管式磁微粒化学发光免疫分析法测定玉米样品中的黄曲霉毒素B1

中国科学: 化学 2011年 第41卷 第7期: 1177 ~ 1183

《中国科学》杂志社

SCIENCE CHINA PRESS

SCIENTIA SINICA Chimica 论 文

www.scichina.com chem.scichina.com

管式磁微粒化学发光免疫分析法测定玉米 样品中的黄曲霉毒素B1

郑国金

①②

, 陈惠, 应希堂, 胡国茂, 林金明*

①

③

③

①

① 清华大学化学系, 北京 100084

② 楚雄医药高等专科学校化学教研室, 楚雄 675000 ③ 北京科美生物技术有限公司, 北京 100094 *通讯作者, Email: [email protected] 收稿日期: 2010-11-14; 接受日期: 2010-11-22 doi: 10.1360/032010-839

摘要 开发了一种管式磁微粒化学发光免疫分析法测定玉米样品中黄曲霉毒素B1的方法, 该方法使待测玉米样品中的黄曲霉毒素B1、辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体在均相体系中发生竞争性免疫反应, 再加入用抗FITC 抗体包被的磁微粒作分离剂, 抗原抗体复合物结合在磁微粒上, 在磁场中经分离、洗涤后加发光底物, 检测发光强度, 测定玉米样品中黄曲霉毒素B1的含量. 此方法标准曲线线性范围为0.05~5 ng/mL, 检测限为0.02 ng/mL, 批内相对标准偏差小于9%, 批间相对标准偏差小于15%, 具有良好的稳定性和重现性.

关键词

黄曲霉毒素B1

化学发光免疫分析 磁性微粒子 玉米样品

1 引言

黄曲霉毒素(Aflatoxins)是由黄曲霉、寄生曲霉产生的一类化学结构类似的代谢产物, 目前已分离鉴定出十余种毒素. 黄曲霉毒素B1常存在于玉米、花生、棉花籽和一些干果中, 是危险的致癌物, 世界各国对黄曲霉毒素B1在食品、农产品和饲料中的最高允许量作了规定, 因此, 快速、准确地检测食品、农产品和饲料中黄曲霉毒素B1的含量对于提升我国农业高技术的自主创新能力与国际竞争力, 保障国家食品、农产品质量安全, 提高人民生活质量, 实现农业可持续发展均有重要意义. 目前, 常用的检测黄曲霉毒素B1的方法有电化学分析法[1~4]、高效液相色谱法(HPLC)[5~8]、酶联免疫分析法(ELISA)[9~11]等. 本实验应用化学发光免疫分析法(CLIA)高灵敏度和高特异性的特点, 利用磁性微粒子的分离特性, 快速、准确地对玉米样品中黄曲霉毒素B1的含量进行了化学

发光免疫检测.

黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种半抗原小分子, 有免疫反应性, 实验中采用竞争法对玉米样品中的黄曲霉毒素B1进行分析, 使待测黄曲霉毒素B1、辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1(AFB1-BSA-HRP)在均相体系中与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体(FITC-AFB1单抗) 发生竞争性免疫反应, 再加入用抗FITC 抗体包被的磁微粒, 抗原抗体复合物结合在磁微粒上, 在磁场中经分离、洗涤后加发光底物, 用冷光分析仪检测发光强度, 测定玉米样品中黄曲霉毒素B1的含量(图1).

2 实验部分

2.1 试剂与仪器

Flash’n glow LB955 30管全自动进样冷光分析

郑国金等: 管式磁微粒化学发光免疫分析法测定玉米样品中的黄曲霉毒素B1

图1 磁微粒化学发光免疫分析法测定黄曲霉毒素B1的分析原理示意图

仪(Berthold公司); 高速离心机(Beckman公司), 转 速13000 r/min; 磁性分离器(北京科美生物技术有限公司定制, 磁场强度2800高斯); XW80旋涡混合器(上海精科实业有限公司); 试管12 × 60 mm(浙江拱东医用塑料厂); 磁性微粒子(磁性分离剂, Adaltis公司).

黄曲霉毒素B1标准品(Sigma公司A6636); 黄曲霉毒素B1单克隆抗体(Sigma公司A9555); 黄曲霉毒素B1-BSA 结合物(Sigma公司A6655); 抗FITC 抗体包被的磁性微粒子(5 mg/mL)、FITC 标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体、HRP 标记的黄曲霉毒素B1 (北京科美生物技术有限公司提供); PBST洗涤液(0.05 mol/L PBS, 含0.05% Tween-20), 分析缓冲 液(0.05 mol/L的PBS 缓冲溶液, pH 7.4, 含2.0%BSA、0.5 %的水解明胶、0.1%的Proclin-300); 发光底物液(鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液); 其他试剂均为AR 级; 实验用水为二次蒸馏水.

度为2.5 mg/mL的溶液A; 取溶液A 400 μL 加1300 μL 甲醇, 300 μL 水, 配成2 mL 0.5mg/mL的溶液B; 取溶液B 50 μL 加50%的甲醇水溶液2.45 mL, 配成2.5 mL 10 μg/mL的溶液C; 取溶液C 200 μL, 加0.18 mL 甲醇, 1.62 mL水, 配成2 mL 1 μg/mL的溶液D. 取溶液D, 用分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制100、10、5、1.5、0.5l 、0.15、0.05 ng/mL 的AFB1标准溶液, 4 ℃保存.

AFB1-BSA-HRP 溶液的配制: 取AFB1-BSA- HRP 溶液, 以分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000的AFB1-BSA-HRP 溶液, 4 ℃保存. FITC-AFB1单克隆抗体溶液的配制: 取FITC-AFB1单克隆抗体溶液, 以分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000的FITC-AFB1单克隆抗体溶液, 4 ℃保存.

2.3 数据处理

通过测量标准品和样品溶液的发光强度(RLU), 使用Flash’n glow LB955发光分析仪自带软件中的数据处理程序对测得的数据进行处理. 线性方程采用的是logit(Y )-log(X ) 的线性回归数学模型, 以logit Y 为纵坐标, logX 为横坐标, 其线性方程表达式为

2.2 AFB1标准溶液、AFB1-BSA-HRP 溶液、FITC- AFB1单克隆抗体溶液的配制

AFB1标准溶液的配制: 取黄曲霉毒素B 1标准品 5 mg (瓶装规格为5 mg), 加甲醇2 mL溶解, 配成浓

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logit(Y ) = a + b log(X ), 线性方程中 X 为标准品(或待

测样品) 溶液的浓度, log it (Y ) =ln(

y

1−y

, y =B B , 0式中, B 为标准品(或待测样品) 溶液的发光强度, B 0为

不加标准品(或待测样品) 而加分析缓冲液的发光强度. 根据标准品的浓度和发光强度值, 经线性回归得标准曲线, 代入样品的发光强度值得样品的浓度.

2.4 玉米样品的采集和处理

从市场随机购买11份玉米样品, 处理方法是: 粉碎玉米成玉米粉, 过20目筛后, 分别称取2 g置于10 mL具塞玻璃瓶中, 加20%的乙醇溶液4 mL, 盖塞后, 旋涡混合1 min, 150 r/min振荡30 min, 再旋涡混合1 min, 转入离心管中, 4000 r/min离心15 min, 取上层清液, 4 ℃保存备用. 使用时与分析缓冲液等体积混和.

2.5 玉米样品中AFB1含量的分析过程

玉米样品中AFB1含量的分析过程如图2所示. (1)取试管17支, 编号为S0、S1~S5, 样品1~11, 每

图2 磁微粒化学发光免疫分析法测定黄曲霉毒素B1的分析过程示意图

中国科学: 化学 2011年 第41卷 第7期

管中加入AFB1-BSA-HRP 溶液 50 μL; S0管中加分析缓冲液50 μL, S1~S5管中加0.05、0.15、0.5、1.5和5 ng/mL的AFB1标准溶液50 μL, 样品1~11管中加1号至11号样品提取液50 μL, 混匀后于每支试管中加入FITC-AFB1单克隆抗体溶液50 μL, 37 ℃水浴加热60 min. (2)在每支试管中加入抗FITC 包被的磁微粒(5 mg/mL)50 μL , 37 ℃水浴加热10 min. (3)试管置于磁性分离器上, 磁微粒沉于试管底部, 倾去溶液, 试管脱离磁分离器, 振摇试管, 每管中加入600 μL PBST洗涤液, 试管再次置于磁性分离器上, 磁微粒沉于试管底部, 倾去溶液, 如此洗涤5次, 每次需将试管静置在磁分离器上3 min, 使磁微粒沉降完全. (4)在每支试管中加入300 μL 发光底物(发光底物A 为鲁米诺和对碘苯酚溶液, B为过氧化氢溶液, 用时需等体积混合), 37 ℃水浴加热10 min. (5)擦干试管外壁的水, 置于冷光分析仪中, 测定发光强度(RLU), 经线性拟合, 进行定量分析(包括灵敏度、线性范围和检出限等).

3 结果与讨论

3.1 FITC-AFB1单克隆抗体稀释浓度的优化 按图2的分析过程和条件, AFB1-BSA-HRP 的稀释度为1:2000, FITC-AFB1单克隆抗体稀释浓度分别为1:1000、1:2000、1:5000、1:10000和1:12000时测定B0、B1和B5的数值, B0为加入分析缓冲液时的发光强度(RLU), B1和B5分别为加入0.05、5 ng/mL AFB1标准溶液时的发光强度(RLU), 实验结果见表1, 从B /B 0的比值看, 反映了在标准品抗原存在下, 酶标抗原与抗体的结合率, 由于本实验采用的是竞争法, 酶标抗原与标准品抗原竞争抗体, 标准品抗原浓度越大, 结合到抗体上的酶标抗原越少, 发光强度越小, B /B 0值越小, 反之则越大. 为确保标准曲线上每个浓度点的结合率之间有足够的落差. 保证检测的灵敏度和准确度, 从结果分析, 选择1:12000的FITC-AFB1单克隆抗体和1:2000的AFB1-BSA- HRP 较为合适.

3.2 磁微粒加入量的优化

按图2的分析过程, 加入分析缓冲液、1:2000的AFB1-BSA-HRP 和1:12000的FITC-AFB1单克隆抗体, 使之发生免疫反应, 在其他条件不变时, 加

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郑国金等: 管式磁微粒化学发光免疫分析法测定玉米样品中的黄曲霉毒素B1

表1 FITC-AFB1单克隆抗体稀释浓度的优化

FITC-AFB1单克隆抗体

AFB1-BSA-HRP

1:1000 1:2000

1:2000 1:2000 1:5000 1:2000 1:10000 1:2000 1:12000 1:2000

入抗FITC 抗体包被的磁微粒(5 mg/mL)的体积10~ 150 μL, 加入量与发光强度(RLU)的关系见图3所示, AFB1测定实验中加入量为50 μL.

3.3 温育时间的优化

按图2的分析过程, 加入分析缓冲液、1:2000的AFB1-BSA-HRP 和1:12000的FITC-AFB1单克隆抗体溶液, 使之在37 ℃的均相体系中发生免疫反应, 在其他条件不变时, 温育时间0~100 min, 对发光强度的影响情况见图4所示, 0~60 min时间段内, 发光

图3 磁微粒的量对发光强度的影响

图4 FITC-AFB1单克隆抗体和AFB1-BSA-HRP 温育反应时间与发光强度的关系 1180

发光强度(RLU) B

B /B 0值

0 B 1 B 5 B 1/B 0 B 5/B 0 980635 956009 505102 0.97 0.51 432773 415898 133124 0.96 0.31 351468 329693 96108 0.94 0.27 227332 202478 52911 0.89 0.22 175519 152232 27086 0.87 0.15

强度随时间的增加而增大; 60 min后, 变化不大. AFB1测定实验中温育时间选择为60 min.

1:12000的FITC-AFB1单克隆抗体50 μL 和1:2000的AFB1-BSA-HRP 50 μL 在37 ℃均相体系中温育60 min后, 加入50 μL 的抗FITC 抗体包被的磁微粒(5 mg/mL), 37 ℃温育时间0~60 min, 对发光强度的影响情况见图5所示, 发现10~30 min内体系发光强度变化不大, 计数值能够满足发光实验要求, 为节约时间实验中选择温育时间为10 min.

按图2的分析过程, 辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体在均相体系中反生免疫反应, 再加入抗FITC 抗体包被的磁微粒作分离剂, 温育反应 后抗原抗体复合物结合在磁微粒上, 在磁场中经分离、洗涤, 加入发光底物, 37 ℃温育时间0~30 min, 对发光强度(RLU)的影响情况见图6所示, 10~15 min期间达到最大值, AFB1测定实验中温育时间选择为10 min.

3.4 影响发光强度(RLU)和测定结果的其他因素

免疫反应、化学发光反应的温度对发光强度(RLU)有影响, 37 ℃温育能缩短反应达平衡的时间.

图5 加抗FITC 包被的磁微粒后温育反应时间与发光强度的关系

中国科学: 化学 2011年 第41卷 第7期

3.6 检测限

在最佳反应条件下, AFB1标准品浓度为0 ng/mL时, 平行测定10管的发光强度(RLU), 发光强度(RLU)值分别为: 140511、143734、141831、142024、142262、140913、144663、140592、142873、141831; 计算平均值为: 142123; 标准偏差(SD)为: 1342, 发光平均值减去两倍标准偏差后的值为: 139439; 代入线性回归方程: logit(Y ) = 0.2061−2.1655log(X ), 所得浓度即为方法的检测限, 该方法的检测限为 0.02 ng/mL.

图6 加入发光底物后温育反应时间与发光强度的关系

3.7 回收率

在待测定的玉米粉样品1和玉米粉样品2中加入已知量的AFB1, 经20%的乙醇提取后, 按图2的分析过程, 测定提取液中AFB1的含量, 并与已知量相比较, 其结果用样品加标回收率表示. 反映了该分析方法的可靠性, 分析方法和结果见表2所示, 样品加标回收率范围为94.7%~109%.

洗涤磁微粒时, 洗涤次数, 洗涤剂用量和磁微粒沉降时间, 对测定精密度有影响, 洗涤5次, 洗涤剂用量600 μL, 磁微粒沉降时间3 min, 测定的精密度好.

3.5 标准曲线

在最佳反应条件下, AFB1标准品浓度分别为0、0.05、0.15、0.5、1.5、5 ng/mL, 以logit Y 对log X 作图, 得线性回归方程: logit(Y ) = 0.2061−2.1655log(X ), 线性相关系数r = −0.9955, 线性范围为: 0.05~5 ng/mL, 可用于准确定量分析. 数据处理原理见2.3. 标准曲线如图7所示.

3.8 精密度

按2.4的方法提取1号、2号和3号玉米样品中的AFB1, 提取液用分析缓冲液等体积稀释后进行分析, 每次每个样品做10管平行, 连续测定2次, 分别计算批内变异和批间变异. 批内相对标准偏差小于9%, 批间相对标准偏差小于15%. 如表3所示.

3.9 稀释实验

按2.4节的方法提取1号玉米样品, 提取液与分析缓冲液等体积混后, 再用分析缓冲液倍比稀释, 得到稀释度分别为1、1/2、1/4和1/8的样品, 按图2的分析过程测定AFB1含量, 以稀释度作为X 轴, 样品中

图7 标准曲线 表2 样品加标回收率

编号 样1A 样1B 样1C 样2A 样2B 样2C 样品质量(g) 1 1 1 1 1 1

100 ng/mL AFB1标液(μL) 12 60 120 12 60 120

加标量(ng) 1.2 6 12 1.2 6 12 加标后样品的处理 40℃风干2 h, 混匀, 加提取剂20%的乙醇2 mL

盖塞后, 旋涡混合1 min, 150 r/min振荡30 min, 再旋涡混合1 min, 转入试管中4000 r/min

提取方法

离心15 min,

提取样品的处理 取上层清液, 加等体积的分析缓冲液 加标浓度(ng/mL) 0.3 1.5 3 0.3 1.5 3 加标后测得值(ng/mL) 1.35 2.45 4.04 0.95 2.15 3.90 未加标测得值(ng/mL) 1.03 1.03 1.03 0.64 0.64 0.64

差值(ng/mL) 0.32 1.42 3.01 0.31 1.51 3.26 样品加标回收率 107 94.7 100 103 101 109

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郑国金等: 管式磁微粒化学发光免疫分析法测定玉米样品中的黄曲霉毒素B1

表3 化学发光检测AFB1的精密度

批间 批内

1 2 3 1 2 3

平行管数 10 10 10 10 10 10 20 20 20

测得AFB1浓度(ng/mL) 1.14 0.95 0.68 0.64 0.74 0.53 1.04 0.66 0.63 相对标准偏差RSD(%) 7% 9% 8% 8% 8% 7% 13% 2% 15%

样品

AFB1含量测值为Y 轴作图, 得关系曲线见图8所示. 表4 玉米样品中AFB1的测定结果

所得曲线的拟合直线方程 Y = 1.4602X −0.0570, 样品编号 C (ng/mL) a b f X(ng /g)

1 1.02 2.00 2.00 0.39 10.46 线形相关系数 r = 0.9993. 分析缓冲液对样品分析无

2 0.62 2.00 2.00 0.39 6.36

干扰.

3.10 玉米样品中AFB1的测定结果

从市场随机购买的11份玉米样品, 按2.4节的方法提取处理, 按2.5节的分析过程进行测定, 样品中AFB1的计算方法为:

X =

f 式中: X —玉米样品中AFB1的含量, ng/g;

C —待测溶液中AFB1的浓度, ng/mL;

a —每克玉米样品中加入提取剂的体积, mL/g b —每毫升提取液与加入的PBS-BSA 缓冲液的体积之和, mL/mL;

f —提取剂的提取率; 测定结果见表4所示.

3 0.52 2.00 2.00 0.39 5.33 4 0.41 2.00 2.00 0.39 4.21 5 0.85 2.00 2.00 0.39 8.72 6 0.36 2.00 2.00 0.39 3.69 7 0.63 2.00 2.00 0.39 6.46 8 0.25 2.00 2.00 0.39 2.56 9 0.47 2.00 2.00 0.39 4.82 10 0.05 2.00 2.00 0.39 0.51 11 0.32 2.00 2.00 0.39 3.28

定玉米样品中黄曲霉毒素B1的方法. 最佳反应条件为: 50 μL 的AFB1标准品(或待测样品) 溶液与50 μL 稀释度为1:2000的辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1混合, 加入50 μL 稀释度为1:12000的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体, 在37 ℃的均相体系中发生竞争性免疫反应60 min, 再加入50 μL 抗FITC 抗体包被的磁微粒(5 mg/mL), 37 ℃温育反应10 min, 抗原抗体复合物结合在磁微粒上, 在磁场中分离磁微粒, 加入600 μL PBST洗涤液, 洗涤5次, 洗涤后加发光底物300 μL, 37 ℃温育反应10 min, 检测发光强度. 根据标准品溶液的发光强度, 作出标准曲线, 根据待测溶液的发光强度, 确定待测溶液中黄曲霉毒素B1的含量. 实验结果表明, 此方法: 标准曲线线性范围为0.05~5 ng/mL, 检出限为0.02 ng/mL, 具有很高的灵敏度, 批内相对标准偏差小于9%, 批间相对标准偏差小于15%, 具有良好的稳定性和重现性.

4 结论

开发了一种管式磁微粒化学发光免疫分析法测

图8 稀释度与样品浓度的关系

致谢 本工作得到国家高技术研究发展计划(863计划) (SQ2010AA0220249001)资助, 特此致谢.

参考文献

1 Tan Y, Chu X, Shen GL, Yu RQ. A signal-amplified electrochemical immunosensor for aflatoxin B1 determination in rice. Anal Biochem,

2009, 387: 82–86

1182

中国科学: 化学 2011年 第41卷 第7期

2 HajianR, Ensafi AA. Determination of aflatoxins B1 and B2 by adsorptive cathodic stripping voltammetry in groundnut. Food Chem, 2009,

115: 1034–1037

3 Nagwa HS. Ammida LM, Palleschi G. Electrochemical immunosensor for determination of aflatoxin B1 in barley. Anal Chim Acta, 2004,

520: 159–164

4 Piermarini S, Micheli L, Ammida NHS, Palleschi G, Moscone D. Electrochemical immunosensor array using a 96-well screen-printed

microplate for aflatoxin B1 detection. Biosen Bioelec, 2007, 22: 1434–1440

5 Wejdan SK, Bahruddin S, Chew BY, Nor HH. Determination of aflatoxins in animal feeds by HPLC with multifunctional column clean-up.

Food Chem, 2010, 118: 882–886

6 Ta ŕın A, Rosel MG l, Guardino X. Use of high-performance liquid chromatography to assess airborne mycotoxins Aflatoxins and ochratoxin

A. J Chromatogr A, 2004, 1047: 235–240

7 Anders K, Barbro A, Kurt A. Immunoaffinity column clean-up for the high-performance liquid chromatographic determination of aflatoxins

B1, B2, G1, G2, M1 and Q1 in urine. J Chromatogr B, 1995, 672: 253–259

8 Quinto M, Spadaccino G, Palermo C, Centonze D. Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with

liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection. J Chromatogr A, 2009, 1216: 8636–8641 9 Li PW, Zhang Q, Zhang W. Immunoassays for aflatoxins. Trends Anal Chem, 2009, 28: 1115–1127

10 Debjani S, Debopam A, Dipika R, Dilip S, Tarun KD. Simultaneous enzyme immunoassay for the screening of aflatoxin B1 and ochratoxin

A in chili samples. Anal Chim Acta, 2007, 584: 343–349

11 Sun XL, Zhao XL, Tang J, Jun Z, Chu FS. Preparation of gold-labeled antibody probe and its use in immunochromatography assay for

detection of aflatoxin B1. Int J Food Microbiol, 2005, 99: 185–194

Development of a sensitive magnetic particles chemiluminescence enzyme immunoassay for determination of aflatoxin B1 in corn

ZHENG GuoJin1,2, CHEN Hui2, YING XiTang3, HU GuoMao3 & LIN Jin-Ming1

1 Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084, China

2 Department of Chemistry, Chuxiong Medical College, Chuxiong 675000, China 3 Beijing Chemclin Biotech Co., Ltd, Beijing 100094, China

Abstract: A sensitive magnetic particles chemiluminescence enzyme immunoassay for determination of aflatoxin B1(AFB1) in corn was developed and validated. The method was developed based on a competitive immunoreaction format. Immunocomplex was formed through the competitive immunoreaction among AFB1 antigen, horseradish peroxidase-labeled AFB1 antigen and fluorescein isothiocyanate labeled anti-AFB1 monoclonal antibody. Immunocomplex combined with anti-fluorescein isothiocyanate (FITC) antibody coated magnetic particles. The magnetic particles served as both the solid phase and separator. The horseradish peroxidase(HRP)-luminol-hydrogen peroxide chemiluminescent system was chosen as the detection system. This method had a detection limit of 0.02 ng/mL and a linear range of 0.05–5 ng/mL. The intra-assay relative standard deviations were less than 9%. The inter- assay relative standard deviations were less than 15%. The recoveries were from 94.7% to 109%. The method has been successfully applied to the detection of aflatoxin B1(AFB1) in corn.

Keywords: aflatoxin B1, chemiluminescence enzyme immunoassay, magnetic particles, corn

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