RNA转录后的加工与修饰
第二节 RNA 转录后的加工与修饰
不论原核或真核生物的rRNAs 都是以更为复杂的初级转录本形式被合成的,然后再加工成为成熟的RNA 分子。然而绝大多数原核生物转录和翻译是同时进行的,随着mRNA 开始的DNA 上合成,核蛋白体即附着在mRNA 上并以其为模板进行蛋白质的合成,因此原核细胞的mRNA 并无特殊的转录后加工过程,相反,真核生物转录和翻译在时间和空间上是分天的,刚转录出来的mRNA 是分子很大的前体,即核内不均一RNA 。hnRNA 分子中大约只有10%的部分转变成成熟的mRNA ,其余部分将在转录后的加工过程中被降解掉。
(一)mRNA 的加工修饰
原核生物中转录生成的mRNA 为多顺反子,即几个结构基因,利用共同的启动子和共同终止信号经转录生成一条mRNA ,所以此mRNA 分子编码几种不同的蛋白质。例如乳糖操纵子上的Z 、Y 及A 基因,转录生成的mRNA 可翻译生成三种酶,即半乳糖苷酶,透过酶和乙酰基转移酶。原核生物中没有核模,所以转录与翻译是连续进行的,往往转录还未完成,翻译已经开始了,因此原核生物中转录生成的mRNA 没有特殊的转录后加工修饰过程。
真核生物转录生成的mRNA 为单顺反子,即一个mRNA 分子只为一种蛋白质分子编码。 真核生物mRNA 的加工修饰,主要包括对5’端和3’端的修饰以及对中间部分进行剪接。
1.在5’端加帽
成熟的真核生物mRNA ,其结构的5’端都有一个m7G-PPNmN 结构,该结构被称为甲基鸟苷的帽子。如图17-9所示。鸟苷通过5’-5’焦磷酸键与初级转录物的5’端相连。当鸟苷上第7位碳原子被甲基化形成m7G-PPNmN 时,此时形成的帽子被称为“帽0”,如果附m7G-PPNmN 外,这个核糖的第“2”号碳上也甲基化,形成m7G-PPNm ,称为“帽1”,如果5’末端N1和N2中的两个核糖均甲基化,成为m7G-PPNmPNm2,称为“帽2”。从真核生物帽子结构形成的复杂可以看出,生物进化程度越高,其帽子结构越复杂。
图17-9 Post-transcriptional modification of mRNa showing the 7-methylguanosine cap and poly-A
tail.
真核生物mRNA 5’端帽子结构的重要性在于它是mRNa 做为翻译起始的必要的结构,对核糖体对mRNA 的识别提供了信号,这种帽子结构还可能增加mRNA 的稳定性,保护mRNa 免遭5’外切核酸酶的攻击。
2.在3’端加尾
大多数的真核mRNA 都有3’端的多聚尾巴(A) ,多聚(A) 尾巴大约为200bp 。
多聚(A) 屠巴不是由DNA 编码的,而是转录后在核内加上去的。受polyA 聚合酶催化,该酶能识别,mRNa 的游离3’-OH 端,并加上约200个A 残基。
近年来已知,在大多数真核基因的3’一端有一个AATAA 序列,这个序列是mRNa 3’-端加polyA 尾的信号。靠核酸酶在此信号下游10-15碱基外切断磷酸二酯键,在polyA 聚合酶催化下,在3’-OH 上逐一引入100-200个A 碱基。关于polyA 尾巴的功能问题尽管经过极其广泛的探索,但还不完全清楚。有人推测polyA 可能与mRNA 从细胞核转送到细胞质有关,但是相当数量,的没有polyA 屠巴的mRNA 如组蛋白mRNA ,也照样通过核膜进入细胞质。还有人认为这种结构对真核mRNA 的翻译效率具有某种作用,并能稳定mRNA 结构,保持一定的生物半衰期。
3.mRNA 前体(hnRNA )的拼接
原核生物的结构基因是连续编码序列,而真核生物基因往往是断裂基因,即编码一个蛋白质分子的核苷酸序列被多个插入片断所隔开,一个真核生物结构基因中内含子的数量,往往与这个基因的大小有关,例如胰岛素是一个很小的蛋白质,它结构基因只有两个内含子,而有些很大的蛋白质,它的结构基因中可以有几十个内含子。经过复杂的过程后,切去内元,将有编码意义的核苷酸片段(Extron 外元也叫外显子)连接起来(图17-10)。
图17-10 Primary polymerase 11transcript of a eukaryote gene showing (a)introns after capping
and addition of polyA tail.(b)Excision of introns to form the mature mRNA is called splicing.
真核生物的结构的基因中具有可表达活性的外显子,也含有无表达活性的内含子,但内含子序列下是无意义的,越来越多的实验证明有许多基因中的内含子参与基因表达调控,在转录时,外显子及内含子均转录到hnRNA 中。在细胞核中hnRNA 进行剪接作用,首先在核酸内切酶作用下剪切掉内含子;然后在连接酶作用下,将外显子各部分连接起来,而变为成熟的mRNA ,这就是剪接作用,也有少数基因的hnRNA 不需进行剪接作用,例如α-干扰素基因,图17-11以卵清蛋白基因为例,介绍一个典型的转录及加工过程。
图17-11 卵清蛋白基因转录及加工过程
图中外显示以1、2、3、4„„表示,内含子以A 、B 、C 、D „表示
mRNA 的拼接,需要在拼接部位有供拼接识别的保守性强的一致顺序,通过对100多种真核细胞基因的分析,发现外元和内元拼接部位部分碱基顺序有一定的规律(见表17-4)。
表17-4 含有内元的转录产物其拼接处的碱基顺序
表中划线的碱基对拼接识别有重要作用,如将兔的β-珠蛋白的拼接部位的GT 改为AT 后,拼接反应即受到影响。
mRNA 前体拼机制
图17-12 The RNA splicing mechanism.RNA splicing is catalyzed by a spliceosome formed from the assembly of U1,U2,U5,and sn RNPs(shown as green circles )plus other components (not shown).After assembly of the spliceosome ,the reaction occures in two speps:in step 1the branch-point A nucleotide in the intron sequence,which is located colse to the 3'splice site ,attacks the 5'splice site and cleaves it;the cut 5'end of the intron sequence thereby becomes covalently linked to this A nucleotide,forming the branched nucleotide shown in Figure 8-55.In step 2 the 3'-OH end of the first exon sequence,which was created in the first step,adds to the beginning of the second exon sequence,cleqving the RNA molecule at the 3'splice site;the two exon sequences are thereby joined to each other and the intron sequence is released ad a ribosone.These splicing reactions occur im the nucleus and gengerate mRNa molecules from primary RNA transcripts (mRNA precursor
molecules).
mRNA 拼接反应需要有核内小分子RNA 参与它们与蛋白质形成的复合物称为小核糖核蛋白颗粒,SnRNA 分别被命名为U1,U2,U3,U4,U5, 和U6RNA 。SnRNA 中的U2RNA 由与内元右端拼接部位附近的UACUAA 顺序高度互补,形成一个环状结构,由特定的酶来识别切除该环状结构,完成拼接过程,如图17-12所示。
图17-13 Mechanim of mRNa splicing.Note that,for clarity,the process is shown in two stages;energy is not required for the process since transesterification reactions are involved. 真核生物 mRNA前体在剪接过程中,还可以形成套索样的结构,在内含子序列中常有一个分支部位的腺苷酸残基,它的2’-OH 可以自动攻击内含子5’端与外显子1连接的磷酸二酯键,切开了外噗子1,而腺苷酸原来已有3’,5’--磷酸二酯键相连的两个相邻的核苷酸残基,加上此3’,5’-磷酸二酯键连接后,在腺苷酸处出现了一个套索,已被切下的外显子1的3’-OH 攻击内含子3’末端与外显子2之间的3’,5’-磷酸二酯键,键断裂后,内含子以套索的形式被节下来,此时外显子1和外显子2可以连接起来(图17-13)。
不论拼接过程如何,拼接必须极为精确,否则会导致遗传信息传递障碍,合成的蛋白质可能丧失其正常的功能。我国南方广大地区是β-地中海贫血的高发区,这是由于β-珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制所引起的一种血红蛋白病。实验表明β-珠蛋白基因元1中核苷酸的点突变改变了正常拼接部位的碱基顺序,结果造成错误部位的拼接。加工成熟的mRNA 虽能翻译,但产物不是正常的β-珠蛋白,结果引起血红蛋白级结构和功能的改变。
(二)rRNA 转录后加工
原核生物rRNA 转录后加工,包括以下几方面:①rRNA 前体被大肠杆菌RNase Ⅲ,RNaseE 等剪切成一定链长的rRNA 分子;②rRNA 在修饰酶催化下进行碱基修饰;③rRNA 与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基(见图17-14)
图17-14 大肠杆菌rRNA 前体的加工
真核生物rRNA 前体比原核生物大,哺乳动物的初级转录产物为45s ,低等真核生物的rRNA 前体为38s ,真核生物5sRNA 前体独立于其他三种rRNA 的基因转录(图17-15) 。
图17-15 真核生物rRNA 前体的加工
真核生物rRNA 前体中含有插入顺序,rRNA 前体要形成成熟的rRNA ,需要经过拼接反应。例如,四膜虫的rRNA 前体的拼接是一种无酶催化的自动拼接过程。四膜虫基因组内,26srRNA 编码的区域内有413bp 的插入顺序。该插放序列可以不消耗能量从rRNA 前体中被除掉。用SDS 煮沸和用蛋白酶外理等破坏酶活性办法,都不能破坏拼接活性,但反应中Mg2+和鸟嘌呤核苷酸是必在的。用32P-GTP 进行追踪实验表明,起始过程是GTP 在插入顺序5’端发生亲核反应,同时GMP 与5’端切点的切除段形成磷酸二酯键并使原RNA 断开。第二步是5’切点的外元3’-OH 与3’切点的外元5’-P 共价连接,获得成熟的rRNA ,被切除部分最后环化,形成一个环状结构,同时从5’端去掉一个15核苷酸啐片。剩余部分连接成399
核苷酸的环状
产物,再经过几步,最后切下一个19个核苷酸的线性内含子序列即L-19,它具有催化活性,上面的剪接作用,是由内含子本身的催化性质决定的(图17-16)。
图17-16 四膜虫rRNA 前体的自我剪接
这种rRNA 的自身剪接反应给人们一个提示:即RNA 分子也有酶的催化活性。这向酶的化学本质是蛋白质这一传统概念提出了挑战。这种有酶催化活性的RNA 分子命名为Ribozyme 。T.Cech 和S.Altman 各自分别发现RNA 具有催化作用,他们的发现对于了解生命进行过程有重要意义。很可能在原始生命中,RNA 所催化的断裂一连接反应是最早出现的催化过程。为此,他们共同获得了1989年Nobel 化学奖。
从大多数Ribozymw 的结构中发现一些特征,例如:锤头状结构的RNA 分子有13个保守的核苷酸序列,如果它们中的碱基改变会使这种催化活性失去作用。根据这种特片,科学家们在体外没计并人工合成这种RNA 分子,用于抗肿瘤及抗病毒的实验中(图17-17)。
图17-17 锤头结构模式图
(三)tRNA 转录后的加工修饰
原核生物和真核生物刚转录生成的tRNA 前体一般无生物活性,需要进行①剪切和拼接②碱基修饰③3’-OH 连接-ACC 结构(图17-18)。
图17-18 tRNA 前体的加工
①tRNA 前体在tRNA 剪切酶的作用下,切成一定在小的tRNA 分子。大肠杆菌RNase P 可特异剪切tRNA 前体的5’旁顺序,因此,该酶被称为tRNA5’成熟酶。除了RNaseP 外,tRNA 前体的剪切尚需要一个3’-核酸内切酶,这可将tRNA 前体3’端的一段核苷酸序列切下来。此外RNaseD 是tRNA3’端成熟酶。近年来的研究表明大肠杆菌RNaseP 是一种非常特殊的酶分子,它是由RNA 和蛋白质组成,最近发现RNAaseP 分子中的RNA 部分在某些条件下,可以单独地催化tRNA 前体的加工成熟,这个发现和四膜虫tRNA 能自我拼接被认为是近十年来生化领域内最令人鼓舞的发现之一。说明RNA 分子确具有酶的催化活性。经过剪切后的tRNA 分子还要在拼接酶作用下,将成熟tRNA 分子所需的片段拼起来。
②成熟的tRNA 分子中有许多的稀有碱基,因此tRNA 在甲基转移酶催化下,某些嘌呤生成甲基嘌呤如A →mA,G →mA 。有些尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶。尿嘧啶核苷转变不假尿嘧啶核苷。某些腺苷酸脱氨基为成为次黄嘌呤核苷酸(Ⅰ)
③3’末端加上CCA :在核苷酸转移酶作用下,3’--末端除去个别碱基后,换上tRNA 分子统一的CCA-OH 末端,完成tRNA 分子中的氨基酸臂结构。