不同分子量壳聚糖的抗菌性能研究

不同分子量壳聚糖的抗菌性能研究

郑连荚朱江峰孙昆山＼

浙江大学生物化工研究所杭州１，３１００２７

摘要：本文考察了不同分子量壳聚糖对大肠秆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌抑菌性能，初步找出了壳聚搪分子量和浓度对抗菌抑菌作用的影响，提出亍壳聚糖的抗菌机理・研究发现：分子量在３０万以下时，壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抗菌柞用随分子量减小而逐渐减弱：对大肠杆菌分子量越小，抗菌作用越明显。

关键词：壳聚糖、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、抗菌、分字量

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一、前言：

近些年来随着壳聚糖研究的进展，其抗菌性能引起了广泛的关注。壳聚糖具有广谱抗菌性，而且对人体无毒无副作用，深入研究有可能研制出一种新的抗茁药物。关于壳聚糖抗菌特性的各种影响因素研究论文很多，但是得出的结论并不一致。管云林等采用Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓ（金黄色葡萄球菌）作为试验菌株，发现随壳聚糖的分子量降低抗菌性能增强，并由此提出了壳聚糖抗菌的两步模型…。夏文水等采用Ｅ．ｃｏｉｌ（大肠杆菌）作为试验菌株，发现随分子量上升抑菌效果逐渐下降，而且通过试验测定分子量为１５００的壳低聚糖抑菌效果最强弘ｊ。ＫｅｉｓｕｋｅＵＥＮＯ等的论文报道对Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓ和Ｅ．ｃｏｌｉ，平均分子量小于５０００的壳聚糖不仅没有抗菌作用，反而能促进细菌的生长，而分子量约为９３００的壳聚糖几乎可以完全抑制细菌生长１３ｌ。Ｙｏｕｓｏｏｋ等报道分子量为４万的壳聚糖在浓度为Ｏ．５％时，对Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓ和Ｅ．ｃｏｉｌ的杀灭率为９０％：分子量为１８万的壳聚糖在浓度为５００ｐｐｍ时，对Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓ和Ｅ．ｃｏｉｌ的杀灭率几乎为１００％１４】。为了验证壳聚糖的抗菌性能，探诃

其抗菌作用的机理，我们认为有必要继续对壳聚糖的抗菌特性进行进一步的研究。

本论文选择革兰氏阳性菌Ｓｔ．ａｕｌ－ｅＬＬ￥和革兰氏阴性菌Ｅ．ｃｏｌｉ作为试验菌株，用自制的不同分子量的壳聚糖做了抗菌性试验，希望能找出壳聚糖分子量及浓度与抗茵性能之间的关系，并验证壳聚糖的抗菌作用机理，为壳聚糖的应用提供依据。

＝、材料、设备和方法

１．材料与试剂：

壳聚糖：粘均分子量分别为５０００以下、４．８５万、７．２５万、１２．９０万、１６．５７

万，脱乙酰度８８，７６％，酶降解法制备。

Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔ．ａＬｌｒｅＬｌ￥菌种：由浙江大学生物系提供。

肉汤蛋白胨固体培养基；液体蛋白胨培养基。

２．设备：

ＹＪ．８７５Ｓ医用净化工作台

ＹＸＱ．ＳＧ４１．２８０电热手提高压蒸汽消毒器

ＨＺＱ恒温振荡器

ＸＳ．２００型微生物显微镜

３０３．２电热培养箱

３．试验方法；

１．菌液的制备：将Ｅ．ｃｏｌｉ和Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓ菌种分别接种于７５ｍｌ蛋白胨液体培养基中，置于空气浴摇床中，在３７＂（２，１３０ｒｐｍ下培养１２小时，然后稀释，用显微镜计数法确定菌液浓度。测得Ｅ．ｃｏｌｉ菌浓为１．２×１０３个／ｍｌ，Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓ的菌浓为１．０５×１０５个／ｍｌ。

３．培养条件：准备肉汤蛋白胨平板，分别加入０．２５ｍｌ菌液和０．２５ｍｌ不同浓度、不同分子量的壳聚糖溶液，涂布均匀。空白为只加菌液而不加壳聚糖溶液。置于３７。Ｃ电热培养箱培养２０小时，取出观察各个平板上的细菌生长情况，计算抑菌率。

４．抑菌率的计算：

ｒｌ＝（Ｎ２－－ＮＩ）／Ｎｌｘ１００％

其中ＮＩ，Ｎ２分别是指空白平板和涂有壳聚糖的平板上的菌落数。

三结果与讨论

１．壳聚糖浓度对抗菌作用的影响：

不同浓度和不同分子量壳聚糖的抗菌效果如表一、表二所示。从表一和表二及图一、图二可以看出，随着壳聚糖浓度的增加，壳聚糖的抗菌效果逐渐增强，当壳聚糖的浓度达到１．Ｏ％时，对Ｅ．ｃｏｌｉ和Ｓｔ．ａｔｔｒｅｕ￥的抗菌率都达到了１００％。从表和图中还可以看出，壳聚糖对Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓ的抗菌作用更为显著，分子量在４．８５万以上时浓度为０．５％的壳聚糖即可显著抑制细菌生长。而对Ｅ．ｃｏｌｉ低浓度的壳聚糖溶液抗菌作用较弱。

２．壳聚糖的分子量对抗菌作用的影响：由表一和表二可以看出，对革兰氏阴性菌Ｅ．ｃｏｌｉ来说，随着分子量的减小，

抗菌作用逐渐增强，分子量小于５０００的样品在０．２５％的浓度下即可显著抑制细菌的生长。而对革兰氏阳性菌Ｓｔ．８．Ｕｌ＂ｅ１．Ｌ￥来讲，随着分子量的减小抗菌作用逐渐减弱，当分子量为３０．５万时，壳聚糖的浓度很低，琉菌作用也较明照。表１．壳聚糖对Ｅ．ｃｏｌｉ的抗菌能力试验表

１、、＼分子量Ｉ浓度（淤＜５０００４．８５万７．２４万１２．９万＼１６．６万３０．５万｛０．２５５０％３０％５％０Ｏ０

０．５６０％８０％】Ｏ％Ｓ％、４０％４０％

ｌ０．７５９０％９０％５０％９０％、８０％５０％

１．０１００％１００％】ＯＯ％１００％、１００％１００％

＼分子量浓度（泳＜５００ｎ喾７２如１茅ｊ６坫万３０５万

０．２５０Ｏ０４∞６９５％９９％

０．５Ｏ９５％９６％１００％１００％】００％

Ｏ．７５０９９％９９％９９％ｊ００％１００％

１．ＯＯ１００％１００％１００％１０ｄ％１００％

图～不同浓度壳聚糖（分子量为４．８５万）对Ｓｔ．ａｌｌｒｅｕｓ的抗菌作用

ｌ：空白；２：０．２５％；３：０．５％；４：０７５％：５：１．Ｏ％

ＦｉｇｌＴｈｅａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃｈｉｔｏｓａｎ（ＭＷ＝４８．５００）ｔｏＳｔ．ａｕｌ＇ｅｕ【ｓ

３．抗菌机理：由试验结果可以看出，对Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓ和Ｅ．ｃｏｌｉ两类细菌，分子量对抗菌作用的机理是不同。壳聚糖的抗菌作用主要有以下两种机理ｌ一种是壳聚糖通过吸附在细胞表面，形成一层高分子膜，阻止了营养物质向细胞内的运输，从而起到抑菌杀菌作用；另外一种机理是壳聚糖通过渗透进入细胞体内，吸附细胞

体内带有阴离子的细胞质，并发生絮凝作用，扰乱细胞正常的生理活动，从而杀灭细菌。因为两种细菌的细胞壁结构不同，两种作用对其影响程度也不同。对于ｓｔ．ａｕｒｅｕｓ，前～种作用机理起主导作用。而对于Ｅ．ｃｏｉｌ来讲，后一种作用机理起

图二不同浓度壳聚糖（分子量为４．８５万）对Ｅ．ｃｏｌｉ的抗菌作用

１：空白：２：０．２５％；３：Ｏ．５％：４：Ｏ．７５％；５：１．Ｏ％

Ｆｉｇ２ｔｈｅａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃｈｉｔｏｓａｎ（ＭＷ＝４８，５００）ｔｏＥ．ｃｏｌｉ

主导作用。蒋玉燕等通过电镜观察到细菌受壳聚糖作用后，革兰氏阳性菌Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓ细胞壁变薄及破损；革兰氏阴性菌Ｅ．ｃｏｌｉ细胞质浓缩，空隙明显扩大嘲。这也说明壳聚糖对革兰氏阳性菌和阴性菌的抗菌机理不同。

四、结论

１．在分子量３０．５万以下的范围内，随壳聚糖浓度的增加，其抗菌作用的效果增强，当浓度为１．Ｏ％时，对革兰氏阳性菌和对革兰氏阴性菌，其抗菌率均达到１００％：

２．对革兰氏阳性菌，随壳聚糖的分子量增大，抗菌作用逐渐增强，其原因主要是分子量越大，所形成的外层膜越致密，越能阻止营养物质进入细菌细胞，因而抗菌作用效果更明显。

３．对革兰氏阴性菌，随壳聚糖的分子量减小，抗菌作用逐渐增强，分子量为５０００以下，抗菌作用最强。其原因主要是分子量越小，越容易进入细胞壁的空隙结构内，干扰细胞的新陈代谢，以达到杀死细菌的。

参考文献

１．管云林等，中国甲壳资源研究开发应用学术研讨会论文集（下册）１９９７，３５—３６２．夏文水等，无锡轻工大学学报，１９９６，１５（４）：２９７・３０２

３．ＫｅｉｓｕｋｅＵＥＮＯｅｔａ１．Ａｄｖ．ｉｎＣｈｉｔｉｎＳｃｉ．１９９７。２：１０２

４．Ｙ．Ｓｈｉｎ，ｅｌａ１．Ａｄｖ．ｉｎＣｈｉｔｉｎＳｃｉ．，１９９７，２：８９０—８９６５．蒋玉燕等．中国甲壳资源研究开发应用学术研讨会论文集（下册）１９９７，２２－２５