低浓度蛋白质含量测定方法的研究
78中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2003年第24卷第2期
受体无关。普萘洛尔是肾上腺素β受体的阻断剂,普萘洛尔对动物胃肠道运动功能的影响报道不一。
[326]
大多数学者认为普萘洛尔不影响胃肠道功能;但
[7]
也有人认为普萘洛尔能抑制小鼠胃排空,甚至还有人观察到普萘洛尔可增加大鼠的十二指肠锋电振幅,提示增强肠平滑肌的活动,初步分析认为可能是动物种属不同及剂量不同所致。本实验观察到普萘洛尔对小鼠小肠推进运动和ZPL的药效均无影响,表明其作用途径可能与肾上腺素β受体无关。组胺对平滑肌有强烈的致痉作用
[9][8]
促进肠动力制剂。参考文献:
[1] 王君,邹原,宫德正,等.干酪菌发酵产物对豚鼠离体回肠平滑
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[8] 秦晓民,徐敬东,邱小青.石菖蒲对大鼠胃肠肌电作用的实验研
。苯海拉明是组
胺H1受体的阻断剂,ZPL,ZP,表明ZPL可能是通过激动组胺H1它途径而起作用的。阿托品能竞争性与M受体结合,阻断乙酰胆碱对平滑肌的兴奋作用。我们用阿托品预处理动物以阻断乙酰胆碱的作用,结果ZPL能部分拮抗阿托品引起的小鼠小肠推进运动抑制,表明对整体动物的作用途径可能与胆碱能M受体有间接联系。
综上所述,实验所显示的ZPL对动物平滑肌的作用与其民间疗效是一致的,有望将其开发为新的
究[J].中国中药杂志,1998,23(2):1072109.
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低浓度蛋白质含量测定方法的研究
王爱军,王凤山,王友联,曹吉超,王 宠
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(1.山东大学药学院生化与生物技术药物研究所,山东济南250012;
2.吉林大学白求恩制药厂,吉林长春130021)
摘 要:目的建立一种操作简单、快速、灵敏度高、重现性较好的测定低浓度蛋白质含量的方法。方法研究
Folin2酚试剂法对低浓度蛋白质含量测定的可行性,并将其与考马斯亮蓝染色法在一定浓度范围(
行方法学比较。结果Folin2酚试剂法对牛血清白蛋白在5～50μgΠml浓度范围内测得吸收度值均较小(
关键词:蛋白质;含量测定
中图分类号:Q51;R392233;R977.6 文献标识码:A 文章编号:100521678(2003)0220078203
收稿日期:2002211211
作者简介:王爱军(19772),男,山东威海人,硕士,主要从事蛋白质、核酸类药物研究工作。
中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2003年第24卷第2期79
Studyonamethodfordetermingtheproteincontentoflowconcentrationsolution
WANGAi2jun,WANGFeng2shan,WANGYou2lian,CAOJi2chao,WANGChong
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(1.InstituteofBiochemicalandBiotechnologicalDrug,SchoolofPharmacy,ShandongUniversity,Jinan
250012,China;2.BethunePharmaceuticalFactoryofJilinUniversity,Changchun130021,China)Abstract:PurposeToestablishasimple,rapid,sensitiveandaccuratemethodtodeterminethecontentoflowconcentrationproteinsolution.MethodsThefeasibilityofFolinproteinmethodforlowconcentrationproteinwasinvestigatedandcomparedwith)method.ResultsTheabsorbenceofbovineserumalbumin)5to50μgΠmlinFolin2phenolproteinthereappearance,linearityandac2curacy.ThemuchhigherthanthatofCBBbindingmethodwhenBSAasConclusionFolin2phenolmethodcanbeusedtodeterminethecont2entoflow(
Keywords:protein;determination
目前测定蛋白质含量的常用方法主要有凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲法、Folin2酚试剂法(Lowry法)、考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlue,CBB)染色法
[1]
性条件下与酒石酸钾钠铜盐溶液起反应,生成紫红
色络合物,而后,磷钼酸、磷钨酸、硫酸与溴等在碱性条件下被蛋白质中的酪氨酸酚羟基还原呈蓝色,其色泽深浅与蛋白质含量成正比。
[1]
参照文献方法,取供试液1ml,加入Folin2酚甲试剂5ml,混匀,于20℃～25℃放置10min,再加入Folin2酚乙试剂0.5ml,迅速混匀,于30℃水浴30min,以水为空白,640nm波长处比色。以BSA为标
,也有用双辛可宁酸(Bicinchoninicacid,BCA)
[2]
法、银染法的报道。这些方法多数需要消耗的蛋
白质量较大,仅CBB染色法、银染法适用于低浓度蛋白质溶液含量的测定,前者测定范围是10～100
[3]
μgΠml,后者测定范围是0.15～20μgΠml。虽然银染法较CBB染色法更灵敏,但因其灵敏度过高,受外界因素影响过多。目前常用的低浓度蛋白质含量测定方法主要是CBB染色法。但我们在研究工作中发现该方法重现性差,用牛血清白蛋白(BSA)作为对照测定结果偏低。为此,本实验研究探索Folin2酚试剂法对低浓度蛋白质含量测定的可行性,并将该方法与CBB染色法在一定浓度范围(
准蛋白质,配制标准溶液。分别取标准蛋白质溶液
0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml,加水至1ml,制作标准曲线。2.1.1 选择测定微量蛋白质含量恰当的标准蛋白质溶液浓度 BSA经微量凯氏定氮法测定其蛋白质含量为95.4%,依其纯度精密配制成250、100、50、25μgΠml的标准蛋白质溶液,分别测其标准曲线及相关系数r。
当BSA浓度在50μgΠml以上时,其线性关系均很好,而当BSA为25μgΠml时,线性关系较差,故选择50μgΠml作为测定微量蛋白质标准蛋白溶液最佳浓度。2.1.2 标准曲线线性的重现性试验 以50μgΠmlBSA为标准蛋白,1周内制作5次标准曲线,结果见表1。可见,Folin2酚法在BSA浓度为5～50μgΠml浓度范围内,浓度与吸收度线性关系好,且重现性好。2.1.3 稳定性试验 精密称取LMW2TISE(含有小
[4]
分子量的多肽)50mg,加水溶解,并加水至100ml,摇匀,精密量取1ml,加水至10ml,作为待测液。将标准系列和待测液从30℃水浴取出后室温
考马斯亮蓝G2250,A.P.US32812;BSA,Sino2AmericanBiotec;低分子胸腺免疫抑制提取物(LMW2TISE,分子量为1kD～8kD),山东大学药学院生化与生物技术药物研究所与吉林大学白求恩制药厂共同研制;其余试剂均为国产分析纯。
UV2120型可见紫外分光光度计,日本岛津。2 方法与结果2.1 Folin2酚试剂法
Folin2酚试剂法的原理是蛋白质中的肽键在碱
80中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2003年第24卷第2期
表1 BSA浓度为50μgΠml时回归方程及r值
实验次数12345
AAAAA
回归方程=0.0317+0.096=0.0348+0.100=0.0327+0.098=0.0380+0.097=0.0323+0.102
r
胰蛋白酶溶液,结果见表2。表2表明,由Folin2酚法测定的含量均高于CBB染色法。
表2 两种方法对同一蛋白质溶液的测定结果方法
Folin2酚法CBB染色法
2C2C4C9C5C
0.99910.99970.99920.99970.9997
μLWM2TISE(gΠml)
11.750.35
μ胰蛋白酶(gΠml)
4.650.00
(20℃)放置,分别于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3h测
3 讨 论
定标准系列及待测液在640nm波长处的吸收度,标
准系列各浓度吸收度值RSD均小于3.2%,供试品
RSD为2.1%。可见该方法稳定性较好。
2.1.4 精密度试验 日内、0.%(n=5),日间99%n5)。2.1.5 回收率试验 取6份待测供试品各0.2ml,向其中3份分别加入50μgΠml标准蛋白0.2、0.4、0.8ml,均加水至1ml,混匀,分别测定其蛋白质浓
,,不易获得,,故探索测定低浓度蛋白质含量的方法有重要的意义。
本研究通过考察Folin2酚法在5～50μgΠml蛋白质溶液浓度范围内的效能指标,以探讨Folin2酚法测定低浓度蛋白质溶液含量的可行性。结果表明,在此范围内虽然用该方法测得吸收度值均较小(小于0.15),但示数稳定,且有较好的线性关系,精密度高,准确度好。
[1]
文献报道CBB染色法是定量测定低浓度蛋白质溶液的快速、灵敏的方法。在应用中,我们发现CBB染色法测定的吸收度值与蛋白质浓度的线性关系明显,但平行测定的相同浓度的吸收度变化较大,影响测定结果的准确性。由此可见,Folin2酚法适合于低浓度蛋白质溶液中蛋白质含量测定,且较CBB染色法好。
本实验证明,以BSA为对照蛋白,CBB染色法测定蛋白质浓度值较Folin2酚法所测得值低,该结果
[5]
与文献报道一致。产生这一结果的原因可能与两种方法测定蛋白质机理不同有关。参考文献:
[1] 李建武,萧能 ,余瑞元,等.生物化学实验原理和方法[M].
度,求出回收率,共重复试验5次。平均回收率为
99.5%,RSD为0.775%(n=5)。2.2 CBB染色法
CBBG2250存在红色与蓝色两种不同的颜色形
式。CBBG2250与蛋白质结合后,颜色由红色形式变成蓝色形式,最大吸收波长由465nm变成595nm,且在此波长处的吸收度与蛋白质浓度符合郎贝2比尔定律。通过测定595nm处吸收度的增加值可知与其结合的蛋白质量。
[1]
参照文献方法,分别取0.1mgΠmlBSA0、0.1、0.2、0.3、0.5ml(即该标准曲线测定范围为10～50μgΠml),加0.15molΠL氯化钠至1ml;取供试品液1ml,各管均加入CBB试剂5ml,摇匀,1h内以0号管
为空白对照,测定595nm波长处的吸收度。
制得的标准曲线为A=0.0002+0.5746C,r=0.9976,线性关系较Folin2酚法差,而且测定过程中可发现平行测定的相同浓度溶液的吸收度变化较大。我们反复进行了多次实验结果均如此,说明该方法在此范围内对蛋白质含量测定重现性较差。而对同一待测供试品液,CBB染色法与Folin2酚法测定结果也有较大差异。2.3 Folin2酚法与CBB染色法对低浓度蛋白质含量测定结果的比较
分别用两种方法测定同一浓度的LWM2TISE与
北京:北京大学出版社,1994.1602176.
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