稻田土壤不同水分条件下硝化反硝化作用及其功能微生物-
第35卷第11期2014年11月
环境科学Vol．35，No．11Nov．，2014
稻田土壤不同水分条件下硝化/反硝化作用及其功能
微生物的变化特征
1，21
刘若萱，贺纪正，张丽梅
1*
（1.中国科学院生态环境研究中心，北京100085；2.中国科学院大学，北京100049）
摘要：以湖南桃源县一长期种植水稻的酸性土壤为研究对象，在微宇宙培养条件下设置了4个水分梯度处理，分别为田间持WHC）的30%、60%、90%和淹水2cm深．考察了水分条件变化对硝化和反硝化作用影响，水量（waterholdingcapacity，并结ＲFLP）技术研究了硝化-30%WHC处理合定量PCＲ和限制性末端片段长度多态性（T-反硝化微生物的响应特征．结果表明，90%WHC处理土壤硝化作用土壤无明显的硝化和反硝化作用发生，硝化作用主要发生于60%WHC和90%WHC处理土壤，明显强于60%WHC，并检测到明显的N2O释放，表明该水分条件可能发生了硝化-反硝化耦合作用．淹水处理土壤氧化还原势Eh显著低于非淹水处理土壤，无明显的硝化作用发生，但能检测到N2O释放且释放量小于90%WHC处理土壤．除培养初期（7d）外，反硝化功能基因nirS和nirK，以及氨氧化细菌（AOB）amoA基因的丰度先随着水分增加而增加，并在淹水处理中小幅下降，三者之间呈明显的正相关关系，且AOBamoA、nirS和nirK基因丰度均在90%WHC处理中最高，与该处理中硝化和反硝ＲFLP结果表明，nirS基因为代表的反硝化微生物群落组成对水分梯度变化产生明显响化活性最高相一致．T-培养2周后，Eh和含水率Cw是影响其群落组成的主要因子．应，
关键词：水稻土；水分；N2O释放；反硝化作用；反硝化微生物
中图分类号：X172
文献标识码：A
文章编号：0250-3301（2014）11-4275-09
DOI：10．13227/j．hjkx．2014．11．033
ＲesponseofNitrification/DenitrificationandTheirAssociatedMicrobestoSoilMoistureChangeinPaddySoil
2
LIUＲuo-xuan1，，HEJi-zheng1，ZHANGLi-mei1
（1．ＲesearchCenterforEco-EnvironmentalSciences，ChineseAcademyofSciences，Beijing100085，China；2．UniversityofChineseAcademyofSciences，Beijing100049，China）
Abstract：Toinvestigatetheeffectofmoisturechangeonnitrificationanddenitrificationandtheircorrespondingfunctionalmicrobes，
anacidicpaddysoilfromTaoyuan，HunanProvincewasselectedasthestudyobject，andsoilmicrocosmexperimentcontaining4differentwaterholdingcapacity（WHC）levels（30%WHC，60%WHC，90%WHC，andwaterlog）wassetupinthisstudy．Ｒesultsshowedthatnoactivenitrificationanddenitrificationoccurredin30%WHCtreatmentastherewerenoobviousammoniaconsumptionandnitrateaccumulation，whilenitrificationwasactivein60%WHCand90%WHCtreatmentsasindicatedbytheobviousaccumulationofnitrateinthosetwotreatments．Meanwhile，significantammoniaconsumptionandN2Oemissionwereonlyobservedin90%WHCtreatment，implyingthatamuchstrongernitrificationin90%WHCtreatmentthanin60%WHCtreatmentandtheco-occurrenceofnitrificationanddenitrificationin90%WHCtreatment．Inwaterlogtreatment，relativelylowerN2Oemissionwasdetectedandnoobviousnitrificationwasdetected，correspondingtoasignificantlowersoilEhinthistreatmentthanintheotherthree
oxidizingbacterianon-waterlogtreatments．Excepttheearlystageofincubation（7d），theabundanceofnirS，nirKandammonia-（AOB）amoAgenesshowedsimilarresponsestosoilmoisturechangeovertime．Excepttheslightdecreaseinwaterlogtreatment，the
abundancesofthethreegenesincreasedsignificantlyasthesoilmoistureincreased，andthehighestabundancesofnirS，nirK，andamoAgenewereobservedin90%WHCtreatmentinwhichthehighestnitrificationanddenitrificationactivitywasdetected．T-ＲFLP
analysisshowedthatthecommunitycompositionofnirSgene-containingdenitrifierschangedsignificantlyinresponsetosoilmoisture
changeaftertwoweeks，andsoilEhandCwwerethemainfactorsaffectingthecommunitycompositionofdenitrifiers．Keywords：paddysoil；moisture；N2Oemission；denitrification；denitrifier
稻田生态系统在农业生产和全球氮循环过程中起着举足轻重的作用，由于水稻特殊的种植制度，稻田土壤长期处于淹水状态且干湿交替频繁发生，使得水稻土本身具有较强的氧化还原活性，反硝化作用活跃．反硝化作用是微生物在嫌气条件下进行的硝酸盐还原过程，在多种微生物的参与下，在硝酸盐
还原酶（Nar）、亚硝酸盐还原酶（Nir）、一氧化氮还
原酶（Nor）以及一氧化二氮还原酶（Nos）的作用下，
收稿日期：2014-04-24；修订日期：2014-05-26
41322007）基金项目：国家自然科学基金项目（41090281，
作者简介：刘若萱（1988～），女，硕士研究生，主要研究方向为土壤
E-mail：liuruoxuan11@mails．gucas．ac．cn分子生态学，
*通讯联系人，E-mail：zhanglm@rcees．ac．cn
4276
环境科学35卷
－－
硝酸盐经四步还原反应，即NO3→NO2→NO→N2O→N2，依次被还原，最终转化成氮气释放，并在
～30cm．该土壤为第四季红壤发育而形成的水稻
pH=5.9，EC=0.07dS·m－1，土，土壤为弱酸性，热·kg－1，水可溶性有机碳（HWC）为415mg取样时土田间持水量（WHC）为50.95%．壤含水量约25%，
土壤运回实验室后，过2.0mm筛存放于温室备用．
为方便土壤Eh测定，微宇宙培养实验采用250mL玻璃广口瓶进行，实验设置4个水分梯度：即田间持水量（WHC）的30%、60%、90%及淹水状态（waterlog），15、30、60d进行破坏性取分别在第7、样，每个处理设置4个重复．微宇宙培养实验过程如下：分别向每个广口瓶装入50g土壤，通过向土壤中均匀地添加不同量的无菌水，调节土壤含水率至田间持水量（WHC）的30%、60%、90%以及淹水约2cm深，并在调节水分梯度的同时加入终含量
·kg－1的NH4+-N（氯化铵）．此后将Eh计的为10mg
Pt电极插入土壤，以铝箔纸盖住瓶口，置于28℃培养．培养过程中通过每周补加水分保持恒重，培养
·kg－1的NH4+-N（与开始后每隔7d再次加入10mg
调节含水量同时进行），如遇当天或第2d取样的处
理则加等量无菌水替代氯化铵溶液，以保证每次取样均在加氯化铵后7d进行．每次于采样前一天把广口瓶用涂有真空硅脂的橡胶塞密封，继续培养24h后用注射器抽取50mL气体置于气袋中待测，然后把广口瓶中的土样混匀后分为两份，一份经冷冻干燥后保存于－80℃冰箱用于DNA的提取，其余保存在4℃冰箱用于基本理化性质的测定．1.2
+
N、NO3－-N的测定土壤Eh、NH4-土壤Eh值测定采用PＲN-41便携式土壤Eh计
因此反硝化中间过程释放强效应的温室气体N2O，
作用一直受到广泛的关注．
基于通量观测和反硝化活性测定，国内外学者对于影响反硝化作用的物理化学因素、不同土壤系统中反硝化作用发生的强度及其对N2O气体排放的
［1，2］
．众多研究表明，贡献等已有大量研究土壤的
反硝化作用受到pH、有机质含量、CO2、温度、氮
素、水分含量和剖面深度等因素的影响．由于反硝化相关的酶多是在低氧条件下才能被诱导合成并具有活性，因而水分和O2含量是影响反硝化作用的重要因素，二者通过影响土壤氧化还原电位间接对反硝化过程产生影响．一般认为，土壤反硝化作用随，但也有研究发现，在临界饱和水及干湿交替条件下土壤N2O排放量最着水分的增加而增加大
［5～7］
［3，4］
．但由于反硝化过程复杂，参与反硝化作用的微生物种类非常多，已发现有80多个属的细菌和部分古菌、真菌和放线菌都可能参与反硝化作用的
［8］
且多种功能基因（如narG、全部或部分反应步骤，
napA、nirK、nirS、norB、NosZ等）参与其中的反应
［9～12］
．过程，因此对反硝化微生物的研究相对困难且目前多数研究主要集中于各种理化因素对反硝化
作用的影响和对N2O释放的相对贡献，对于反硝化过程发生的微生物学机制的研究较少．
此外，反硝化作用通常伴随着硝化作用发生，硝化-反硝化耦合作用是土壤氮肥损失最主要的途径，
［13，14］
．许多研究发现，可达投入氮肥量的40%氮肥的施入对N2O的释放和反硝化作用有明显的促进效
［7，15，16］
．但目前对应，尤其是当土壤水分含量很高时
反硝化作用的研究多只针对反硝化这一过程进行．
（DKK，TOA，Tokyo，Japan）进行，该Eh计由测定电极和参比电极组成，培养过程中Pt电极一直插于土壤中，测量时将参比电极尽量靠近Pt电极插入土壤深度约为2cm，待数值稳定1min不动时进行读数，每次测定时通过在不同方位移动参比电极读取3～4个读数取其平均值作为Eh读数．
+
·L－1N、NO3－-N含量的测定以1mol土壤NH4-
因此，本研究在室内微宇宙培养条件下，通过设置不同水分梯度条件来考察硝化和反硝化作用对水分梯
度变化的响应，并结合运用定量PCＲ和限制性末端ＲFLP）技术等研究硝化-片段长度多态性（T-反硝化微生物的响应特征，揭示不同水分条件下稻田土壤硝化-反硝化作用特征以及二者的耦合作用及其微生物学机制，以期为认识稻田土壤氮循环过程和为稻田土壤水分和氮肥管理提供科学依据．11.1
材料与方法
土壤样品与实验处理
KCl溶液（土水比1∶5）在200r·min－1下振荡浸提1h，Skalar，离心，过滤，用连续流动分析仪（SAN++，Holland）测定．1.3
N2O和CO2的测定
N2O和CO2测定分别以带有ECD电子捕获检测器和FID氢火焰检测器的气相色谱仪（AgilentGC
土壤DNA提取
TM
土壤总DNA提取采用PowerSoilTotalDNA
7890A）进行．1.4
供试水稻土采自湖南省桃源县一长期植稻农田（东经111°26'39″，北纬28°55'51″），取样深度为0
11期刘若萱等：稻田土壤不同水分条件下硝化/反硝化作用及其功能微生物的变化特征
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Isolation试剂盒进行（MOBIOlaboratories，CA，USA），称取0.25g经过冷冻干燥后的土样，按试剂盒提供的操作步骤进行，以FastPrep细胞破碎仪（QbiogeneInc．，USA）进行细胞破碎处理，速度5.0m·s－1，时间45s．提取的DNA在1%的琼脂糖胶中进行电泳检测．1.5
定量PCＲ分析
功能基因的定量分析采用SYBＲGＲEEN法，亚硝酸盐还原酶基因nirK、nirS、氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）的amoA基因的定量分析引物
［17］
分别为F1aCu/Ｒ3Cu、cd3aF/Ｒ3cd、amoA1F/amoA2Ｒ［3］、CrenamoA23f/CrenamoA616r［18］．25μL定量PCＲ反应体系中包括2×SYBＲPremixExJapan）12.5μL，TaqTM（TaKaＲa，引物（浓度为10μ
mol·L－1）各0.5μL以及10倍稀释的模板DNA2timePCＲ反应在Bio-radiQ5机器上运行．μL．Ｒeal-nirK的其中nirK、nirS基因均采用touchdown程序，63℃30s扩增程序为：95℃2min；95℃30s，（－1℃/cycle），72℃30s（5个循环）；95℃30s，58℃30s，72℃30s（30个循环）．nirS的扩增程序
58℃60s（－1℃/为：95℃2min；94℃30s，
cycle），72℃30s（5个循环）；94℃30s，53℃60s，
72℃30s（30个循环）．AOB和AOAamoA的退火温度均为55℃，扩增分别采用35和40个循环．以上4个基因均在83℃收集反应荧光信号，数据分析采用iCycler软件．1.6T-ＲFLP方法
ＲFLP方法反硝化微生物的群落结构组成以T-nirS基因的PCＲ扩增引物与定量PCＲ所用引进行，
物（cd3aF/Ｒ3cd）相同，前引物5'端以荧光染料6-carboxyfluorescein（6-FAM）标记．50μL的反应体系
TM
Japan）25μL，中包括2×PremixExTaq（TaKaＲa，
·L－1）各1μL以及10倍稀释引物（浓度为10μmol
的模板DNA4μL．扩增采用touchdown程序，反应
72℃45s（30个循环）；72℃6min．被标记的PCＲ
UpSystem产物使用WizardSVGelandPCＲClean-（Promega，USA）试剂盒进行纯化，具体步骤按照说明书进行．纯化的PCＲ产物以限制性内切酶MspⅠ
（Takara，Japan）进行酶切．20μL的酶切反应体系包括纯化后的PCＲ产物6μL，限制性内切酶（MspⅠ）1μL，10×TBuffer和0.1%BSA各2μL，其余以无菌水补足．在37℃条件下反应3h，然后把以上酶切产物送至测序公司进行纯化、电泳和测
ＲFLP图谱分析使用GeneMapper（Applied序．T-Biosystems）软件进行分析，根据标准样品ＲOX-500的检测范围，选取长度小于500bp的片段进行分析．把片段长度之差小于1bp的片段进行合并，计算出每个检测峰的峰高占所有检测峰中最大峰高的百分比，其中百分比小于0.5%的检测峰作为噪声值被剔除．
1.7数据处理
实验中的数据作图分析在Origin8中完成，统计分析在SPSS16.0软件中进行，其中，差异显著性检N-K检验，P＜0.05），测采用单因素方差分析（S-相关性用直线相关分析（Bivariate过程），采用Spearman相关系数计算，双尾显著性检验．对T-ＲFLP的结果采用典型对应分析（canonicalcorrespondenceanalysis，CCA）来研究样品间群落组成的差异及其与环境变量的关系，在CANOCO4.5软件中完成．22.1
结果与分析
不同水分梯度下土壤Eh的变化淹水处理后，土壤Eh迅速降低，整个培养过程
中淹水处理土壤Eh在107～245mV之间，显著低于非淹水处理（444～640mV）．各处理中，除30%WHC处理土壤Eh（521～560mV）随培养时间延长无显著变化外，其余处理土壤Eh在培养后期显著增加（表1）．60%WHC处理土壤Eh除在60d时（约621mV）显著高于30%WHC（约555mV）处理
63℃30s（－1℃/条件为：95℃5min；95℃45s，
cycle），72℃30s（5个循环）；95℃45s，58℃30s，
表1
Table1
持水量30%WHC60%WHC90%WHCwaterlog
7d520.8±12.15a556±6.45a443.8±1.88b112.7±2.46c
培养过程中土壤Eh的变化1）/mV
15d550.2±7.54a*558.8±4.68a*496.6±10.21b107.1±7.03c*
*
DynamicsofsoilEhduringmicrocosmincubation/mV
30d560.1±3.91b'573.9±5.10b'619.4±1.87a'131.1±5.95c'
60d555±8.76b″621.1±7.26a″639.8±2.82a″245.2±44.48c″
1）表中数值为平均值±标准误（n=4）；表中分别对各个取样时间单独进行ANOVA分析，“*'″”并添加等符号相互区别；同一列数据显著（“a”P＜0.05）性差异以不同字母表示为最大值，
4278
环境科学35卷
外，其余时间点土壤Eh与30%WHC无明显区别．90%WHC处理土壤Eh在培养前期（7d时）较低（444mV），之后逐渐增加至约640mV．淹水处理土壤Eh在培养前30d无明显变化（107～131mV），Eh与土培养至60d时增加至245mV．总体来说，P＜0.05，壤含水量呈显著负相关关系（r=－0.506，表2）．2.2
+
N、NO3－-N的变化不同水分梯度下土壤NH4-
·kg－1．培养过程中每7d56.96mg·kg－1和1.76mg
·kg－1NH4+-N，向土壤中加入10mg培养过程中N和NO3－-N的含量变化如图1、2所示．除NH4+-+
N均90%WHC处理土壤外，其余各处理土壤中NH4-
30%WHC处理呈现出不同程度的累积现象．其中，
+
N从土壤铵态氮明显累积，培养7～60d时NH4-·kg－1，而51.07mg·kg－1明显增加至149.3mg
NO3－-·kg－1之间波N没有明显累积，在0～45.87mg
+
N在7～60d的培养过动．60%WHC处理土壤NH4-
和N2O、CO2的释放
+
N和NO3－-N本底值分别为供试水稻土的NH4-
·kg－1，·kg－1明显增加至121.7mg程中从61.26mg
表2
Table2
Eh
NH4+-NNNO3－-CwN2OnirSnirKAOAamoAAOBamoA
－0.0030.829－0.506－0.2620.0380.0260.1150.206
－0.252－0.226－0.3740.038－0.2320.321－0.126NNH4+-
土壤理化指标及基因丰度等的相关分析1）
Cw
N2O
nirS
nirK
AOAamoA
Correlationsamongsoilphysiochemicalpropertiesandgeneabundances
NO3－-N
－0.180－0.0370.1120.3370.0070.394
0.6000.2380.491－0.1940.388
0.1790.4740.0790.438
0.826－0.5590.624
－0.3940.729
－0.215
1）
粗体表示相关显著或极显著
图2
图1Fig．1
－
3
土壤NO3－N浓度
N浓度土壤NH4+-
Fig．2
NConcentrationofsoilNO3－-
NConcentrationofsoilNH4+-
WHC和90%WHC处理土壤在培养过程中，发生了明显的硝化作用．淹水处理（waterlog）土壤随培养
－
NH4+-N浓度一直增加，N浓度在时间延长，而NO3-·kg－1．总体来说，整个培养过程中均低于3mg土壤
NO3－-N含量与土壤Eh呈极显著正相关关系（r=0.829，P＜0.05），而与土壤含水率的相关关系不显著．
在每次取样前24h，培养瓶以密闭胶塞密闭后继续培养24h，收集气体分析N2O和CO2产生速率，30%和60%WHC处在不同取样时间下，结果表明，
N含量在培养前30d（67.52～70.57但土壤NO-）显著高于其它所有处理（除了30d时与
90%WHC处理无显著差异外），且在30d后增至mg·kg
N浓度在92.72mg·kg－1．90%WHC处理土壤NH4+-·kg－1和分别为52.85mg第7d和第15d时较高，49.22mg·kg－1，但在培养至30d后显著降低至13.13mg·kg
－1
－1
N浓度则相反，以下；NO-在培养初
－
3
·kg－1），期较低（3.89～19.16mg但在培养30d后，·kg－1．这些结果表明
60%显著增高至133.4mg
11期刘若萱等：稻田土壤不同水分条件下硝化/反硝化作用及其功能微生物的变化特征
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理土壤均检测不到N2O的产生，而90%和淹水处理土壤中能检测到明显的N2O的释放，且N2O的产生速下同）在30d时N2O最高（图3），率（以干土计，分·（kg·h），·（kg·h）和1.15mg表明别为5.49mg
90%WHC和淹水处理土壤中有反硝化作用发生．CO2分析结果显示其变化范围（以干土计，下同）为60%WHC和229～756mg·（kg·h）－1，所有处理中，
90%WHC处理培养7d时CO2的产生速率最高，分·（kg·h）－1，·（kg·h）－1和754mg且显著别为756mg
385mg·（kg·h）－1］和淹水处理高于30%WHC［
［480mg（图4）．7d后，·（kg·h）－1］除淹水处理土
壤的CO2产生速率在培养过程中一直下降外，其他3
个非淹水处理均表现出先降低后小幅增加的趋势（图4）．结合该水稻土热水可溶性有机碳HWC含·kg－1，量较高，达415mg表明在培养前期发生了强
尤其是在60%和90%WHC烈的有机碳矿化作用，
处理的土壤中，适宜的水分含量显著促进了微生物
－
N的积累产生的呼吸和有机碳的矿化作用，对NO3-一定贡献
．
－1
－1
2.3不同水分梯度下土壤硝化/反硝化微生物群落
丰度的变化
各处理土壤中反硝化微生物相关的nirS和
nirK，以及氨氧化细菌和古菌amoA基因的定量分析nirS基因的丰度（以结果如图5所示．所有处理中，
8.19E+06～5.30E+08copies·g－1）干土计，下同，均显著高于nirK基因（2.99E+05～7.28E+07
copies·g－1），见图5（a）和图5（b）．nirS基因在淹水·g－1），处理7d时丰度最低（8.19E+06copies在90%WHC处理15d和30d时较高（5.30E+08
·g－1）．而在其它取copies·g－1和4.65E+08copies样时间下，不同处理间nirS基因的丰度无显著差
异．同样，nirK基因的最低丰度（2.99E+05copies·g－1）也出现在淹水处理的第7d，在90%WHC处理30d时最高（7.28E+07copies·g－1）．60%WHC、90%WHC和淹水处理中nirK基因丰度nirK基因丰均明显高于30%WHC处理．总体来说，
度呈现随水分梯度和培养时间先增加后降低的趋势，即90%WHC处理高于其它处理，除30%WHC中nirK基因丰度随培养时间延长无显著变化外，其余处理在培养中期（15d或30d）最高．由此可见，土壤中nirK基因的丰度对水分变化的响应比nirS基因灵敏．
各处理中AOBamoA基因的丰度在培养7d时
7后AOBamoA基因的丰度也呈随水分梯无差异，
度增加先增加后下降的趋势，在90%WHC和淹水处理中显著高于30%和60%WHC处理土壤［图5（c）］．各处理间AOAamoA的丰度在各取样时间点均无明显差异，只是15d时的丰度显著低于其他培
．养时间［图5（d）］2.4
不同水分梯度下土壤反硝化微生物群落结构的变化
由于部分样品nirK基因丰度较低，不能得到足
ＲFLP分析，够的PCＲ产物用于T-因此仅对nirS基ＲFLP分析结果因的群落结构组成进行了分析．T-显示，限制性内切酶MspⅠ共获得11个nirS基因末108bp、112bp、115bp、175端片段，分别为70bp、
bp、203bp、219bp、223bp、258bp、261bp、271bpT-ＲFs（图6）．
nirS基因代表的反硝化微培养前期（7d时），
219bp和生物群落组成在各处理间无明显差异，
图3Fig．3
土壤N2O释放量
FluxofsoilN2Oemission
图4Fig．4
土壤CO2释放量FluxofsoilCO2emission
112bpT-ＲFs为优势片段，分别占43%～56%和
20%～44%．7d后，219bp和112bpT-ＲFs的相对ＲF的比例显著增加，丰度降低，而223bpT-其相对
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环境科学35
卷
图5
Fig．5
反硝化/氨氧化微生物功能基因丰度
Abundanceoffunctionalgenesofdenitrifiersandammonia-oxidizing
microbes
203bp度增加而增加，在培养30d和60d时最高，T-ＲF在90%WHC和淹水处理中所占比例达17%～28%（30d）和16%～21%（60d），均明显高于其他取样时间和其他水分处理．这些结果表明nirS型反硝化微生物组成对土壤水分含量变化响应灵敏，ＲF等类群水分含量的增加一方面抑制了70bpT-ＲFs等反硝的生长，同时刺激了203bp和112bpT-化微生物的生长（图6）．
对nirS基因所代表的反硝化微生物群落结构组成与环境变量进行的典型对应分析（CCA）结果（图7）表明，淹水与非淹水处理沿X轴被明显分离90%WHC和30%WHC处理沿Y轴分离，X轴和开，
Y轴分别解释了56%和30.5%的变异．在所考察的
图6Fig．6
不同水分梯度处理下反硝化微生物（nirS基因）群落组成的变化
Changeofdenitrifiers（nirSgene）communitycompositionunderdifferentmoisturegradients
N和NH4+-N中，4个环境变量Eh、含水率Cw、NO3－-Eh和含水率Cw对nirS基因的多样性组成具有显著影响，表明水分含量对该土壤nirS反硝化微生物的群落结构产生明显影响．33.1
讨论
土壤水分对硝化/反硝化作用和Eh的影响硝化作用是微生物的好氧氧化过程，多数研究显示，在田间持水量的50%～60%时，土壤硝化作
丰度从7d时的0.4%～4%增加至60d时的4%～
50%，但淹水处理中的该片段在各取样时间下均最ＲFs的相对丰度总体随着水低．219bp和70bpT-分梯度增加而降低，并且在淹水处理中检测不到70bpT-ＲF；而203bp和112bpT-ＲFs总体随水分梯
11期刘若萱等：稻田土壤不同水分条件下硝化/
反硝化作用及其功能微生物的变化特征
4281
90%WHC处理中，生所需的氧化条件，同时，硝化作用可能通过为反硝化作用提供底物而促进了反硝化［22］15
作用发生．倪吾钟等通过N标记实验也发现稻290～330mV）和还原（Eh，田土壤在氧化（Eh，
－114～42mV）条件下均能进行硝态氮的反硝化作
［23］－
N用．Zhou等的研究也发现，当土壤中起始NO3-+
N后会发生硝化-很低时，加入NH4-反硝化耦合作用，最终促进反硝化作用的发生．但从本研究结果
来看，这种硝化和反硝化之间耦合作用仅发生在特定的水分（90%WHC）和Eh条件下，随含水量进一步增加，即淹水处理土壤硝化作用减弱，反硝化作用也减弱．而且笔者也发现土壤中硝态氮含量与Eh
图7Fig．7
nirS基因T-ＲFLP和环境变量的CCA分析Canonicalcorrespondenceanalysis（CCA）ofnirSgene
T-ＲFLPrelativeabundanceandenvironmentparameters
呈极显著正相关，与含水量的相关性不显著，而N2O释放量则与土壤含水量呈显著正相关而与Eh的相
［24］15
关性不显著．Khalil等运用N同位素进行的研究也表明在75%土壤孔隙水（waterfilledpore
用最为活跃，这个水分范围既满足了微生物代谢活动的最佳水分条件，也满足了氧气扩散的条件
．反硝化作用是微生物在嫌气条件下进行的硝酸盐还原过程，受土壤水分和通气状况的影响，主
［19，20］
space，WFPS）时土壤N2O排放最大，且主要来自反硝化作用，表明反硝化作用不一定只发生在还原状态，
氧化状态下硝化-反硝化作用耦合也可产生N2O．这些结果与有关干湿交替、好氧厌氧条件经常变化的环境能提供最优的反硝化条件一致．
［25］
要发生于水分含量较高的还原条件下．本研究对不
+
N、NO3－-N和N2O的监同水分梯度培养下土壤NH4-30%WHC处理土壤在整个培养过程中测结果显示，
+
N消耗和NO3－-N累积，无明显NH4-也无N2O释放，表明无明显的硝化和反硝化作用发生；60%WHC处NO3－-N浓度明显高于其理土壤在培养7d取样时，
CO2产生速率此时最高，之后明显他处理和背景值，
－
N明显累积，表明培养初期下降，而在培养后期NO3-
等的研究结论
然而，值得注意的是，近来越来越多的证据表明
［26，27］
．硝化作用过程也是N2O释放的一个主要源头硝化作用产生N2O有两种可能的途径，一是氨氧化
N2O作为副微生物氧化NH3为NH2OH的过程中，
产物释放；另一个途径是在低氧条件下，氨氧化微
－
生物参与了NO2还原为N2O的过程，即发生了硝化微生物的反硝化作用（nitrifierdenitrification）．因此不能排除本研究中硝化作用过程对90%WHC处理中检测到的N2O释放是否有贡献．下一步研究需要
1518
借助N和O同位素双标记技术进行研究以阐明此水分条件下N2O产生的微观机制．
NO3－-N主要来自于矿化作用，后期则主要来自于硝化作用；N2O释放仅在90%WHC和淹水处理中检测到，表明反硝化作用只在这两个水分含量较高的处理中发生．这些结果与之前对硝化和反硝化作用
90%WHC处理虽然的认识一致．但较为意外的是，
－
N含量低于60%WHC处理，在培养初期土壤NO3-但在培养后期显著高于60%WHC处理土壤，而且+
N显著下降，整个培养过程中NH4-表明90%WHC处理土壤硝化作用较60%WHC处理更强烈．同时，
90%WHC处理还发生了强烈的反硝化作用．Masscheleyn等［21］研究发现，当土壤Eh小于200mV时，反硝化作用显著，而当土壤Eh大于400mV时，土壤中硝化作用占优势，反硝化作用相对较弱．本研究对Eh监测的结果显示淹水处理显著降低土壤Eh，整个培养过程中淹水处理土壤Eh在107～245mV之间，而60%WHC和90%WHC处理土壤Eh在444～640mV之间，保证了硝化作用发
除90%WHC处理外，淹水处理在整个培养过
但其总量明显小于90%程中也检测到N2O的释放，
WHC处理．Cai等［7］对水稻田进行的长期监测结果而在也表明，水稻田在淹水期间释放的N2O非常少，
落干季节的排放量最大．在过度还原的条件下可促进完全反硝化过程的发生，即反硝化作用终产物以
［28，29］
N2为主，．对于淹水条件下N2O的而不是N2O释放量减少是由于反硝化作用发生完全释放N2还是由于硝化-反硝化耦合作用受阻导致反硝化作用减弱所致还需进一步研究．
此外，培养过程中各个水分处理土壤Eh均有
4282
环境科学35卷
随时间延长而增高的趋势（30%WHC除外），尤其是90%WHC和淹水处理，土壤Eh值随培养时间显著增加，可能由于培养瓶在长时间静置后，导致空气中的氧气进一步溶解扩散，以及还原性物质被氧化所致．另外，整个过程中Eh的测定也可能存在一定的误差，水分含量较高的处理土壤在培养过程中，土壤聚集成团，使得氧气随空隙扩散，进而导致Eh测量值比理论值偏高．但这些实验及测量误差并不影响硝化和反硝化作用对不同水分梯度响应的总体趋势．3.2
土壤水分对反硝化微生物群落的影响参与反硝化作用过程的功能基因有多个，由于亚硝酸盐转化为一氧化氮的过程是反硝化作用有别于其他硝酸盐代谢的标志性反应，是反硝化过程中的重要限速步骤，其相应的亚硝酸盐还原酶基因（nir基因）包括nirK（Cu-nitritereductasegene）和nirS（cd1-nitritereductasegene）常被作为反硝化微生
物的代表性分子标记用于其群落结构研究．有研究
［30］
表明nirK基因对外界环境因子的响应更灵敏，在
［31］
土壤反硝化中可能起着比nirS更为重要的作用，
ＲFLP分析结果表明，此外，对nirS基因的T-水
ＲFs等反硝化微生分增加抑制了219bp和70bpT-物类群的生长，但同时刺激了203bp和112bpT-ＲFs等类群的生长．可见，203bp和112bpT-ＲFs对应的反硝化微生物类群可能在高水分处理土壤的
反硝化作用中起了重要作用．CCA分析结果进一步揭示了在本研究所模拟的底物为非限制性因子的条件下，含水率Cw和氧化还原电位Eh是影响土壤反硝化微生物群落结构的两个重要因素．4
结论
（1）硝化作用主要发生于60%WHC和90%WHC处理土壤中，且90%WHC处理最强，并检测到明显的N2O释放，表明该水分条件可能发生了硝化-反硝化耦合作用；淹水处理土壤Eh显著低于非淹水处理土壤，无明显的硝化作用发生，但能检测到少量N2O的释放．
nirS、nirK及AOB（2）定量PCＲ分析结果表明，
amoA的丰度均随着水分增加而增加，且在90%
WHC处理中最高，与该处理中硝化和反硝化活性最高一致，表明这些基因在土壤硝化和反硝化过程中起了重要作用．
（3）nirS基因为代表的反硝化微生物群落组成随土壤水分条件变化发生明显变化，含水率Cw和氧化还原电位Eh是影响其群落结构组成重要因素，一些类群仅在高水分处理土壤中出现，可能在这些处理土壤的反硝化作用中起了重要作用．
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因此反硝化细菌nirK基因丰度常被用来表征和预
［30，32］
．本研究结果显示，测N2O的释放受土壤水分反硝化微生物数量和群落结构发生明条件的影响，
nirS基因丰度显著地高于显变化．在所有处理中，
nirK，培养过程中nirK和nirS基因丰度整体随着水分的增加而增加，这一现象在Szukics等的研究中也
［3］
有体现，尤其nirK基因反应更为灵敏．AOBamoA的丰度与nirS和nirK基因表此外，
现出相似的趋势，三者之间呈极显著的正相关．而AOAamoA的基因丰度除了在15d时显著低于其他培养时间外，在其他取样时间和水分梯度处理间无明显变化．表明该土壤中氨氧化细菌对水分条件变化的响应比氨氧化古菌灵敏，且在高水分处理土壤的氨氧化过程中起了重要作用．除7d取样外，其余各个取样时间点AOBamoA、nirS和nirK基因的丰度均在90%WHC处理土壤中最高，而在淹水处理土壤中又有所下降，表明90%WHC条件最适宜土壤氨氧化细菌和反硝化细菌的生长，有利于硝化及反硝化作用共同发生．随水分含量的进一步增加，硝化及反硝化微生物的丰度均下降，硝化、反硝化作用的强度也减弱．这可能是由于淹水导致的过度还原条件抑制了硝化微生物的活性，进而限制了反硝化作用底物的浓度，最终抑制了反硝化微生物的活性．
11期刘若萱等：稻田土壤不同水分条件下硝化/反硝化作用及其功能微生物的变化特征
4283
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