牛血浆中主要蛋白质的研究进展

※专题论述食品科学

2009, Vol. 30, No. 21489

牛血浆中主要蛋白质的研究进展

郭 玲，刘爱国*，胡志和

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

摘　　　要：动物血液是肉制品工业最大的副产品，目前除了少部分被利用外，大部分还是以废料的形式弃去，既造成环境污染又浪费了宝贵的蛋白质资源。文章阐述了牛血浆中主要蛋白质即纤维蛋白原，免疫球蛋白和牛血清白蛋白的提取方法，检测方法以及它们各自的应用，为今后综合利用牛血浆提供一定的依据。关键词：牛血浆；蛋白质；提取；检测；应用

Research Advances in Main Proteins in Bovine Blood Plasma

GUO Ling，LIU Ai-guo*，HU Zhi-he

(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,

Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Abstract ：Animal blood is one of the important byproducts from meat industry. However, less has been utilized in meatprocessing and most has been abandoned as waste, which causes environmental pollution and resource waste. This articledescribes methods for the extraction and determination of main proteins from animal blood plasma (fibrinogen, immunoglobulinand BSA) and their applications, which will present some insights for the comprehensive utilization of animal blood plasma.Key words：blood plasma；protein；extraction；determination；application

中图分类号：TS201.21 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)21-0489-04

以体积计算，牛血可分为65%～70%的血浆和35%～40%的血细胞[1]，血浆中基本组分为蛋白质(7%)，水(91%)和各种无机盐、低分子混合物(1%)。血里的蛋白质除了血红蛋白存在于血细胞中，其他的蛋白质都分布在血浆中。血浆中蛋白主要分为3种：白蛋白(占血浆中蛋白含量的42%)，球蛋白(56%)和纤维蛋白原(2%)。其中，球蛋白又分为α-球蛋白(占血浆中蛋白含量的14%)、β-球蛋白(11%)和γ-球蛋白(32%)。IgG属于γ-球蛋白，在100ml血浆中大约含有1000mg IgG[2]。

在肉制品行业中，动物血液是最大的副产品。对于血液的处理，有一部分用作简单的血制品食用，有一部分用作饲料，但大部分还是以废料的形式弃去，因此造成了严重的环境污染。另外，由于血液中含有丰富的蛋白质，这些蛋白具有重要的经济价值，所以对于血液的回收利用是很有意义的。本文主要分析牛血浆中的纤维蛋白原，免疫球蛋白和白蛋白的提取方法，检测手段以及各自的应用。

收稿日期：2009-09-18

基金项目：天津市科技攻关重点项目(060015)

１牛血浆中蛋白质的提取方法

实验室提取蛋白质的手段很多，按照提取的目的和

效果可以将其分为两类：粗分级(粗提)和细分级(纯化)。1.1

粗提

粗提一般用盐析、等电点沉淀和有机溶剂沉淀等方

法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液[3]。

用于盐析的中性盐有很多，如硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵、氯化钠、多聚磷酸盐等。其中以硫酸铵为最佳，因为它在水中的溶解度很高，25℃时可达到4.1mol/L，而溶解度的温度系数较低，对蛋白质有保护作用，高浓度时可抑制微生物和蛋白酶的活性，价格低廉，适合于大规模生产。罗磊等[4]用硫酸铵提取猪血清IgG时，其实验结果表明：pH 7.4，硫酸铵饱和度为35%时，IgG得率为69.5%，纯度为76%；当硫酸铵饱和度为40%时，IgG得率为91.8%，纯度为61.6%。来源不同，用硫酸铵提取时的最佳浓度也有所区别。Hebert等[5-6]在研

作者简介：郭玲(1986－)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：[email protected]*通讯作者：刘爱国(1964－)，男，副教授，硕士，研究方向为乳品科学与工程、食品添加剂。：

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食品科学

2.1

纤维蛋白原的检测方法

※专题论述

究硫酸铵沉淀兔、羊、山羊、马、大鼠、小鼠、豚鼠、猴子、黑猩猩、猪、鸡和牛的血清蛋白时发现，不同动物γ-球蛋白盐析沉淀的最佳硫酸铵饱和度不尽相同。

有机溶剂沉淀法常用的试剂有乙醇，丙酮和聚乙二醇等，其中以乙醇最为常用。冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早是由Cohn等于1992年提出的用于制备丙种球蛋白(IgG)。目前，国际上常用冷乙醇法有两种，一种是美国等主要使用的Cohn-Oncley法，另一种是西欧等国主要使用Kistler和Nitschmann法。Moure等[7]在粗提牛血浆中的蛋白质时，采用的是乙醇沉淀的方法。

在实际生产和应用中，饱和硫酸铵法和冷乙醇法用的比较多。对于大规模提取血浆中的蛋白质，饱和硫酸铵法和冷乙醇法都有各自需要解决的问题。采用饱和硫酸铵法需要解决的问题是硫酸铵的回收利用，如果不能很好的对硫酸铵进行回收，不仅造成环境污染，而且提高了生产成本。对于冷乙醇法，在操作过程中需要对温度进行严格控制，若乙醇温度升高，则会造成蛋白变性。乙醇易燃，生产上易造成安全隐患。另外，对乙醇的回收也应列入考虑范围之内，以便降低成本。纯化

样品经过粗提之后，一般的杂蛋白已被除去，此时若想得到较高纯度的产品，需要进一步的纯化。纯化一般使用离子交换层析，凝胶过滤以及亲和层析等。离子交换常用DEAE-cellulose和DEAE-Sepharose柱，也有学者用其他的柱材料纯化。Moure Q-HyperD[7-8]用一种强阴离子树脂等对牛血浆中的蛋白进行纯化，实验结果表明，用这种纯化手段可将牛血浆中的主要蛋白分开，而且纯度较高，将此树脂与DEAE-Sepharose比较发现，Q-HyperD比DEAE-Sepharose的处理量大，效果更好。凝胶过滤法通常使用SephadexG100-200，固定相为不同网孔的凝胶颗粒，依靠凝胶对不同大小和形状的溶质分子排阻程度不同而分离[9]。凝胶过滤是一种温和的纯化方法，对样品分子的活性没有影响，但其不足之处就是处理量少，对于大规模化生产不适用。亲和层析是利用生物大分子物质与连接在载体上的配基间特异性亲和力不同而分离的，常用琼脂糖亲和层析法。亲和层析具有高效、纯化效果好的优点，但它的不足之处是易使目的蛋白变性，而且成本高，不推荐用于大规模化生产。常用的配体有3类：A蛋白，G蛋白，抗原或特异性单克隆抗体。

这些纯化手段有时并非单一使用，岳喜庆等[10]在纯化牛血清中IgG时，先用DEAE-52纯化，再用SephadexG200纯化，其产品提取率为9.06g/L，产品回收率为91%。２

牛血浆中蛋白质的检测方法1.2

纤维蛋白原的检测方法有数十种，大体上分为物理化学检测法、功能检测法和免疫检测定法三类。

物理化学检测法有亚硫酸钠盐析法、热浊度法等，此类方法是根据蛋白质的理化特性而建立的，特异性不高，影响因素很多，测定结果会受其他蛋白影响，所以结果偏高[11]。

功能检测法有Von Clauss法、Jocobsson法、PT-der法等。Von Clauss法是美国国家临床检验委员会(NCCLS)推荐的纤维蛋白原的常规测定方法，其原理为将足够的凝血酶加到稀释血浆中，记录出现纤维蛋白原凝块的时间，该时间与纤维蛋白原含量呈负相关。该法又分为手工法和仪器法，仪器法比手工法精密度高，但是在没有仪器的条件下，手工法也可以作为常规的检测，此法是一种快速、简便、特异性较好的功能性测定方法。Jocobsson法为世界卫生组织(WHO)和英国国家生物标准及控制研究所( NIBSC) 推荐的参考方法，此法比较繁琐。PT-der法其原理是当凝血酶原反应时间完成时，纤维蛋白原均变成纤维蛋白，其形成的浊度与纤维蛋白原含量成正比，因此无需任何试剂即可由产生的浊度，用终点法或速率法算出FIB的含量。此法精密度也相当高，当纤维蛋白原含量在正常范围或轻度异常时与Von Clauss法相比无显著差异。在常规工作中一般采用Von Clauss法，有血凝仪及试剂的单位可采用PT-der法[12]。另外，在没有血凝仪的条件下，有学者用间接的方法来测定纤维蛋白原。孟志云[13]先测定样品中总的蛋白浓度，然后在样品中加入凝血酶，一段时间后，离心去除发生凝固的蛋白，测定上清液中蛋白的浓度，总蛋白量－上清液中残余蛋白量=可凝固蛋白量，此时计算出的可凝固蛋白量即为纤维蛋白原的含量。

免疫测定法是以被测物质(纤维蛋白原)作为抗原，然后用免疫动物的方法制备相应的抗体，利用抗原抗体的特异性结合反应来对被检测物质进行定量。它包括免疫扩散法、电泳酶联免疫吸附法和免疫比浊法等。此法特异性不强，因为这些方法所针对的纤维蛋白原的抗原决定簇也存在于纤维蛋白单体、纤维蛋白(原)降解产物和异常纤维蛋白原中[11]。2.2

免疫球蛋白检测方法

免疫球蛋白的检测方法很多，有单向免疫扩散法、双向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、放射免疫分析法、酶联免疫吸附法、亲和标记的免疫分析、免疫印迹、透射比浊法、免疫散射比浊法和高效液相色谱法等。其中，测定保健食品中免疫球蛋白的国家标准是用高效液相色谱法。单向免疫扩散法操作简便、设备简单、测定成本较低，但是由于在测量直径时存在误差，导致

※专题论述食品科学

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结果差异较大，准确度和灵敏度低。火箭免疫电泳法操作简单，特异性强，成本较低。刘爱国等[14]用火箭免疫电泳法检测牛血清中具有活性的IgG，确定了火箭免疫电泳法的最佳操作条件，实验结果表明，该法线性良好。酶联免疫吸附法灵敏度高、特异性强，但该法耗时长、成本高。免疫散射比浊法需要借助特种蛋白分析仪，其测定结果快速，精密度好，结果准确，但仪器昂贵，并不是所有单位都具备。透射比浊法需要借助全自动生化分析仪，在没有全自动生化分析仪的情况下，也可以用手工法做。王南华等[15]用透射免疫比浊法(手工法)和散射免疫比浊法(仪器法)对检测免疫球蛋白的结果进行比较，结果表明，两法免疫球蛋白结果无显著差异，在经济条件不允许的情况下，透射免疫比浊法不失为一种好的选择。透射比浊法和免疫散射比浊法在临床上用的比较多。2.3

白蛋白检测方法

常规检测白蛋白的方法有溴甲酚紫(BCP)法、电泳

EPA、蛋白质和碳水化合物，并以与母乳相似的比例配成，利于婴儿吸收，并增强防病抗病能力。1998年新西兰Healtheries健康食品有限公司的两种牛初乳粉和牛初乳片每100g分别含IgG555mg和IgG4166mg[23]。进入20世纪，我国也开始了以免疫球蛋白作为功能性食品添加剂的研究与开发。黑龙江完达山乳品厂生产出含牛初乳Ig的“乳珍”、婴儿配方奶粉等[24]。1996年张和平等成功地研制出含有人肠道10种病原微生物抗体的免疫乳，并于1997年开始批量生产系列免疫乳粉类产品[22]。目前，市场上有多种利用牛初乳分离提取的免疫球蛋白制成的胶囊和口服液，如北京巨凡美生物科技有限公司生产的贝儿乐口服免疫球蛋白胶囊，武汉中奥生物工程有限公司生产的免疫球蛋白胶囊，上海家宝医学保健科技有限公司生产的合康胶囊，美国纽海尔斯公司生产的纽尔斯牛初乳粉复合片等。

虽然已经将免疫球蛋白成功的用在了许多产品中，但随着含IgG功能食品的市场需求扩大化，以及更大的经济和社会效益，还需要解决许多问题。比如在加工过程中对IgG活性的影响，强酸和强碱易使IgG变性，加工过程中温度过高也会影响IgG的活性；IgG有半衰期，这对于长期保存含有IgG的食品是一个不利因素。为了减少在加工过程中IgG活性损失或丧失，可以考虑在产品中加入IgG的保护剂。另外，还存在一个重要的问题就是在成人的胃酸pH值下(pH2)IgG很快失活，而在婴儿胃酸pH值下(pH4)则稳定，因此如何保护IgG通过成人的胃进入肠道是一个非常重要的问题[22]。3.2

纤维蛋白原

纤维蛋白原在凝血和止血过程起到非常重要的作用，是必不可少的成分之一。经干燥的人纤维蛋白原，用适量注射水溶解，即成纤维蛋白原注射液。它适应于先天性无或低纤维蛋白原症，获得性低纤维蛋白原症，纤维蛋白原含量低而引起的异常出血和需实施手术的病人[25]。外用纤维蛋白原包括将纤维蛋白原制成纤维蛋白原止血粉，纤维蛋白原止血贴以及纤维蛋白黏合剂。孟志云[13]对纤维蛋白原止血粉进行了研究，胡庆柳[26]发明了纤维蛋白止血贴，它是一种以猪、牛或马腿肌腱为原料生产的胶原海绵，再在其表面涂敷从猪血中提取的纤维蛋白原和凝血酶，制成的可用于内脏及体表创伤止血的可吸收医用敷料。刘文[27]报道了纤维蛋白胶在眼科中的应用，特别是在复杂的视网膜手术中，已显示出良好的应用前景。3.3

白蛋白

白蛋白是血液中含量最丰富的蛋白质，它维持人体血浆胶体渗透压的80%，也是血液中各种大分子物质的主要载体，如脂肪酸、激素和酶等。它同时也能增加血液的有效循环量，对于失血、手术或烧伤所致的各

法和溴甲酚绿(BCG)法[16]。朱学海等[17]探讨了这3种不同方法在测定人和动物血清白蛋白之间的关系，结果发现BCG法和电泳法测定白蛋白两者更接近实际含量，BCP法不宜作动物血清白蛋白的检测。张嶙等[18]在检测猪血清白蛋白含量时，通过比较BCP法、电泳法和BCG法的检测结果，发现BCG法效果较好。

另外，人们也发现一些新的检测方法。石燕等[19]

建立了用染料麦塔喇红固定波长同步荧光分析法测定牛血清白蛋白的方法，实验结果表明，以麦塔喇红为荧光探针，用同步荧光分析法测定蛋白质，方法简便，反应速度快，灵敏度高，检测限为66.0ng/ml。王明瑞[20]研究了两种测定牛血清白蛋白的方法，一种方法是利用二甲酚橙与Cu(II)配合物与牛血清白蛋白的共振散射光谱特征，另一种方法是利用二苯胺磺酸钠探针与牛血清白蛋白的共振散射光谱特征，实验结果表明这两种方法灵敏度高，检测限低，操作简便，反应条件容易控制。３3.1

牛血浆中主要蛋白质的应用

免疫球蛋白

大量研究证明，免疫球蛋白能凝集细菌，中和细菌毒素，并能在体内其他因素的参与下彻底杀死细菌和病毒，激活补体，增强机体的免疫功能[21]。由于免疫球蛋白特殊的生理功能，国际上对免疫球蛋白用作功能食品添加剂的研究成为热点。实现大规模工业化生产含有IgG制品的应首推美国的Stone Milk Biologics Inc.，该公司与新西兰乳品局合作，于1989年开始生产和销售针对类风湿性关节炎的S100系列免疫乳制品，包括免疫乳粉、免疫乳清蛋白浓缩物[22]。1991年，Century LabsInc.生产的Ig类婴儿食品的配方，主要含有Ig、DHA、

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食品科学

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※专题论述

种休克均有明显疗效。人血清白蛋白主要应用于临床、新陈代谢和遗传方面的研究，而牛血清白蛋白(BSA)常常作为蛋白模型进行体外研究，其应用有以下几个方面：1)白蛋白常用来作为半抗原的载体形成全抗原，例如激素、代谢物或药物，均需要与白蛋白结合才能在生物体内产生免疫测定的抗体；2)在色谱仪中固定甲基化白蛋白可以分离核酸；3)白蛋白与内源性化合物、药物分子及许多金属离子如Cu2+、Ni2+、Ca2+、Zn2+等的相互作用有较为广泛的研究[28]。例如金天柱等[29]研究了BSA与钙的络合作用，以便考虑用BSA代替人血清白蛋白后体内钙离子的循环和血液凝固等问题。陈勤研究了BSA与重金属离子的结合机理和状态，这对于了解重金属离子在体内的代谢过程与生物效应的作用机理有

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实际意义。Xiao等分析了葛根素与BSA间的相互作用。葛根素是降低血管阻力，改善脑及冠脉循环，降

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低心肌耗氧量的一种重要的异黄酮，血清白蛋白是一种重要的运输蛋白，研究药物分子与血清白蛋白之间的相互作用，用助于从分子水平上理解药物在体内的运输和代谢过程。４

前景展望

牛血浆中含有丰富的蛋白质，纤维蛋白原是凝血因子，目前主要用于医药卫生行业；免疫球蛋白有其特殊的免疫生理功能，在国内外将免疫球蛋白作为功能性食品添加剂的研究已经成为热点，并成功的开发了出许多产品；牛血清白蛋白在血浆中含量最多，应用范围广。虽然牛血浆中的蛋白质已经用于各个行业，但以目前情况来看，由于蛋白质本身性质的限定以及分离制备的过程复杂、繁琐等问题尚未解决，并没有实现大规模工业化生产。为了充分利用资源和获得更大的经济效益，今后应以实现大规模生产为研究目的，进一步扩大应用范围。随着蛋白质分离纯化技术的不断发展，牛血浆中的蛋白质实现大规模化生产及其广泛应用的前景非常乐观。

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