流感禽流感红细胞凝集抑制试验抗体检测

标准操作规程（SOP）

中国国家流感中心

流感/禽流感红细胞凝集抑制试验抗体检测

一、目的 该文件是为流感/禽流感抗体检测、鉴定的血清学试验制定，用以说明红细胞凝集抑制试验用于血清抗体检测的操作过程和规范，确保红细胞凝集抑制试验的操作过程符合规范，确保抗体检测结果可信、滴度准确。

二、范围

适用于中国国家流感中心所有技术人员进行流感/禽流感红细胞凝集抑制试验抗体检测。

三、程序

（一）生物安全要求

H5、H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行。其余流感病毒的操作需要在BSL-2级实验室中进行。

（二）材料

1．抗原：

季节性流感病毒：人群中常见流行的流感病毒如A（H1N1）、A（H3N2）、B型流感病毒的标准参照抗原；抗原制备需要在BSL-2实验室进行，操作人员穿工作服、工作鞋，戴手套、帽子、口罩。抗原制备、灭活见《流感/禽流感灭活抗原的制备和纯化SOP》 和《β-丙内酯病毒灭活SOP》。 禽流感病毒：灭活的H5N1亚型流感病毒。抗原制备需要在BSL-3实验室进行，操作人员穿双层工作服、戴双层手套、帽子、口罩、防护目镜以及工作鞋。抗原制备、灭活见《流感/禽流感灭活抗原的制备和纯化SOP》 和《β-丙内酯病毒灭活SOP》、《多聚甲醛病毒灭活SOP》，灭活后的抗原可在BSL-2实验室内操作。

2．血清：

（1）季节性流感参比血清：

A（H1N1）亚型标准抗血清

A（H3N2）亚型标准抗血清

B型Yamagata系标准抗血清

B型Victoria系标准抗血清

血清取用需要在BSL-2实验室生物安全柜内进行。

（2）季节性流感待检血清：需急性期和恢复期双份血清，血清取用需要在BSL-2实验室生物安全柜内进行，相关操作见《临床标本的接收和保存SOP》。

（3）禽流感参比血清：由H5N1毒株制备的鸡血清，相关操作见《流感/禽流感鸡血清制备SOP》。

（4）疑似禽流感病例待检血清：需急性期和恢复期双份血清，血清取出需要在BSL-3实验室生物安全柜内进行，相关操作见《临床标本的接收和保存SOP》。

3．其他试剂：

（1）红细胞悬液：常用鸡、豚鼠、马红细胞悬液。红细胞悬液制备按照相关红细胞制备SOP进行。

（2）磷酸缓冲液（PBS），0.01M，pH 7. 2

将1包PBS粉剂（Sigma）溶于1000mL去离子水中。121℃高压灭菌，至4℃保存，保存期为3周。

（3）生理盐水：0.85% NaCl

4．其他：

96孔微量板： “U”型底微量板、”V”型底微量板（Corning）

37℃水浴锅

56℃水浴锅

台式离心机

多道可调加样器

离心管

（三）实验步骤

1．按《血清处理SOP》处理血清。

2．按下表所列条件选择红细胞凝集板和实验条件。

流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较

红细胞

适用范围

终浓度（％）

孔底部形状

孵育时间

细胞对照 鸡 流感和禽流感病毒 0.5 U或V型 30min 细胞沉积成

圆点状，倾斜

时细胞向下

流成泪滴状， 豚鼠 流感病毒 0. 5 U型 60min 细胞沉积成环状 马 禽流感病毒 0.5 U型 60min 细胞沉积成环状

注：由于“O”相毒株不能凝集鸡红细胞，所以在对该种病毒进行鉴定时应使用豚鼠红细胞。

3．红细胞凝集试验（HA）检测参比抗原滴度，具体操作见《流感/禽流感病毒红细胞凝集抑制试验鉴定SOP》。

4．制备用于红细胞凝集抑制试验的4个红细胞凝集单位的抗原，具体操作见《流感/禽流感病毒红细胞凝集抑制试验鉴定SOP》。

5．红细胞凝集抑制试验（HI）检测血清抗体

（1）流感鉴定常用的4种参比抗原：

1）A（H1N1）亚型代表毒株参比抗原

2）A（H3N2）亚型代表毒株参比抗原

3）B型Yamagata系代表毒株参比抗原

4）B型Victoria系代表毒株参比抗原

禽流感鉴定抗原：采用国家流感中心提供的参比抗原。

（2）流感血清抗体鉴定：

根据所用红细胞选用适当的微量板，须设立血清对照板。

将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1称为第一列；平行方向称行，如A1～A12称为A行。标记好待检病毒的实验室编号及加样顺序。

1）除A行外，每孔加入25μL PBS缓冲液。

2）按以下顺序，在A行各孔加入处理过的血清50μL。

A1：待检血清标本1，急性期血清

A2：待检血清标本1，恢复期血清

A3：待检血清标本2，急性期血清

A4：待检血清标本2，恢复期血清

A5：待检血清标本3，急性期血清

A6：待检血清标本3，恢复期血清

A7：待检血清标本4，急性期血清

A8：待检血清标本4，恢复期血清

A9：A（H1N1）亚型标准抗血清

A10：A（H3N2）亚型标准抗血清

A11：B型Yamagata系标准抗血清

A12：B型Victoria系标准抗血清

3）用多道加样器从A行各孔分别吸取25μL血清，由A行至H行进行2倍稀释血清，弃去H行最后25μL液体。

4）红细胞凝集抑制试验板每孔加入25μL新配制的4个凝集单位的抗原。

5）血清对照板每孔加入25μLPBS。

6）轻轻弹击微量板，使抗原与抗体充分混合。

7）室温孵育20min。

8）每孔加入50μL红细胞悬液，混匀。

9）室温孵育，时间参照上表。

10）观察红细胞凝集抑制试验结果，对照板应不出现凝集。

（3）禽流感血清抗体鉴定：

1）每孔各加25μL PBS。

2）A1加入标准诊断血清作为阳性对照；A2加入H5N1阴性血清作为阴性对照。

3）若未知血清来源省份为已有禽流感病例、并分离到禽流感病毒的省份，用该省的抗原作为鉴定未知血清的检测抗原，自A3开始分别加入不同待检血清25μL；若未知血清来源省份为其它省份，则使用人禽流感代表株作为检测抗原，自A3开始每三孔加入同样待检血清，各25μL。采用急性期和恢复期血清作对照。

4）用多道加样器从A行分别取25μL血清，由A行至H行做2倍系列稀释血清，弃去H行25μL。

5）A1、A2列加入代表株抗原25μL，A3列开始加入待检血清对应的检测抗原25μL（4个凝集单位的抗原）。

6）混匀，置室温孵育，时间见上表。

7）每孔加入50μL鸡红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。

8）室温孵育30min，观察红细胞凝集抑制试验结果。

当特定的抗体与相应的红细胞凝集抗原结合后，可以抑制病毒引起的红细胞凝集现象。红细胞凝集抑制效价是指抑制红细胞凝集出现时血清的最高稀释度的倒数。如1:80稀释的血清孔不出现凝集（红细胞凝集完全抑制），1:160稀释的血清孔出现凝集（无红细胞凝集抑制），该血清对测定病毒的红细胞凝集抑制效价为80。

流感结果判定标准：

①待检血清对参比抗原的抑制效价≥40才认为有保护作用。

②恢复期血清抗体效价比急性期血清4倍以上增高才可认为有保护作用。

禽流感结果判定标准：

①待检血清对参比抗原的抑制效价≥1:80才可以算为阳性。

②恢复期血清抗体效价比急性期血清4倍以上增高才可算阳性。

（4）红细胞凝集抑制试验注意事项

1）红细胞凝集抑制试验必须用4个红细胞凝集单位/25μL的抗原，抗原必须新鲜配制。

2）红细胞悬液的配制必须标准化。

3）正确存放试剂，避免反复冻融及污染。

4）冻干的试剂应按照说明溶解，保存。

5）鉴定待检血清的红细胞凝集抑制试验要设定以下对照：红细胞对照、阴性对照血清，以防其它非特异性抗体的影响；参比血清对照，防止非特异性凝集素及抑制素的干扰。

6）实验中所有用过的滴头均需在0.2%次氯酸钠溶液中浸泡过夜后丢弃到封口袋内，再行高压处理；红细胞凝集板使用后用封口袋封好，丢入生物废弃袋内高压处理。剩余的血清在4℃冰箱保存。