PMSG的生物学特性及在生命科学研究领域中的应用
第26卷 第4期2009年8月实验动物科学
LABORAT ORY ANI M A L SCIE NCE V ol. 26 N o. 4August 2009
综述・进展
PMSG 的生物学特性及在生命科学研究领域中的应用
张春礼
1,2
刘恩柱
1,2
(11天津实验动物中心, 天津 300381) (21天津市华孚高新生物技术公司, 天津 300381)
摘要:PMSG 也称为eCG 是从妊娠母马血清中分离纯化的促性腺激素, 具有LH 和FSH 两种活性。自1930年问世以来, 其提取工艺和产品纯度在不断地提高。由于P MSG 在动物体内的半衰期较长, 同一分子又具有FSH 和LH 的双重活性, 在动物繁殖生产中具有广泛的用途, 近年来在生命科学的研究领域中同样发挥了重要作用。关键词:P MSG; 生物学特性; 实验动物; 应用
中图分类号:Q95233 文献标识码:A 文章编号:1006-6179(2009) 0420047204
孕马血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum G onadotropin PMSG ) , 也称马绒毛膜促性腺激素(Equine Chorionic G onadotropin eCG ) , 母马子宫内膜杯状结构(Endometrial C ole 和Hart
[1]
d , PMSG 即可从母,70d 达到长2~1~3cm 为最大体积, 之后退化、坏死,
于1930[2]
而此结构被破坏时,PMSG 则消失。所以, 杯状结构决定了母马血液中促性腺激素的含量和效价水平。
糖蛋白组织化学染色揭示, 母马子宫内层的上皮细胞和杯状结构区的子宫腺上皮细胞是分泌PMSG 的基本细胞单位。
激素。
Sylvia , 是糖蛋白激素
, 同一分子中具有黄
体生成素(Luteinizing horm one LH ) 和促卵泡生成素(F ollicle Stimulating H orm one FSH ) 两种促性腺激素的
活性, 目前尚无法将两种激素分离。由于PMSG 在动物体内的半衰期较长, 同一分子又具有FSH 和LH 的双重活性, 因此PMSG 在动物繁殖领域具有广泛的用途, 近10年来在国内生命科学的研究中发挥了重要作用。
实际工作中发现, 一般中型马匹的胎儿在7~9cm , 其子宫孕角腔的索状结构明显突起,PMSG 效价处于高峰, 如胎儿超过13cm , 子宫孕角腔的索状结构一般不太明显,PMSG 的效价已处于低水平。
母马妊娠38~40d 时, 可以从血清中检测到PMSG, 尔后此激素的生物学效价急速上升, 经妊娠60d 时可达到每毫升血清中含50~100个大鼠单
1 PMSG 的来源及性质
111 PMSG 的来源
位, 在此期间, 杯状结构释放出粘稠物质, 粘附于粘膜表面, 这种粘稠物鲜组织中富含PMSG, 妊娠120d 迅速下降, 妊娠170d 降至测不出的水平, 见图1。
PMSG 是母马尿囊绒毛膜细胞分泌的胎儿产物, 因此激素浓度的高低决定于胎儿的基因型, 从表1可知, 以轻型马怀马驹, 驴怀骡时血清中的PMSG
孕马血清促性腺激素是由妊娠早期母马子宫内膜杯状结构(Endometrial Cups ) 所分泌的糖蛋白激素。Allen 等人证实母马子宫杯状结构主体面分泌PMSG 的双核细胞系来源于胚胎膜的特异滋养层细胞。滋胚层形成后和中胚层构成体壁层是绒毛膜的基础, 与尿囊构成尿囊绒毛膜侵入子宫内膜, 增扩形成索状结构, 并将子宫内膜上皮和胎膜粘在一起。
收稿日期:2009-03-04
[3]
效价最高, 马怀马次之, 再次为驴怀驴, 而马怀骡时最低。因此, 不仅可通过驴怀骡来制取PMSG, 还可以通过提高驴骡的受胎率来生产高效的PMSG 。
妊娠母马PMSG 的分泌量, 主要决定于子宫内
作者简介:张春礼:天津实验动物中心总工程师, 天津市华孚高新生物技术公司, 总经理, 高级兽医师从事动物生殖激素的研发和生产。
・48・
实验动物科学26卷
α、Chrktakosdm 和Om P. Bahl 报道, PMSG 、PMSG 2β的分子量分别为64030、PMSG 243720和16960。
表2 PMSG 、及其亚单位的糖含量(g Π100g)
糖岩藻糖
甘露糖半乳糖葡萄糖胺半乳糖胺唾液酸总和
PMSG [***********]11045
αPMSG 2
[***********]2312
βPMSG 2痕量
[***********]4818
β亚单位113 PMSG 2
图1 母马血清中PMSG 含量变化
表1 驴、马怀不同胎体时外周血中PMSG 效价均值
(单位:小白鼠单位Π每毫升血清,I U Πm L )
胎体
怀孕天数(d )
35
[1**********]0
[1**********]3
β亚单位Hiromu Sugino 等的研究表明,PMSG 2由149个氨基酸组成, 2。
SER ARG G LY LE U ARG PRO I LE AS N A LA U A LA G G I LE CY S I LE THR PHE
[4]
驴怀骡1617
马怀马0驴怀驴3617马怀骡
平均值[1**********]
, , 其PMSG 产
量亦高。的含量, 个体间差异很大, 最低的为10I U Πm L , 最高可达250I U Πm L , 总体水平约在50I U Πm L 。
一般认为, 母马PMSG 总产量随年龄和胎次增加而递减, 与母马的体格呈负相关。112 PMSG 的化学组成
PMSG 是糖蛋白, 分子核心部分由氨基酸组成。由单糖组成寡糖链再以非共价链结合在肽链上。完整的PMSG 分子由α及β亚基组成。PMSG 与垂体促性腺激素和HCG 都是糖蛋白, 都由两个肽链组成即两个亚基, 但其独特之处是含碳水化合物极高(41%~45%) 。PMSG 含中性糖(岩藻糖, 甘露糖和半乳糖) 达1310%, 氨基已糖(包括半乳糖和葡萄糖胺) 1716%, 和大量唾液酸(1018%~1211%) (表2) 。PMSG 是酸性蛋白, 等电点pH118, 与唾液酸含量有
β氨基酸序列图2 PMSG 2
114 PMSG 的生物学特性
PMSG 是一种糖蛋白, 具有FSH 和LH 双重活
性。在体内作用于卵巢和睾丸的靶细胞受体, 特异
性极强。
FSH 对于雌性动物作用于卵巢, 促进卵泡的发
育成熟排卵及黄体生成。对于雄性动物作用于睾丸的曲细精管, 促进精子的形成,FSH 还可刺激支持细胞的发育, 并促其产生一种能结合雄性激素的蛋白质(ABP ) , 通过这种蛋白质, 可使发育的各级生精细胞获得必需浓度的雄激素。
LH 促进雌性动物排卵, 对于雄性动物主要作用于睾丸的间质细胞, 促进其合成和分泌睾酮。
关。此酸位于糖链的末端, 当用唾液酸酶水解去掉唾液酸后,PMSG 在体内的半衰期大大缩短。
完整的PMSG 分子用尿素水解及交联葡聚糖层析可使其两个亚基分开, 二者在组成上存在很大差
β含糖及唾液酸甚高, 为5513%, 亦是异, PMSG 2
α的糖含量则与FSH 2α、PMSG 活性所在, 而PMSG 2
LH α2相似。PMSG 的分子量53000左右, Sylvia
2 PMSG 的分离与纯化方法
自1930年发现PMSG 以来, 国内外许多学者在
从事孕马血清促性腺激素的提取纯化研究中, 提出了很多提取方法, 以求得到纯度尽可能高的产品。
第4期张春礼等:P MSG 的生物学特性及在生命科学研究领域中的应用
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211 有机溶剂分级提取
C artland 等采集65d 的孕马血清后, 用丙酮或乙
[5]
醇分级沉淀提取, 通过调整适宜pH 值去除杂蛋白, 获得白色、干燥、易溶于水, 而且性能稳定粉状结构。212 偏磷酸、乙醇分级提取
20世纪60年代末,Dennis G ospodarowicz 等提出
促进卵泡的发育成熟排卵及黄体生成。对于雄性动
物, 主要作用于睾丸的曲细精管, 促进精子的形成。治疗弱精、死精和性欲不强。近20年来, PMSG 在国内动物生产中的同期发情、胚胎移植、双胎研究等领域已取得了丰硕成果。华孚公司的产品质量在国内享有盛誉。
2000年, 中国农业大学张忠诚教授主持, 香港屹昌公司投资的世界首例万枚肉羊胚胎移植工程的成功关键是PMSG 诱导排卵的质量, 胚移结果表明:用华孚公司生产的PMSG 共处理受体母羊12000只, 取得良好的催情效果, 移植妊娠率60%,
了采用偏磷酸先除去血清中部分杂蛋白, 然后采用乙醇分级沉淀。213 羟基磷灰石提取
[6]
William t M oore Jr 等采用羟基磷灰石层析、QAE 2Sephadex 和Sephadex 2G 200获得12000I U Πmg 的PMSG 。
214 国内纯化的基本方法
21411 粗提取:一般采用偏磷酸先除去部分杂蛋
白, 再用乙醇分级提取的方法或直接使用乙醇分级提取, 但收率较低。天津市华孚高新生物技术公司
[7]
在陈萸芳提纯方法的基础上, 采用高效、级提取等方法和严格的质量控制体系, 终处于国内领先地位。21412 层析纯化:, 但, 。如丁若愚[8]
等采用SE 2250、羟基磷灰石层析, 获得
[9]
9000I U Πmg 的PMSG 。杨银书等采用S peadexG 2100获得2500I U Πmg 的PMSG 。
与进口PMSG 效果相似。
石河子大学张居农教授主持羊的诱导发情课题, 根据课题组的要求, 的PMSG 。配套技术, 非92890%, 处理产后d 711817%~140%。效果。
河北农业大学桑润滋教授主持的黄牛双胎研究使用华孚产品同样取得满意的效果。
5 “华孚”PMSG 在生命科学研究中实验动
物上的应用
近年来, 随着生物工程研究的飞速发展,PMSG
3 PMSG 的质量控制
中国兽药典规定,PMSG 的生物学效价检定,
使用日龄21~23d , 体重40~55g 的雌性大鼠, 产品效价应达到标示量的67%~148%。但在实际使用中由于小鼠超排一般剂量为510~715I U , 所以按照现行标准重复性差。多年来, 天津市华孚高新生物技术公司的效价检定, 尽可能使用同一日龄, 体重在45~50g 的雌性大鼠, 产品效价要求达到标示量的95%~105%, 其产品使用的剂量有可靠的保证, 取得良好的结果, 因此在国内的生命科学研究领域得到广泛应用。
[10]
在生命科学的研究领域发挥了显著作用, 研究项目多为国家重点研究课题, 使用华孚公司生产的PMSG 均获得理想的胚胎或卵细胞。
511 PMSG 在实验动物生殖卵母细胞、胚胎、胚胎移植方面的应用
东北农业大学生命科学学院孙童等在细胞周期蛋白D3在兔妊娠早期子宫和胚胎中的表达与调节(自然科学基金项目) 中, 经药物处理后, 冲输卵管获得卵母细胞。另一部分与公兔交配, 适时从输卵管冲取12细胞、22细胞、42细胞、82细胞及桑椹胚, 从子宫冲取未扩展胚泡, 剖开子宫获取扩展胚泡及孵出胚泡。
[12]
中国农业科学院冯书堂等, 从事猪原生殖嵴细胞(PG Cs ) 建系因素的研究(国家自然科学基金委“97”重大项目资助, 国家高技术研究发展计划“863”计划资助) , 经处理的猪, 获取理想的胚胎和用于胚胎移植的同期发情猪。
[13]
上海交通大学覃波霖等, 在关于小鼠卵巢冷
[11]
4 华孚品牌PMSG 在动物生产上的应用
自Cartland 等将PMSG 制成易溶、稳定、干燥粉末, 并用于实验室和临床以来,PMSG 在动物繁殖领域一直广泛应用。对于雌性动物, 主要作用于卵巢,
・50・
实验动物科学26卷
冻移植后卵泡发育和卵母细胞成熟的研究(国家重点基础研究项目资助) 的研究中, 将1日龄小鼠的卵巢移植到成熟母鼠体内, 在移植19d 时用PMSG 刺激卵泡生长, 在移植后21d 时收获的卵母细胞, 可以在体外培养发育成熟至MII 期。
[14]
河北农业大学陈晓勇等诱导幼羔卵泡发育及体外胚胎生产(国家科技支撑计划) , 选择小尾寒羊。在最后一次注射FSH 同时注射PMSG 500I U , 采用手术活体采集卵母细胞。
512 PMSG 在实验动物转基因动物、转基因动物模型上的应用
[15]
中国医学科学院常洋等, 建立阿尔茨海默症的基因动物模型(国家科技部特别资助项目) , 经处理的供卵鼠与公鼠合笼, 次日晨取输卵管, 挑取受精卵。
[16]
中国农业科学院赵永贞等, 在RecA 蛋白介导的转基因小鼠的制备(国家“863”项目, 中国农业科学院一级杰出人才科研启动基金) 中, 选择雌性C57B1Π6小鼠, 处理后与C57B1Π6, 死鼠, 无菌分离输卵管, 。513 PMSG -PCR 技术克(国家重点基础研究发展规划项目) , , 分为A 、B 两组,B 组与公鼠合笼。次晨处死鼠, 分离输卵管, 从A 组获取MII 卵, 从B 组获取22细胞胚胎和42细胞胚胎。
[18]
中国农业大学潘登科等低氧培养早期克隆小型猪(Sus Scrofa ) (国家重点基础研究发展规划、国家高技术研究发展计划、北京市自然基金资助项目) , 经药物处理, 卵母细胞体外成熟, 母猪成功代孕。
514 PMSG 在实验动物基因表达上的应用
[19]
北京大学郁卫东等, 在关于人类21号染色体转录调节相关基因作为早期分子诊断标记物的可行性研究(国家973重大基础研究发展规划资助项目) 中,Balb Πc 小鼠药物处理后, 获取MII 卵母细胞和植入前不同阶段的胚胎。
[20]
哈尔滨大学郑慧丽等在血小板活化因子对大鼠黄体细胞孕酮分泌及血管内皮生长因子表达的作用的研究中, 未成年(25~28d ) 大鼠, 药物处理6d 后处死, 收集卵巢黄体细胞。
综上所述, PMSG 在生命科学领域发挥了重要作用, 同时表明华孚产品的质量达到较高水平, 可以替代进口产品。
致谢:本文经天津实验动物中心陈萸芳研究员审阅。
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