石蜡组织切片
小鼠石蜡组织切片步骤
1. 取材(这步不知道)
2. 前处理
(1)将载玻片浸酸,过夜。
(2)取出泡好的载玻片,水洗20次,过蒸馏水,过酒精。
(3)放入60摄氏度烘箱内烘干,冷去后备用。
(4)没做。。。。。
3. 脱水: 70%酒精40min——80%酒精40min——95%酒精40min——95%酒精40min——100%酒精40min(此时可开始熔蜡)——100%酒精40min(40min只是一般情况,具体视组织大小含水情况而定,但一定要保证脱水干净)。
4. 透明:二甲苯(酒精:二甲苯 1:1)30min——二甲苯20min——二甲苯20min(20min也是一般情况,时间以组织透明为止,组织在二甲苯中不过过久)。
5. 浸蜡:石蜡I(石蜡:二甲苯 1:1)60min——软石蜡60min——硬石蜡60min(温度均为60度左右,冬天可只用软蜡,时间视组织大小可适当延长)。
6. 包埋:用包埋进行组织包埋,切记不可进水。包埋完毕后,待蜡块凝固后可放于冰水中,这样容易将蜡块和蜡模分开。
7. 切片:厚度5um左右,可用30%的酒精展片,用处理过的载玻片进行贴片否则易掉片(切片前将蜡块修整一下,放于4度的湿盒中,容易切片)。
8. 烤片:50度10-15min或是37度十几个小时。
9. 脱蜡(通风橱内进行):二甲苯3min——二甲苯3min——二甲苯3min——无水乙醇3min——无水乙醇3min——95%乙醇3min——95%乙醇3min——80%乙醇3min——75%乙醇3min——50%乙醇3min(根据各道溶剂是否新鲜做适当调整)——蒸馏水水洗3minX2次。
10. 免疫组化
(1) 修复抗原
将水化后的切片放入已加热5分钟(中高火)的柠檬酸缓冲液中,再次放入微波炉中加热5分钟(中低火),取出后,自然冷却至室温(大约需1小时)。
(2) 清除内源性过氧化酶。
PBS洗2~ 3次, 各5m in。加3% 过氧化氢溶液于玻片上, 室温静置20min(应避光)。 此步骤可以防止非特异性背景染色。
(3) 滴加血清
PBS洗2~ 3次,各5m in。滴加血清,室温静置15min。
(4) 加一抗。
血清无需清洗,加入稀释液配好的第一抗体,置于冰箱4摄氏度过夜。
(5) 加二抗。
取出切片,室温下放置半小时平衡。PBS洗3次, 每次5min。加入试剂盒中的第二抗体工作液1滴, 于室温下孵育1 h。
(6) 加SABC
PBS洗3次, 每次5min。每片加入SABC 试剂(链酶亲和素- 过氧化氢酶复合物) 1滴, 于室温下孵育1小时。
(7) 防非特异性背景。
PBS溶液洗3~ 4次, 每次5 m in。 这一步很重要, 有了这一步后, 染色效果明显好转。
(8) 阳性物显色。
加适量DAB显色应用液染色,加DAB后注意观察显色的程度,当显示逐渐出现淡黄色时, 将片子置于显微镜下观察显色情况。
(9) 复染
苏木精染液复染1~ 2m in, 盐酸酒精分化, 3~ 5 s;自来水冲洗返蓝(或1%氨水, 5~ 10 s)。
(10) 梯度乙醇脱水
依次浸入70% 、80% 及90% 乙醇、无水乙醇各5min。注意: 上述各步骤中, 注意从上一瓶到下一瓶时, 载玻片要沥干。
(11) 透明。
二甲苯( 一 )、二甲苯( 二 )透明各5min。
(12) 封片
擦去切片周围多余二甲苯, 切勿干涸, 迅速滴加1小滴中性树胶于样本中央, 再加盖玻片封固。注意: 不要有气泡。
(13) 观察—拍照
待玻片晾干后,进行观察,记录。