基因植物研究领域开辟了先河。其后, 利用Cre/lox p 系统从转基因植物中删除标记基因的研究越来越深入, 已成为目前中较为成熟的手段[24]。

2　Cre/lox p 在转基因植物中剔除选

择标记基因的应用

目前, 所有植物转基因方法在其转化过程中都只能使转化受体的少数细胞接受外源DNA , 外源DNA 整合到宿主染色体组上并且能表达的又少之又少, 必须采取选择的策略才能有效地把转化细胞从大量非转化细胞中区分开。一般都是通过选择标记基因的帮助来达到选择目的:在选择压力下, 非转化细胞的生长受到抑制并筛除, 而转化细胞的生长不受抑制。因此, 在转化过程中, 选择标记基因往往是必须的。然而, 选择标记基因及其蛋白产物毕竟不是基因工程的目的产品, 当转基因植株分化形成后, 这些选择标记基因一般来说都是多余的

。

第2期邱淑萍等:Cre/lox p 位点特异性重组系统在转基因植物中的应用213

211　有性杂交或二次转化方式将cre 基因导入到coda 基因被删除。此方法虽然不需要有性杂交,

转lox p 结构的植株中剔除选择标记基因

Dale 等[13]首次利用Cre/lox p 位点特异性重组系统, 在转基因烟草中实现了选择标记基因的剔除。他们用两侧带同向lox p 序列的潮霉素磷酸转移酶(hygromycin p ho sp hot ransferase , hy g ) 基因做选择标记基因, 转化荧光素酶基因(l uci f er 2ase ) , 在二次转化的cre 基因表达的重组酶蛋白的作用下, 11个转化植株中有10个的hy g 基因被删除, 删除频率达9019%; 而转hy g 基因植株与转cre 基因的转化植株杂交时, 78后代植株删除了hy g 基因, 53Russell 等[25]抗性的选择标记(hase , als ) 基因构建在了两个同向lox p 序列之间转化烟草, 随后通过农杆菌介导的二次转化在38个转基因植株中转入cre 基因, 36个转化植株的磺酰脲抗性呈阴性(95%) ; 有性杂交将cre 基因导入到已携带als 的转化植株体内时, 23个植株中有8个后代植株删除了als 基因, 频率为34178%。其后, 陆续有利用有性杂交或二次转化方式将Cre/lox p 系统应用于其他转基因作物(如水稻) 删除标记基因的报道[26-29]。作者所在实验室利用Cre/lox p 系统在转基因水稻中介导标记基因剔除, 并获得了剔除选择标记hy g 基因的转双价抗虫基因sck/cry 1A c 籼稻恢复系明恢86[29]。

然而, 通过二次转化和有性杂交将cre 基因导入到转化lox p 结构的植株中剔除选择标记基因, 均需要通过自交分离进一步去掉重组酶基因及转化重组酶基因所带入的另一个选择标记基因, 使得无选择标记基因转基因作物的选育过于复杂, 周期过长, 同时也不适用于无性繁殖作物如木本植物等的培育。212　诱导Cre 重组酶表达剔除选择标记基因由于有性杂交或二次转化均大大影响转基因进程, Cleave 等[30]采用Cre 重组酶瞬时表达法对此作了改进。他们构建植物表达载体pA R T54, 载体含有CaMV35S 启动子控制的ui d a 基因, 在同向lox p 序列间包括n pt I I 基因和cod a 基因, 通过农杆菌介导转化烟草, 得到含有pA TR54的转基因植株, 再与只含有cre 基因的p Cre 质粒农杆菌共培养, 在773个芽中有19个可以忍耐5-氟胞嘧啶(5-fluorocyto sine , 5-fc ) , 表明这19个芽中的coda 基因已被删除, 其中有2株cod a 删除是由于cre 基因的瞬时表达, T 1代表型进一步证实了

但是同样需要二次转化引发瞬时表达cre 基因, 删除效率也很低。

针对上述问题一些研究者采取了构建诱导型表达载体的策略, 在诱导型表达载体中, 重组酶Cre 的表达受控于化学诱导或热诱导的激活型启动子, Joachim 等[31]将cre 基lox top 10启动子控制表TA 激活, top 10启动子被激活, 引发Cre 蛋白表达, 诱导同向lox p 位点间序列发生删除反应, 得到去除标记基因的后代植株。Zuo 等[32]构建了一个化学诱导型的载体转化拟南芥, 选择标记基因、cre 基因和XV E (雌激素受体) 处于两个lox p 位点之间, 上游为一启动子, 下游为一报告基因g f p , cre 基因表达受控于XV E , 经雌二醇处理的转基因植株, 选择标记基因、cre 基因和XV E 被有效删除, 下游g f p 基因在启动子的引发下表达。遗传分析表明, 由此系统剔除标记基因可控度高, 适用于无性和有性繁殖的作物。Zhang 等[33-37]利用热激蛋白启动子启动cre 基因的表达, 分别在拟南芥、玉米烟草、马铃薯等作物中删除了标记基因。2003年, Mlynarova 等[38]还报导将Cre/lox p 诱导删除和二次转化相结合组成一个新

的删除系统, 在这个新的删除系统中, 他们发现cre 基因的表达量受到了限制, 但是表达量足以满足删除标记基因的需要, 而且其删除效率比诱导删除更高。

在诱导删除系统中, cre 基因在转基因植物的To 代就可以表达, 这就简化了操作程序, 缩短了cre 基因的表达时间, 避免了cre 基因过量表达对植物造成的伤害; 同时诱导删除方式也适合无性繁殖作物[37]。但是诱导系统诱导时存在空间上的不平衡性[39], 主要集中在蒸腾作用比较旺盛的区域, 这种不平衡性, 很大程度上限制了诱导删除系统在无选择标记转基因植物中的应用。213　利用组织特异性启动子诱导Cre 重组酶表达在转基因植物中剔除选择标记基因

通过诱导控制Cre 重组酶表达的方式, 不能对转基因植株中cre 基因的表达部位和表达水平进行调控。一般来说, 植株的花粉、果实和种子等部位仍然有外源基因的存在, 花粉传播造成的基因漂移和食用安全性的担忧仍然存在。如果将Cre 酶置于组织特异性启动子的调控之下, 就可以对cre 基因

214福建农业学报第23卷

进行时空特异性调控, 定位删除标记基因。Li (2007) 等[40]利用胚芽特异性启动子实现了在大豆胚芽中定位删除选择标记基因, 他们采用来自拟南芥的胚芽特异性启动子a p p 1, 来调控Cre 重组酶在大豆胚芽中定位表达, 在大豆的胚芽中删除了选择标记基因hy g 。214　Cre/lox p 和Flp/f rt 协同作用在转基因植物中剔除选择标记

近年来, Cre/lox p 重组系统己得到越来越广泛的应用, 同时也一直在改进这套系统, 以获得更强的功能和更高的重组效率, 之一即为Cre/lox p 系统与用。林忠平等() [41]p 系统与Flp/f rt , 其中第一个载体含有第一个重组系统的识别位点和第二个重组系统的重组酶, 以及一种能够改善植物某种性状的蛋白; 第二个载体含有第二个重组系统的识别位点和第一个重组系统的重组酶, 也含有一种能够改善植物性状的蛋白。两个载体分别转化植物细胞, 得到的转基因植株都可以分别表达转入的改善植物某种性状的蛋白基因, 但当两个载体的转基因后代发生杂交时, 由于重组酶和识别位点在空间上的靠近, 两种重组酶能够切割和删除它们各自识别位点间的特定的核苷酸系列。如载体lox p -bt -f l p -lox p 和f rt -bt -cre -f rt , 分别转化烟草细

够明显提高重组酶系统的删除效率; 而在存在融合识别位点lox p f rt 的情况下, 在同一载体(pL F 2CF GN ) 同时导入重组酶cre 基因和f l p 基因, 希望获得更高的删除效率, 结果却出乎意料, 最高删除效率只有4918%, 比单个的重组酶效率要低得多。推测融合识别位点提高系统删除效率的原因是:①融合识别位点可能更易形成发夹结构, 该、结合和切割。②p 和f rt , 当两者融合, 可, 从而。而同时导入两种重组酶降低删除效率的可能原因是:①lox p 和f rt 间序列太近, 两种重组酶之间存在竞争抑制作用。②另一种推测是两个融合同向位点若结合上不同的重组酶就无法完成切割反应, 从而降低了删除效率。上述观点仅仅是目前根据实验结果作出的推测, 真正的原因和理论根据目前还不十分清楚, 有待进一步研究。

表1　不同特异性识别位点删除元件盒的删除效率(L uo ,2007)

T able 1　Schem atic illustration of diffrent special site cassette

delete eff iciency

名称

pL F GN p FL CGN p FBF GN pL FLCGN pL FBF GN pL FCF GN

组成元件

lox p f rt -35S -GUS :NP TII -lox 2

p f rt

f rt -LA T52-Cre -35S -GUS :NP TII -f rt

f rt -B GP1-Flp -35S -GUS :NP TII -f rt

lox p f rt -LA T52-Cre -35S -GU S :NPTII -lox p f rt

lox p f rt -B GP1-Flp -35-GUS :NP TII -lox p f rt

lox p f rt -LA T52-Cre -B GP1-Flp -35S -GUS :NP TII -lox p f rt

删除效率

(%) 0812～34141819～77153716～1004913～1002616～4918

胞时, 两种转基因植株都表现出抗虫性, 如果两种植株发生相互传粉, 均导致转基因植株杂交后代中bt 基因的删除。此系统的基本策略是利用杂交后两个重组系统在空间上的靠近来删除特定的DNA 序列。

2007年L uo 等[42]则利用同向融合lox p 与f rt 两个特异识别位点构成一个新的杂合识别位点lox p f rt , 增强重组酶蛋白Cre 或Flp 对识别位点序列的识别、结合以及切割作用, 提高位点特异性重组酶系统在转基因植物中对外源基因的删除效率, 建立了一个高效的基因删除系统。为研究验证此系统, 构建了包含识别位点lox p 和f rt 的融合识别位点lox p f rt , 获得一个全新的基因删除系统, 比较了不同的识别位点(表1) 对位点特异性重组系统的删除效率的影响。研究表明, 带有lox p f rt 融合识别位点的pL FB F GN 和pL FL C GN 相比较只含有单个识别位点的p FB F GN 和p FL 2CGN , 其删除效率显著提高, 说明在位点特异性重组酶系统中, 识别位点对于转基因植物中重组酶的删除效率有着十分重要的作用, 融合识别位点能

　注:Cre , Cre recombinase gene ; Flp , Flp recombinase gene ; L ,

lox p recognition sequences ; F , f rt recognition sequences ; L F ,

fused lox p and f rt recognition sequences ; B GP 1,pollen -spe 2cific B GP 1gene promoter ; L A T 52, pollen -specific L A T 52gene promoter ; The GUS ::NP TII fusion gene was driven by t he 35S cauliflowermosaic virus (CaMV ) gene promoter

3　位点特异性重组系统Cre/lox p 应

用于转基因植物中的定点整合

在转基因植物中, 当外源基因随机整合到宿主染色体上时, 由于染色体的位置效应或是基因的拷贝数不同, 会造成外源基因表达水平存在一定的差

第2期邱淑萍等:Cre/lox p 位点特异性重组系统在转基因植物中的应用215

异, 并且可能导致宿主本身所含基因的失活。而高等植物中同源重组的频率只有10–3～10–6[43], 这种低频率限制了同源重组在转基因植物中的应用。位点特异性重组系统如Cre /lox p 系统, 它既可以提高外源基因的整合效率又可以提高整合位置的准确性, 但是由于Cre /lox p 介导的重组反应是可逆的, Cre 酶的持续作用会导致整合到染色体组上的DNA 片断重新被删除。保证准确稳定的插入整合的关键是可控Cre 重组酶的表达。

在烟草的原生质体中率先

验证了利用Cre/lox p 源基因定点整合技术的可行性采取了置换启动Cre cre 基因这

1995年Albert 等

[44]

多拷贝产生的基因沉默现象提供了一条有价值方法。

目前, 位点特异性重组系统在转基因植物中的研究主要是从转基因植物中删除标记基因或者是定点整合外源基因到特定的植物染色体上, 但是这两个策略是独立的研究。而Nanto 等[49]提出一个设, 定点整合外源基因后, 异性重组系统, 尤其是Cre/

, 已使设计精确的遗传修饰成为可能,

不仅可以精确地引入外源基因, 还可以设定遗传开关在时空上控制外源基因的表达和缺失, 显示了巨大的应用前景。但是该系统在整合与删除两项技术上都还存在缺陷, 虽然定位剔除可以将某些转基因植物的种子、果实等食用部位中的标记基因选择性地切除, 但在Cre 切口处留下了一个34对碱基的

lox p 位点, 所获得的植株除目的基因外还有其他

cre 基因的活性。研究结果显示:采取启动子置换策略在突变型lox p 中观察到整合反应, 而野生型lox p 中则没有; 瞬时表达cre 基因策略中, 突变型及野生型的lox p 位点均观察到整合反应。

报导了利用Cre/lox p 位点特异

性重组系统, 在拟南芥染色体中预先设定的位点上准确整合插入外源基因的研究。其构建了整合载体plox -npt II -lox , 转化后, 在Cre 酶作用下整合载体中融合有n pt I I 基因的片段被删除下来变成环

Vergunst 等

[45]

的DNA 序列; 此外, 融合两个位点特异性重组系统的反应机制还缺乏理论依据; 在遗传育种方面, 在花粉或者种子中删除了外源基因, 其后代就不能保持这个外源基因的优良特性, 限制了在有性繁殖作物上的育种利用; 这些方面都还有待于进一步的完善。参考文献:

[1]沈同, 王镜岩. 生物化学:第3版[M ].北京:高等教育出

状双链DNA , 含有一个lox p 位点的环状双链DNA 在Cre 重组酶的作用下, 与拟南芥染色体上已导入的单个lox p 位点发生定点整合反应; 整合后利用失活Cre 重组酶来抑制可逆反应的进行。结果表明, 89%的重组子发生定点整合。

遗传转化过程中通常在一个位置上会出现多个拷贝DNA 片段的插入[46], 利用Cre/lox p 系统, 可以将外源基因准确的整合到设定的基因组上, 而且整合的DNA 是未发生重排的单个拷贝。这种方法在Srivastava 等[47]所做的小麦转化实验中得到证实, 在四个多拷贝位置利用定点整合系统都成功地实现了单拷贝插入。De Buck 等[48]利用Cre/lox p 系统有效解决了在多个复杂T -DNA 插入位点得到单拷贝转化子的问题, 他们构建了一个SB -lox p -T -DNA 结构, 这个结构包含两个反向的lox p 位点。7个转化SB -lox p -T -DNA 的植株与能表达cre 基因的植株发生杂交, 其中三个杂交后代是单拷贝插入, 复杂的T -DNA 插入区域在后代分离去掉c re 基因后发现只有单一的T -DNA 位点。此系统利用Cre/lox p 解决了复杂的T -DNA 单拷贝插入的问题, 为解决植物转化中因

版社, 2002:443-447.

[2]AR GOS P , LAND Y A , ABREMSKI K , et al. The integrase

family of site -specific recombinases :regional similarities and global diversity [J].Embo J , 1986, 5(2) :433-440. [3]GRAIN GE I , J A YARAM M. The integrase family of recombi 2

nase :organization and function of t he active site [J].Mol Mi 2crobiol , 1999, 33(3) :449-456.

[4]KILB Y N J , SNAIT H M R , MU RRA Y J A. Site 2specific

recombinases :tools for genome engineering [J].Trends Gen 2et , 1993. 9(12) :413-421.

[5]TRU TANI M , ITAMI S , O KABE M , et al. Tissue 2specific

knockout of t he mouse Pig -a gene reveals important roles for GPI -anchored proteins in skin development [J ].Proc Natl Acad Sci USA , 1997, 94:7400-7405.

[6]SAU ER B , H EN GERSON N. Targeted insertion of exogenous

DNA into t he eukaryotic genome by t he Cre recombinase [J].Ner Biol , 1990, 2:441-449.

[7]STUU RMAN J , DEVROOMEN M J , NIJ IKAMP H J , et al.

Single 2site manipulation of tomato chromosomes in vitro and in vivo using Cre 2lox site 2specific recombination [J].Plant Molec 2ular Biology , 1996, 32:901-913.

216福建农业学报第23卷

[8]VAZQU EZ J C , NO GU ES C , BU EKER E B , et al. Factors af 2

fecting t he efficiency of introducing precise genetic changes in ES cells by homologus recombination :tag 2and 2exchange versus t he Cre 2loxp system [J].Trans genic Res , 1998, 7(3) :151-193.

[9]ODELL J , CAIMI P , SAU ER B , et al. Site 2directed recombi 2

nation in t he genome of t ransgenic tobacco [J].Mol G en Gen 2et , 1990, 223:369-378.

[10]SU GITA K , KASA HARA T , MA TSUNA GA E , et al. A

transformation vector for t he production of marker free trans 2genic plant s containing a single copy transgene at high frequency [J].Plant J , 2000, 22:461-469.

[11]LLO YD A M , DAVIS R W. Functional he

yeast FL P/FR T site 2specific tabacum [J].Mol Gen , , :-[12]B ET TER M , AU J , et al. Role of

t he Xis Protein of lambda in a specificreaetive complex at t he att R prophage attaehment site [J].Cell , 1983, 32(l ) :161-168.

[13]DAL E E C , OW D W. Intra 2and intermolecular site 2specific

recombination in plant cells mediated by baceteri ophage P1recombinase [J].Gene , 1990, 91:79-85.

[14]ODELL J , CAIMI P , SAU ER B , et al. Site 2directed recombi 2

nation in t he genome of transgenic tobacco [J].Mo l Gen Gen 2et , 1990, 223:369-378.

[15]QU E Q , WAN G H Y , J OR GENSEN R J. Distinct patterns of

pigment suppression are produced by allelic sense and antisense chalcone synt hase transgenes in petunia flowers [J].Plant J , 1998, 13(3) :401-409.

[16]V EREUNST A C , J ANSEN L E , HOO YKAAS P J. Site 2spe 2

cific integration of Agrobacterium T -DNA in Arabidopsis t haliana mediated by Cre recombinase [J].Nucleic Acids Res , 1998, 26(11) :2729-2734.

[17]STEINBER G N , HAMIL TON D. Bacteriophage P1site 2spe 2

cific recombination. I. Recombination between lox P Sites [J].J Mol Biol , 1981, 150:467-486.

[18]GUO F , GOPAUL D N , VAN D. Structure of Cre recombi 2

nase complexed wit h DNA in a site 2specific recombination syn 2apse [J].Nature , 1997, 389:40-46.

[19]HO ESS R H , ABREMSKI K. Interaction of t he bacteriophage

P1recombinase Cre wit h t he recombining site loxp [J].Proc Natl Acad Sci USA , 1984, 81:1026-1029.

[20]GOPAUL D N , GUO F , VAN D. St ructure of t he Holliday

junction intermediate in Cre 2loxP site 2specific recombination [J].The EMBO Journal Vol , 1998, 17(14) pp :4175-4187.

[21]YODER J I , GOLDSBROU GH A P. Transformation system

for generating marker 2free transgenic plant s [J].Bio/Technol , 1994, 12:263-267.

[22]GOLDSBROU GH A P , LASTRELLA C N , YODER J I.

Transposition mediated repositioning and subsequent elimination of marker genes from transgenic tomato [J ].Bio/Technol , 1993, 11:1286-1292.

[23]MCKNIGH T T D , L ILL IS M T , SIMPSON R B. Segregation

of genes transferred to one plant cell from two separate Agrobacterium strains [J].Plant Mol Biol , 1989, 13:533-540.

[24]易厚富, 王金发. 异源位点特异性重组系统在植物在的研究

[J].遗传, 1999, 21(5) :62-66.

[25]RUSSELL S H , HOOPES J L , ODELL J T. Directed excision

of a transgene from t he plant genome [J].Mol Gen Genetic , 1992, 234:49-59.

[26], , , Cre/lox 定位重组系统共转化

]., 1999, 44(21) :2291-[], 汪阳明, 丁伟, 等. Cre -lox 重组系统介导转基因烟

草中外源基因删除的研究[J].北京大学学报:自然科学版,

2001, 37(04) :477-482.

[28]ODELL J , CAIMI P , SAU ER B , et al. Site 2directed recombi 2

nation in t he genome of transgenic tobacco [J].Mol Gen Gen 2et , 1990, 223:369-378.

[29]陈松彪, 刘翔, 彭海英, 等. Cre/lox 介导除转双sck +cryI 2

Ac 基因籼稻恢复系明恢86材料的选择标记基因[J].植物学

报, 2004, 46(12) :1416-1423.

[30]G L EAV E A P , MITRA D S , MUD GE S R , et al. selectable

marker -free transgenic plant s wit hout sexual crossing :transi 2ent expression of cre recombinase and use of a conditional let hal dominant gene [J].Plant Mol Biol , 1999, 40:223-235. [31]J OACHIM S , ANDREA W , UL RICH C , et al. Minimizing

transgenic DNA while maximizing function [J ].genes , 1-33.

[32]ZUO J Q , NIU Q W , MOU ER S G , et al. Chemical 2regula 2

ted , site 2specific DNA excision in transgenic plant s [J ].Na 2ture Biotechnology , 2001, 19:157-161.

[33]HOFF T , SCHNORR K M , MUND Y J. A recombinase 2me 2

diated t ranscriptional induction system in transgenic plant s [J].Plant Mol Biol , 2001, 45:41-49.

[34]ZHAN G W , SUBBARAO S , ADDA E P , et al. Cre/loxmedi 2

ated marker gene excision in transgenic maize (Ze a mays L. ) plant s [J].Theor Appl Genet , 2003, 107:1157-1168. [35]WAN G Y , CH EN B , HU Y , et al. Inducible excision of se 2

lect able marker gene from transgenic plant s by t he cre/lox site 2specific recombination system [J].Transgenic Res , 2005, 14(5) :605-614.

[36]CU ELLAR W , GAUDIN A , SOLORZANO D. Self 2excision

of t he antibiotic resistance gene npt II using a heat inducible Cre -loxP system from transgenic potato [J ].Plant Mol Bio , 2006, l62:71-82.

[37]ZHAN G Y , L I H , OU YAN G B , et al. Chemical 2induced auto

excision of selectable markers in elite tomato plant s trans formed wit h a gene conferring resistance to lepidopteran insect s [J].Biotechnol Lett , 2006, 28(16) :1247-253.

[38]Mlynarova L , Nap J P. A self 2excising Cre recombinase al 2

lows efficient recombination of multiple ectopic heterospecific lox sites in transgenic tobacco [J ].2003, 12:45-57.

Transgenic Research ,

Marker

第2期邱淑萍等:Cre/lox p 位点特异性重组系统在转基因植物中的应用217

[39]GA TZ C , L EN K I. Promoters t hat respond to chemical in 2

ducers [J].Trends Plant Sci , 1998, 3:353-358.

[40]L I Z , XIN G A , MOON B P , et al. A Cre/loxP -media ted

self 2activating gene excision system to produce marker gene free transgenic soybean plant s [J].Plant Mol Biol , 2007, 65:329-334.

[41]林忠平, 陈杨坚, 倪挺, 等. 采用两套定位重组系统删除特

cific integration of Agrobacterium T -DNA in Arabidopsis t haliana mediated by Cre recombinase [J].Nucleic Acids Re 2search , 1998, 26(11) :2729-2734.

[46]ASSAAD F F , TUC KER K L , SIGN ER E R. Epigenetic

ropeat induced gene silencing (R2Gs ) in Arabidopsis [J ].Plant Mol Biol , 1993, 22:1067-1085.

[47]SRIVASTAVA V , ANDERSON O D , OW D D. Single 2copy

transgenic wheat generated t t he resolution of complex integration patterns [J].Natl Acad Sci U S A , 1999, 96(20) :-[]DE S , , C , et al. Generation of

2Transformant s by t he CRE/mediated Resolution System [J ].Plant Physiol , 2007, 145:1171-1182.

[49]NAN TO K , ANDEBINUMA H. Marker 2free site 2specific in 2

tegration plant s [J].Transgenic Res , 2007, 17(3) :337-344.

定外源基因的方法. 中国, CN1392260[P ].2003-01-22.

[42]L UO K , DUAN H , ZHAO D , et al. GM 2gene 2deletor :fused

loxP -FR T recognition sequences dramatic 2ally improve t he ef 2ficiency of FL P or CRE recombinase on transgene excision from pollen and seed of tobacco plant s [J ].Plant Biotechnology Journal5, 2007:263-227.

[43]MOR TON R , HOO YKA A S , P J J. Mol Breeding , 1995, 1:123[44]ALBER T H , DAL E C L E Site 2specific integra 2

tion of DNA into wild 2mutant lox sites placed in t he plant genome [J].Plant J , 1995, 7:649-659.

[45]V ER GUNST A C , J ANSEN L E , HOO YKAAS P J , Site 2spe 2

(责任编辑:翁志辉)