蛋白二维电泳技术在转化医学中的应用
蛋白二维电泳技术在转化医学中的应用
随着人类基因组全序列完整草图的完成, 宣告人类进入后基因组时代。基因组时代对DNA 序列信息及相关基因组的结构和功能进行了详尽的研究。然而, 基因组序列信息与生命活动的执行者-蛋白质之间并非一一对应关系。转录后加工、翻译调节及翻译后加工等使人体总蛋白质数目远远超过基因数目,因此蛋白质组(Proteome) 的概念应运而生。蛋白质组是指在特定的生理和病理条件下一个基因组、或一个细胞、组织表达的所有蛋白质。蛋白质组学(Proteomics) 即以蛋白质组为研究对象的研究领域,从蛋白质组的水平进一步认识生命活动的机理和疾病发生的分子机制。蛋白质组研究是对基因组研究的重要补充,它是对生物体在蛋白质水平定量、动态、整体性的研究。转化医学(Translational Medicine)是近年来生命科学领域备受关注的热点,其目标是以现代生物技术与临床医学相结合、研究开发新的疾病诊疗技术手段。由于蛋白质作为生命活动关键因子的核心作用,蛋白组学必然成为转化医学研究的重要方向。
双向电泳(two2dimensional electrophoresis,22DE) 是蛋白组学研究中的核心技术之一, 是目前常用的唯一能够一次性分离数千种蛋白质的实验方法,广泛应用于生物学研究的各个方面,如药物靶标的寻找、生物标志物的发现(疾病诊断的Marker )、发育调控关键因子的筛查等等。双向电泳原理简明: 首先等电聚焦( Isoelectric Focusing ,IEF) ,通过电荷分离蛋白质,将蛋白质沿pH 梯度分离至各自等电点;然后沿垂直的方向进行SDS -PAGE 凝胶电泳,通过分子量分离蛋白质。获得的蛋白二维图谱中的每个点代表样本中一个或数个蛋白质,而蛋白质的等电点、分子量和在样本中的含量也可显现出来。蛋白双向电泳的分辨率和灵敏度很高,一般可分离
1000~3000 个蛋白质,最高可分辨11000 个蛋白质,pI 差别小于0.003 个pH 单位也可以被分辨,是目前最好的蛋白分离方法之一。以双向电泳技术为核心,结合蛋白抽提纯化技术、蛋白预分离技术、双向电泳成像与图谱分析技术、蛋白点切取与质谱前纯化技术以及质谱技术构成了一条蛋白质学研究的完整技术路线。下面笔者将就这些技术及基因公司代理的相关技术平台做一个简单介绍。
细胞裂解破碎是蛋白样品制备的关键步骤,既要保证充分裂解细胞以使蛋白能够完全释放出来,又要避免处理过程中的某些因素,如高温,可能导致的蛋白修饰与降解,这对于技术方法的选择提出了很高的要求。美国Covaris 公司的自动声波聚焦(Adaptive Focused Acoustics )技术为双向电泳样品制备过程中的细胞裂解提供了很好的解决方案(图一)。自动声波聚焦技术通过等温、非接触的方式对样品进行声学匀浆和声学分解,无污染和交叉反应,不会产生过热现象而破坏生物样本的活性。该技术整合了非线性、高强度、汇聚性声学冲击波和高级计算机控制系统,可应用于组织匀浆、细胞裂解以及DNA 、RNA 和蛋白质等生物分子的提取。该技术平台具有标准化的Protocol ,可精确控制样本处理过程,重复性好,适用于多种容器,兼容96孔微孔板,实现高通量的样品处理。
为了提高双向电泳的分辨率,在进行IEF 之前,往往需要对蛋白样品进行预分离。将蛋白按照等电点的不同分成若干小的组分,然后将这些组分上样的窄pH 范围胶条上进行IEF 分离,这是提高分辨率,增加低丰度蛋白出现几率的有效手段。Agilent 公司的3100 OFFGEL等电聚焦分离仪为双向电泳样品预分离提供了有效手段(图二)。3100 OFFGEL等电聚焦分离仪可以最多处理16
个样品,将
图一,Covaris自动声波聚焦技术及相关平台
用于观察传统2D 凝胶和DIGE 凝胶的成像,能够以一种高性价比的方式替代激光扫描成像系统,且具有多种照明模块,同样胜任多重荧光Western Blot的检测和常规凝胶成像。该系统配有具有高量子效率和卓越的信噪比的16 bit冷CCD ,电动升降载物台以及专为DIGE 成像设计的边缘照明模块,可成像“三明治”胶,且无需低荧光背景的玻璃板。该系统具有极快的成像速度,可在5分钟内完成一块DIGE 凝胶的三通道成像,且成像速度不受凝胶大小的限制。双向电泳图谱分析同样是一项具有挑战性的工作,只有高性能的软件才能在大量样本和成千上万个蛋白点中找到细微差异。Syngene 公司的Dymension 系列双向电泳图谱分析软件能够进行蛋白质斑点的匹配、丰度的分析,寻找出不同样品中差异表达的蛋白质点,可分析传统的单色2D 图像,也可分析DIGE 的多重荧光标记图像。该软件操作流程简单,导入凝胶图像后,软件可自动进行斑点识别和匹配,分析速度快,结果导出方便。
经过图谱分析找到目标蛋白后,就需要考虑如何切取蛋白点,并进行质谱前纯化,以便为后续的质谱分析做好准备。随着实验规模的扩大和对结果可靠性要求的提高,高通量自动化系统被广泛的应用到这些实验步骤中。美国DigiLab 公司就针对上述应用推出了Digilab Propic Ⅱ2D 蛋白切胶工作站和Proprep Ⅱ蛋白酶解点样工作站。Propic Ⅱ全自动切胶系统承接所有上游1D 、2D 蛋白分离胶,进行目标蛋白质点的自动获取,系统功能多
图二,Agilent 3100 OFFGEL 等电聚焦分离仪
这些样品分离成12或24个窄的等电点范围组分。该技术具有很宽的上样量范围(50μg -5mg )和很好的分辨率(pH 0.1–0.6)。分离好的样品溶液不需进行额外处理,就可以用于IEF 或LC/MS分离。另外,该平台还可以进行传统的IEF 分离。
双向电泳技术的发展经历了近四十年的时间,为了增加检测分辨率,提高实验重复性,不断有新的技术和产品涌现出来。老牌蛋白电泳厂家Hoefer 也推出了双向电泳产品,IEF100和SE900(图三)。IEF100等电点聚焦仪可
图三,Hoefer IEF100和SE900双向电泳系统
样,切胶精确,自动化程度高。该系统配备了16 bit CCD的成像系统,能够整合市面上几乎全部的主流二维电泳分析软件,如Evolution / Melanie / Dimension / Delta 2D / PD Quest ,并且可实现与DIGE 胶无缝对接。该系统的切割精度达到10μm ,比同类产品提高10倍,是唯一一款可实现成像、分析和切胶全过程的系统。ProPrepII/ ProPrep-LC是Digilab 公司第三代高性能酶解点靶系统,用于对胶内或者溶液状态的蛋白进行酶解,并将其点样到MLTIL-MS 板或者LC-MS 上样系统上。ProPrepII/ ProPrep-LC用于对胶内或者溶液状态的蛋白进行酶解,并将其点样到MLTIL-MS 板或者LC-MS 上样系统上。该平台采用Flow Through专利技术保证无污染、快速:非接触式加样和排除废液,包埋式的温度控制系统,大大提高酶解效果。该系统制冷系统
保证试剂的活性。
以兼容所有7-24cm 长度的IPG 胶条,一次进行六个样品的分离。IEF100内部整合12000V 电源和半导体制冷系统,胶条槽与制冷板相连,从而保证分离过程的稳定,提高重复性。仪器具有图形化界面显示,实时监测电流,简单易用。SE900垂直电泳槽可以用于24cm 胶条的第二向分离,槽内配有循环泵,可以实现槽内缓冲液的循环,加上外接的冷却水浴循环系统,可以实现整个电泳过程中的温度均一性,保证结果可靠。
由于成像质量直接影响了后续图谱分析的结果,双向电泳成像技术对于检测灵敏度、分辨率以及成像速度都很高的要求。随着荧光差异双向电泳技术(DIGE )的应用,具有荧光成像功能的多功能成像系统逐渐成为了市场主流。针对上述应用需求,专业成像系统供应商Syngene 推出了Dyversity 系列多功能双向电泳成像系统。
Dyversity
图四,Dyversity成像系统与Dymension分析软件
图五,PropicⅡ2D蛋白切胶工作站