单克隆抗体类药物的免疫原性分析_宋文娅_石远凯_韩晓红

C h in e s e J o u r n a l o f N e wD r u g s 2016, 25(21

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单克隆抗体类药物的免疫原性分析

宋文娅，石远凯，韩晓红

（国家癌症中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院，北京100021）

［摘要］随着精准医学时代的到来，单克隆抗体（简称单抗，monoclonal antibodies ，mAbs ），因其高度特异性及易于生产而成为生物类药物治疗的热点。目前其已在肿瘤、移植排斥、自身免疫性疾病和器官移植排斥等多个领域取得了显著的临床疗效，极大地提高了患者的生命质量。随着单抗类药物的种类增多及广泛的应用，与其相关免疫原性问题也逐渐浮出水面，引起人们的高度关注。本文就单抗的免疫原性及其分析与评价方法、改善措施及目前存在的问题进行论述，以期更好地指导单抗类药物的临床应用。

［关键词］单克隆抗体；免疫原性；抗体人源化；分析方法；安全性

［中图分类号］Ｒ979．1

［文献标志码］A

［文章编号］1003－3734（2016）21－2462－04

Immunogenicity analysis of monoclonal antibody drugs

SONG Wen-ya ，SHI Yuan-kai ，HAN Xiao-hong

（National Cancer Center /CancerHospital ，Chinese Academy of Medical Sciences

and Peking Union Medical College ，Beijing 100021，China ）

［Abstract ］Following the era of precision medicine ，monoclonal antibody （mAb ）drugs have been hot issues of biotherapeutic drugs ，because of its high specificity and simplicity of manufacture．Currently ，they have achieved significant clinical efficacy in the field of malignancies ，transplant rejection ，autoimmune and infectious diseases ，and greatly improved the quality of patients' life．As there are more varieties of mAb drugs and its extensive use ，the problems about immunogenicity of mAb drugs have gradually come up to the surface ，and raised highly concern．Here ，the detection and evaluation methods ，improvement measures and some issues of immunogenicity were described ，which could be a better guide in clinical applications．

［Key words ］monoclonal antibody ；immunogenicity ；humanized antibody ；detection method ；safety 目前，获得美国食品药品监督管理局（FDA ）批

［1］

准的抗体药物（如曲妥珠单抗、贝利单抗、利妥昔单抗等）已经广泛应用于肿瘤、自身免疫性疾病和器官移植排斥等领域，且已取得显著疗效。但治疗

性蛋白的免疫原性问题对生物治疗药物带来了巨大

挑战。我们如何在保证单抗类药物结构和功能特性的前提下，最大限度地降低其免疫原性，成为了临床迫切需要解决的问题。1

［基金项目］

国家重大新药创制科技重大专项资助项目

（2012ZX09303012）；国家高技术研究发展计划（863计划）资助项目（2011AA02A110）；北京市科委重大项目（D[**************]，D[**************]）

［作者简介］宋文娅，女，硕士研究生，主要从事抗肿瘤新药的临床药E-mail ：wenya1215@sina．com 。动学研究。联系电话：（010）87788701，

［女，博士生导师，教授，主要从事抗肿瘤新药临通讯作者］韩晓红，

E-床药动学和肿瘤分子标志物研究。联系电话：（010）87788701，mail ：hanxh@cicams．ac．cn 。

单抗类药物的临床安全性与有效性问题目前已经在临床使用的单抗类药物常见的不良

反应主要包括首次给药反应和免疫原性等。首次给

药反应往往是暂时性的，会随着后续给药而消失

［2－4］

。而单抗类药物的免疫原性，则是由患者机

体产生的抗药物抗体引起，从而对单抗类药物的有效性和安全性产生不同程度的影响。

一项关于西妥昔单抗的临床研究，入组1373例受试者中，严重输注反应（severe infusion reac-

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tions ，SIＲs）发生率为2% 5%，其中，约90%发生

在第一次输注且预防性使用抗组胺药后；且对其中的545例样本的回顾性研究发现，抗西妥昔单抗抗体检测阳性患者SIＲs发生率是阴性患者的62倍，

［5］

由此认为抗西妥昔单抗抗体与高风险SIＲs相关，

移植，即把鼠源单抗的CDＲ移植到人源单抗的骨架区。随着分子生物学技术的发展，抗体库技术、基因工程小鼠技术等的支持，全人源单抗越来越受到人

［11］

anti-们的重视。Hwang 等将抗-抗体反应（anti-body reaction ，AAＲ）按患者发生率分为可忽略（2%以下）、可耐受（2% 15%）和显著性（15%以上）3个级别。可忽略性AAＲ为理想的安全状态；可耐受性AAＲ表示即使被批准可用于恶性或危及生命的疾病，也仍具有潜在性风险；显著性AAＲ通常表示临床应用失败。显著性、可忽略和可耐受性AAＲ的7%和发生情况，在44种鼠源单抗中分别为84%，9%；15种嵌合抗体中为40%，27%和33%；22种人

36%和55%。以上数据表明，源化抗体分别为9%，

嵌合化技术极大程度地降低了治疗性抗体的免疫原

［12］

性，人源化抗体则进一步降低。然而，人源化和嵌合抗体中可耐受与可忽略比例几乎等同，意味着人源化抗体进一步降低免疫原性是有必要的，但是，全人源抗体是否会比人源化抗体免疫原性低，需要更多的临床试验验证。3．2

改善溶解特性蛋白聚合物的免疫原性明显

［13］

高于可溶性蛋白，蛋白质多聚体是由天然或变性单体组成的多体构成的高分子量蛋白质。研究发现，蛋白聚合物引起治疗性单抗免疫原性的原因有两点：一是暴露了新的抗原表位，二是形成高度重复序列。蛋白聚合物引发免疫原性的内在因素很多，包括分子数量、分子大小、溶解度、聚合物结构以及

［14］

它们之间的结合力。一般认为，形成多聚体的蛋白质比天然蛋白质更容易被免疫系统识别。

3．3蛋白质修饰蛋白质的天然修饰或人为修饰也会对单抗类药物的免疫原性产生影响。蛋白质结

［15］

构改变可以引起单抗类药物的免疫原性，如氨基酸改变或修饰、聚合物形式、药物剂型、糖基化成分等。N 端高甘露糖型糖基化在酵母菌、昆虫细胞和植物中很常见，却会在人体产生高度免疫原性反［16］

应。研究发现，一些接受西妥昔单抗治疗的患者会发生过敏反应，而在这些患者体内可检测到表达

［13］

有α-半乳糖苷酶糖基化位点的IgE 存在。蛋白质聚乙二醇（polyethylene glycol ，PEG ）化修饰，也可改变单抗类药物的免疫原性。PEG 化蛋白质和脂质体可通过提高蛋白溶解度，延长药物作

［17－18］

。用半衰期，减少用药频率来降低其免疫原性

但PEG 化是否会降低抗体活性仍有争议。更为合

表明免疫原性引起的抗药物抗体对药物的安全性与有效性有很大影响。蛋白类药物的抗体反应会导致药效降低，也可通过产生中和抗体使内源性蛋白失［6］活，中和抗体通过影响药物的体内暴露水平，进而可影响药物的安全性和有效性。2单克隆抗体的免疫原性

单抗根据人源化程度分为鼠源性单抗、嵌合型

［7］

单抗、人源化单抗和全人源单抗，其分类与免疫原性强弱表现出一定的相关性。

药物的免疫原性，通常是指其诱发抗药物抗体反应的能力。免疫原性的强弱是生物技术药物开发的决定因素之一，因此在评价药物安全性时，需同时考察其免疫原性。与单抗互补决定区（complemen-tarity determining region ，CDＲ）特异性结合的抗药物抗体，主要通过中和药物活性对药动学产生影响（即中和抗体）；抗药物抗体也可通过其他机制干扰药动/药效学（即非中和抗体），抗药物抗体如药物-免疫复合物形成空间位阻，妨碍有效成分的结合及药效的发挥

［8］

，从而影响药物的消除、血浆半衰期

和组织分布。

3免疫原性的改善措施

所有的外源性蛋白，包括用于治疗的蛋白质类

［9］

药物，都可能引起抗药物抗体的形成，进而影响药物的安全性与有效性，甚至引起不同程度的不良反应。那么，如何降低单抗的免疫原性，使其药效最大化，就成了研究者亟待解决的问题。

3．1抗体人源化以细胞融合为基础的鼠杂交瘤技术的诞生，使得人们能够大量获得鼠源抗体，在临床上有广泛应用，然而人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody ，HAMA ）反应的出现，限制了早期鼠

［10］

源单抗的有效性，为克服鼠源单抗在临床应用中的缺陷，人们利用重组DNA 技术对其进行了初步的人源化改造。

人-鼠嵌合抗体是最早出现的人源化抗体，利用

DNA 重组技术将鼠单抗的轻链、重链可变区的基因插入含有人抗体恒定区的表达载体。但嵌合抗体只是部分消除鼠源单抗的异源性，可变区的鼠源序列仍可诱导人体产生HAMA 反应；进而提出了CDＲ

理的蛋白质设计方法可用来选择PEG 修饰位点，使

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减少免疫原性和保持抗体活其在改善药效动力学，

［10］

性方面达到最好的平衡。3．4

改善效应分子功能从功能上来说，抗体可分为抗原结合片段（fragment of antigen binding ，Fab ）和可结晶片段（fragment crystallizable ，Fc ），由铰链区连接。抗体Fc 段可调节效应分子功能，包括抗体dependent 依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibody-cell-mediated cytotoxicity ，ADCC ）和补体依赖的细胞毒作用（complement dependent cytotoxicity ，CDC ）。

改善抗体结合亲和力，可相应减少有效用药剂量，提高治疗窗，降低剂量相关不良反应。改善抗体

［11］

亲和力的方法基本有2种：一是构建随意突变CDＲ或整个可变区结构域的较大容量库，然后从中选取高亲和力变异体；二是模拟体内亲和力成熟的显著突变或热点突变基因构建小容量库。通常二者组合，效果更好。

改善抗体功能，通常有2种作用机制：一是阻断配体-受体相互作用或引发细胞内信号通路，如凋亡，这种机制主要依赖于抗原结合功能；二是治疗性单抗在抗原结合后可募集免疫系统分子，如ADCC ，CDC ，这种机制需要抗原结合与效应功能联合作用

。抗体通过Fab 段识别特异性抗原，经Fc 段与多种细胞类型表面的Fc 受体结合，从而引发一系

［17］

［11］

肿瘤的作用。利用液相色谱飞行时间质谱方法定量

检测大鼠血浆中曲妥珠单抗药物浓度，以特征性肽·mL －1，段为靶标，检测定量下限可达0．5μg 检测范

·mL －1［20］，与ELISA 方法相比，可围为0．5 100μg

避免其基质效应影响；以特征性肽段为检测目标，一

定程度上避免了大分子成分的复杂性，分辨率更高；检测范围更宽，可减少稀释带来的操作误差；高精密仪器操作使检测的准确度更好，可重复性更强。

［21］

其他检测方法如表面等离子共振法、电化学发光法、放射免疫分析法等也可用于检测抗药物抗［22］体的免疫原性分析，相信随着定量分析技术的不断发展，将会有更多、更好的新技术可用于免疫原性

的分析检测，以便更深入地研究免疫原性与药动学、药效学之间的影响关系。4．2

免疫原性检测是生物技

术药物临床安全性评价的重要组成部分，药物引起的抗体反应会影响药动学、药效和/或毒性反应。抗

drug antibody ，ADA ）的产生，药物抗体（anti-影响因，既可以降低药物暴露量，也可以提高药

物暴露量；ADA 与治疗药物形成的免疫复合物，既素较多

可以通过中和药物生物活性，也可通过影响其清除

［19］

率等参数，来改变血液中药物浓度。在药物临床试验阶段，进行免疫原性检测已是公认的评价指标之一，以生物大分子检测指导原则为参考，免疫原性的检测方法及要求得到不断完善，但临界值（cut-point ）的判断尚无统一定论。Shankar 等［24］认为，在判定临界值时，需要适当的样本量进行分析，以保证统计结果的真实可靠，临床研究中通常需要50例以上的健康样本予以检测分析。另有研究认为，在免疫原性产生的中和抗体定量检测中，检测数据的分布规律对结果分析有着重要影响。如果健康样本检测结果符合正态分布，则可根据平均值（mean ）和标

point =准差（standard deviation ，SD ）计算，即cut-mean ʃ 2．33ˑ SD ；若为中和抗体确证实验，也可按

cut-point =mean ʃ 1．645ˑ SD 计算［25－26］。对于检测结果判定为阳性的样本，则需要进行免疫耗竭试验区分其为特异性或非特异性抗体结合，进一步验证ADA 的特异性，那么比较棘手的问题是如何依据抑制率来鉴别特异性抗体，有研究者采用50%抑制率

［26］

为界定标准，但不适用于所有试验，免疫原性的临界值因分布规律、计算公式等不同而判定各异，使不同药物间的接受标准无法统一。随着单抗类药物市场的逐渐扩大，相应的指导原则也在不断完善

［23］

免疫原性评价问题

列级联放大免疫反应

4目前存在的问题4．1

。

免疫原性评价及分析方法配体结合试验（ligand binding assays ，LBA ）是生物治疗药物最主要、最常用的生物分析方法，其中酶联免疫分析法是当前应用最广泛的免疫检测方法，该方法将抗原-抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物显色，以颜色变化判断试验结

果，操作简便，无放射性污染，故应用广泛，如酶联免

linked immunosorbent assay ，疫吸附试验（enzyme-ELISA ）的间接法、双抗体夹心法、竞争法等。

液相-质谱联用（liquid chromatograph mass spec-trometer ，LC-MS ）技术在小分子药物中的运用已经

非常广泛，逐渐扩展到大分子药物的应用领域。LC-MS /MS技术近来已用于定量检测多肽片段，可降低传统LBA 方法中特异性结合、亲和力及空间位阻等

［8，19］

，因素的干扰多种基于质谱的联合应用作为新兴技术被逐步推广，如飞行时间质谱技术。曲妥珠

2的人源化单抗，单抗是一种靶向Her-通过阻断Her-2信号转导通路来抑制细胞生长，从而达到抗

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，2016年4月，FDA 发布了新的治疗性蛋白

［27］

药物免疫原性检测的指导草案，免疫原性的评价中

内容、检测方法和指标解析也在一步步实际探索应用中细化，如检测方法的灵敏度和特异性考察、稳定性验证、临界值的统计学处理等。动物模型预测与临床试验之间的相关性也同样面临着挑战。5

结语

随着分子生物学技术的不断创新，提高单抗药物的人源化成分，甚至达到全人源抗体，改善其结合和效应分子功能，辅以蛋白修饰，从多角度避免引发免疫原性。同时，完善免疫原性检测方法，使其统一化、标准化，使临床试验有章可循，明确的指导原则可以规范药物的检测标准，确保其安全性的同时，有助于缩短药物的临床研究周期，加速向临床应用的转化，更好更快地使广大患者受益。在医学走入精准治疗的今天，治疗性单抗作为靶点导向，在人类疾病治疗中扮演着重要角色，保证单抗类药物的安全性与有效性，对临床治疗至关重要。

［参

考

文

献］

［26－27］

［11］

［12］

［13］

［14］

［15］

［16］

［17］

［18］

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编辑：杨青/接受日期：2016－05－19

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