脂质体转染的实验原理与操作步骤大全

脂质体转染的实验原理与操作步骤大全

细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。

脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy， Propyl]-n， n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。

用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。

细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。

一、脂质体(liposome)转染方法原理

脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。

中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电 的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。

二、脂质体转染操作步骤

1、操作步骤[方法一]：

(1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。

(2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。

(3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。

(4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。

(5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。

注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。

2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]：

(1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50~60%板底面积。

(2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：

①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。

②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。

③室温下放置5~10分钟，使DNA结合在脂质体上。

(3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3~5小时。

(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14~24小时，

(5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养24~48小时。

(6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。

3、稳定的脂质体转染方法如下：

(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。

(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。

(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培养48小时。

(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法进行。

三、个人经验：

1、转染前1天将0.5～2×105细胞接种于24孔培养板，并加入500ul不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达90～95%。

2、准备复合物

(1) 将0.8ug DNA稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。

(2) 将2ul Lipofectamine2000稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中，轻轻浑匀，室温孵育5分。注意：必须在25分内进行。

(3) 5分后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分。

3、吸去培养板的培养基，用PBS或无血清培养基(最好)清洗细胞2次。

4、将复合物(总体积100ul)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。

5、将细胞放入培养箱孵育4～6h后，可以更换含血清培养液去除复合物(也可不用)。 6、24～48h后可以观察转入基因表达情况。

7、稳定转染：换含血清培养基24h后将细胞以1：10(或更高比例)传代，1天后更换筛选培养基筛选。

8、优化：要保证细胞汇合率达90～95%(比较高);DNA/ Lipofectamine2000比率1：0.5～1：5，一般细胞1：2～3.

脂质体转染法的主要优点是可用将DNA转染至悬浮或者铁壁细胞培养、转染效率相对较高、对基因片段大小的限制较小等，但是

阳离子脂质体对细胞的毒性相对较高，为了防止其毒性，要摸索好如下实验条件：脂质体与质粒的比例、细胞转染时间等。