HBV感染者自然杀伤细胞活性分析

肝脏2011年8月第16卷第4期

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#论 著#

H BV 感染者自然杀伤细胞活性分析

李媛 王久君 高珊 刘娜 郝友华 丁红晖 杨东亮 赵西平

=摘要> 目的 探讨不同临床病期的慢性H BV 感染者外周血单个核细胞(PBM C) 中T 淋巴细胞亚群及N K 细胞活性变化。方法 收集慢性乙型肝炎、慢性重型乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、肝癌四组患者及健康人群的外周血, 应用流式细胞术检测CD 8+T 细胞、CD 4+T 细胞及NK 细胞的表达量和分泌细胞因子的能力, 并检测N K 细胞的杀伤活性。结果 各组患者CD 8+T 细胞计数与健康对照组比较均有所下降; 但CD 4+T 细胞计数较健康对照组均无显著变化; NK 细胞计数除慢性乙型肝炎组外均显著低于健康对照组(P 慢性乙型肝炎组>慢性重型肝炎组>肝硬化组>肝癌组) 。结论 慢性H BV 感染者NK 细胞功能降低, 且与病情进展有一定关联。

=关键词> 肝炎, 乙型, 慢性; 自然杀伤细胞; 细胞毒性, 细胞因子

Analysis of NK cell activity in patients with chronic hepatitis B virus infection L I Yuan, W A N G J iu -j un , GA O Shan, L I U N a, H A O You -hua , D I N G H ong -hui, Y A N G D ong -liang , ZH A O X i -p ing. Dep ar tment of I nf ectious D iseases , T ongj i H os p ital of T o ngj i M edical College, H uaz hong Univers ity of S cience and T echnology , Wuhan 430030, China

=Abstract > Objective T o investig ate the change of T -lymphocyte subsets and NK cell activity in PBM C in pat ient s wit h H BV infectio n of different clinica l stage. Methods Bloo d samples wer e co llected fro m t he patients w ith chro nic hepatitis B, chro nic sev ere hepatitis, liv er cirr ho sis, and liver cancer as w ell as healt hy persons. Flow cyt ometry assay was used to detect the ex pression of CD 8+T cells, CD 4+T cells, N K cell and the activ ities of cyt okine product ion and NK cell cytoto x icity. Results Compared w ith contr ols, the number of CD 8+T cells decreased in the patients, but the number of CD 4+T cells show ed no signif icant difference. Compared w ith contr ols, the number of N K cells of the patients decreased markedly (P chro nic hepatitis B >chr onic severe hepat itis >liver cirr hosis >liver cancer) . Conclusion T he activ ity of N K cells in patients w ith chro nic H BV infectio n decreased the det erio ration of liver disease.

=Key words > Chronic hepat itis B; N atural killer cells; Cyto tox icity ; Cyt okine

慢性乙型肝炎的发病机制至今尚未完全阐明, 目前认为宿主免疫功能紊乱是导致慢性肝损伤的主要原因。迄今有关适应性细胞免疫功能与H BV 感染的关系已经进行了深入研究, 宿主天然免疫功能与H BV 的关系越来越受重视。研究发现, 慢性乙型肝炎患者外周血自然杀伤细胞(NK ) 百分比明显低于对

基金项目:/十一五0传染病重大专项(2008ZX 10002-009,

照组, 提示慢性乙型肝炎患者NK 细胞活性降低[1-2]。本研究对慢性乙型肝炎、慢性重型乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、肝癌患者及健康人的外周血单个核细胞(PBM C) 中T 淋巴细胞亚群及NK 细胞活性进行检测, 并分析NK 细胞活性与H BV DNA 及A LT 水平的相关性, 旨在了解慢性H BV 感染的不同疾病阶段T 淋巴细胞亚群及NK 细胞活性的变化规律和临床意义。

资料与方法

一、研究对象

2008ZX 10002-014)

作者单位:430030 武汉华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科, 临床免疫研究室

通信作者:赵西平, E -mail:zhaoxipin @m edmail. com. cn

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学同济医学院附属同济医院感染科门诊和住院的乙型肝炎患者, 临床诊断参照2005年5慢性乙型肝炎防治指南6标准[3]。其中男89例, 女28例, 年龄15~67岁, 平均年龄(35. 83? 12. 67) 岁。入选患者H BsA g 阳性>6个月, 其中慢性乙型肝炎70例, 慢性重型乙型肝炎20例, 乙型肝炎肝硬化15例(代偿期10例, 失代偿期5例) , 原发性肝癌12例。入选患者H BV DNA 载量(5. 32? 2. 77) lo g 10拷贝/mL, ALT (214. 51? 389. 08) U/L 。健康对照组18例均为华中科技大学同济医学院身体健康人群。所有受检者排除H AV 、H CV 、H EV 、H IV 感染, 排除近3个月应用糖皮质激素等影响免疫功能的药物。入选患者和健康志愿者均签署知情同意书。

二、标本的处理

将肝素钠抗凝外周血分离出PBM C 备用。三、T 淋巴细胞亚群及N K 细胞的检测

取部分PBMC 分三管, 分别加入FIT C 标记的抗人CD 8抗体、CD 4抗体及CD 56抗体、Percp -cy 5. 5标记的抗人CD 3抗体, 以上流式抗体均购自Biolegend 公司, 避光孵育30min 后, 上流式细胞仪检测CD 8

++

+

+

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行非参数M ann -Whitney U 检验。H BV DNA 、ALT 与反映CD 8+T 细胞、CD 4+T 细胞及NK 细胞活性的指标之间的相关性采用Spearman 等级相关分析。

结 果

一、各组PBMC 中T 淋巴细胞亚群及NK 细胞百分率的比较(见表1)

各病例组CD 8+T 细胞百分率均低于健康对照组, 但差异无统计学意义; CD 4T 细胞百分率较健康对照组均无显著改变; NK 细胞百分率均低于健康对照组, 除慢性乙型肝炎组外差异均有统计学意义(P

表1 各组PBM C 中T 淋巴细胞亚群及NK 细胞百分率的比较

组别

慢性乙型肝炎组慢性重型肝炎组肝硬化组肝癌组健康对照组

例数7020151218

CD 8+(%)

CD 4+(%)

NK(%) 8. 51? 0. 814. 54? 0. 76*5. 70? 1. 27*4. 07? 0. 88*

***

+

25. 23? 0. 8341. 77? 1. 4123. 31? 1. 9448. 15? 2. 4919. 38? 2. 4948. 61? 3. 9722. 72? 1. 8744. 14? 3. 00

26. 96? 1. 5244. 10? 19. 6211. 56? 1. 77

*

注:与健康对照组相比, *

+

P

+

T 细胞、CD 4T 细胞及NK 细胞占PBMC 的百分率。

四、CD 8T 细胞、CD 4T 细胞及NK 细胞分泌细胞因子IFN -C 及T NF -A 检测

收集剩余PBM C, 置于24孔培养板, 加入激活剂PM A 及io nom ycin, 37e , 含5%CO 2温箱孵育1h 后, 加入阻断剂mo nensin, 再孵育4h 。反应结束后, 分别加入FITC 标记的抗人CD 8抗体、CD 4抗体、CD 56抗体及Percp -cy 5. 5标记的抗人CD 3抗体, 避光染色30min 后, 加入固定剂和穿膜剂, 再分别加入PE 标记的抗人IFN -C 抗体、TNF -A 抗体及同型对照, 上机检测。

五、NK 细胞杀伤活性

收获靶细胞(K 562细胞) , 用CFSE 标记后备用。在96孔板中将分离的PBMC 与上述靶细胞等体积混合, 调整效靶比依次为40B 1、20B 1、10B 1、5B 1、2. 5B 1, 设置不加效应细胞的靶细胞自然死亡对照孔, 在培养箱中孵育4h 后, 加入PI 染液, 上机检测。靶细胞死亡百分比按公式计算:细胞毒百分率(%) =(实验组靶细胞死亡率-自然靶细胞死亡率) /(1-自然靶细胞死亡率) @100。

六、统计学处理

0二、各组CD 8T 细胞、CD 4T 细胞及NK 细胞分泌细胞因子能力的比较(见图1)

各病例组CD 8+T 细胞分泌T NF -A 的能力低于健康对照组, 除肝癌组外差异均有统计学意义(P

图1 各组CD 8+T 细胞、CD 4+T 细胞及N K 细胞

分泌细胞因子能力的比较

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康对照组, 但差异无统计学意义。CD 8T 细胞计数减少, 说明乙型肝炎慢性化的进程与机体免疫功能紊乱有关, 慢性乙型肝炎患者普遍存在不同程度的细胞免疫功能低下, 其中代表细胞毒性T 细胞的CD 8+T 细胞低下使机体无法有效清除病毒, 是病程慢性迁延的主要原因[8]。本实验结果与此前的报道存在差异, 其原因尚需进一步研究。但是, CD 4+T 和CD 8+T 细胞数量的改变不能完全反映其功能上的变化, 而且PBM C 中CD 4+T 和CD 8+T 细胞数量并不能完全反映肝组织内的情况。因此, 尚需完善T 细胞功能方面的检测及肝组织活检来进一步分析细胞毒性T 细胞与乙型肝炎临床转归的关系。

本实验结果显示, 各病例组N K 细胞计数及其功能活性均低于健康对照组。临床不同病期H BV 感染者NK 细胞百分率下降, 与健康对照组比较除慢性乙型肝炎组外差异均有统计学差异。由于NK 细胞活

+

三、各组NK 细胞杀伤活性的比较(见图2) NK 细胞的杀伤活性随疾病进展程度有逐渐减低的趋势(健康对照组>慢性乙型肝炎组>慢性重型肝炎组>肝硬化组>肝癌组) , 且随着效靶比的升高, 杀伤效率随之增加。

四、NK 细胞的功能活性与H BV DNA 及ALT 水平的相关性

ALT 水平与NK 细胞百分率、NK 细胞分泌细胞因子IFN -C 、TNF -A 及N K 细胞毒百分率之间均存在负相关关系, NK 细胞分泌IFN -C 与NK 细胞分泌TNF -A 则存在正相关关系。而H BV DNA 与N K 细胞的功能活性没有相关性。

讨 论

H BV 主要通过引起宿主自身的免疫反应造成肝细胞损伤, 感染人体后是否发病、病情的轻重及转归都与宿主的应答有关, 且可能主要与细胞免疫反应有关[4]。

本实验结果显示, 与健康对照组相比, 各组患者CD 4T 细胞计数无显著差异, 表明CD 4

+

+

性下降, 导致机体干扰病毒复制和抗感染能力下降[9], H BV 在体内持续存在, 导致H BV 感染的慢性化, 因此NK 细胞的减少与乙型肝炎慢性化有密切关系。

目前检测细胞毒活性比较标准和常用的是Cr 释放实验, 但存在放射性污染, 以前常用的MT T 法和检测酶活性的方法敏感性较低, 又不能客观反映细胞毒活性。因此选择流式细胞技术CFSE/PI 染色法来检测N K 细胞对MH C -I 类抗原缺失的K 562细胞的杀伤活性, 此方法简单且稳定性强。实验结果显示, NK 细胞的杀伤活性随疾病进展程度有逐渐减低的趋势, 这提示H BV 感染患者NK 细胞的细胞毒作用下降, 杀伤病毒感染的靶细胞能力下降, 且与疾病进展程度有一定关系。

固有免疫细胞和适应性免疫细胞可分泌大量的细胞因子, 从而导致病毒清除或持续感染甚至肝脏损伤的不同结果。其中IFN -C 及TNF -A 是具有代表性的细胞因子, 在免疫调节反应中具有重要意义

[10]51

。

NK 细胞被触发的第一个反应是迅速分泌大量的细胞因子, 通过IFN -C 介导的非损伤机制, 在感染早期阶段清除病毒中发挥重要作用[11]。IFN -C 能够增强抗原递呈细胞与T 细胞的相互作用, 进而增强细胞毒T 细胞产生的能力。还能增强T 细胞和NK 细胞杀伤靶细胞的能力, 促进T 细胞增殖。本实验结果显示在, T 细胞对

慢性乙型肝炎不同临床病期所起的免疫作用无明显差别。国内也有研究报道, CD 3+、CD 4+细胞的百分率在慢性乙型肝炎组、H BV 携带组与正常对照组无显著差异[5]。与以往大多数文献中的报道不同[6-7], 我8+

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H BV 感染患者的N K 细胞功能受到损害, 清除病毒的能力减弱, 导致病毒长期存在。T NF -A 参与抗H BV 免疫, 也可直接杀伤已经感染H BV 的肝细胞, 吸引和激活免疫细胞, 损伤肝细胞。TNF -A 还可刺激脂肪细胞转化为肌纤维母细胞, 合成胶原, 并刺激成纤维细胞增殖, 参与肝纤维化过程[12]。本实验结果显示, NK 细胞及CD 8

+

Ch ines e H epatology, Aug. 2011, Vol. 16, No. 4

亚群及NK 细胞的特点及意义. 中华实验和临床感染病杂志, 2009, 3:13-19.

3 中华医学会肝病学分会、感染病学分会. 慢性乙型肝炎防治指南.

肝脏, 2005, 10:348-357.

4 殷缨, 张盈华, 张利朝. 乙肝病程发展中CD 4/CD 8、T NF -A 及s IL -2R 水平变化及意义. 免疫学杂志, 2002, 18:74-75.

5 吴晓枫, 秦浩歌, 辛晓丽, 等. 慢性乙型肝炎患者外周血T 淋巴细胞

亚群变化. 中国热带医学, 2008, 8:525-526, 531.

6 徐志强, 张鸿飞, 杨晓晋, 等. 小儿慢性乙型肝炎外周血T 细胞亚群

和临床病理关系的研究. 中华实验和临床病毒性杂志, 2004, 18:142-144.

7 刘映霞, 胡国龄, 何淑雅, 等. 慢性乙肝患者PBM C 中H BV 感染及

其对T 细胞亚群的影响. 中国现代医学杂志, 2002, 12:70-72. 8 张恒辉, 郭芳, 费然, 等. 慢性乙型肝炎患者CD 4+CD 25+调节性T

细胞免疫抑制功能的研究. 中华医学杂志, 2008, 88:511-515. 9 邓洪, 崇雨田, 韩晓燕, 等. 慢性乙型肝炎患者特异性细胞毒性T 淋

巴细胞的变化. 中华肝脏病杂志, 2006, 14:721-724.

10 Sch roder K, Hertzog PJ, Ravasi T, et al. In terferon -gam ma:an

overview of signals, m echanisms and fu nctions. J Leuk oc Biol, 2004, 75:163-189.

11 Carayan nop oulos L N, Y okoyam a W M . Recog nition of infected

cells by n atural killer cells. Curr Opin Immu nol, 2004, 16:26-33. 12 Jung M C, Pape GR. Imm unology of h epatitis B in fection. Lan cet

T 细胞分泌T NF -A 均下降, 这

提示免疫细胞分泌T NF -A 的功能受到损害, 可能会促进非特异性炎症反应, 引起肝损伤。N K 细胞是最主要的固有免疫抗病毒效应细胞群, H BV 感染患者NK 细胞的细胞因子分泌功能受损就可能使机体无法在早期清除病毒, 进而影响适应性免疫的建立, 造成H BV 感染的慢性化。

本研究发现, ALT 与NK 细胞功能活性存在负相关关系, 这说明机体NK 细胞水平的高低影响H BV 复制和肝功能损害的程度, 由于NK 细胞活性下降, H BV 复制活跃, 肝功能损害加重。而提高NK 细胞水平有望抑制H BV 复制, 从而改善肝功能和预后[13]。

参 考 文 献

1 李海英, 蒋雪梅, 陈士俊. 慢性乙型肝炎外周血自然杀伤细胞的变

化及其与H LA -C w 基因型的关系. 山东大学学报(医学版) , 2008, 46:697-700.

2 高海兵, 许利军, 潘晨, 等. 慢性乙型肝炎病毒感染者外周血T 细胞

In fect Dis, 2002, 2:43-50.

13 顾锡炳, 徐月琴, 王栋, 等. 慢性乙型肝炎患者NK 细胞水平与

HBV DNA 的关系. 免疫学杂志, 2009, 25:487-487.

(收稿日期:2011-04-27)

(本文编辑:钱燕)

5肝脏6刊期变更公告

为适应信息量剧增和满足广大读者需求, 经新闻出版局批准, 5肝脏6杂志(CN 31-1775/R) 将于2012年1月起刊期由双月刊变更为月刊。欢迎广大读者踊跃投稿。特此公告。

上海5肝脏6杂志社2011年7月4日