工业真菌中的交替氧化酶_顾帅1_刘强1_何皓2_李霜1
生物工程学报
顾帅 等/工业真菌中的交替氧化酶
Chinese Journal of Biotechnology http://journals.im.ac.cn/cjbcn DOI: 10.13345/j.cjb.140166
March 25, 2015, 31(3): 1−10
2015 Chin J Biotech, All rights reserved
综述
工业真菌中的交替氧化酶
关键词: 交替呼吸途径，抗氰呼吸，交替氧化酶，工业真菌
Alternative oxidase in industrial fungi
Received : March 19, 2014; Accepted : August 29, 2014
Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21076104), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2011AA02A206), National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2013CB733605).
Corresponding author: Shuang Li. Tel/Fax: +86-25-83172094; E-mail: [email protected]
国家自然科学基金 (No. 21076104), 国家高技术研究发展计划 (863计划) (No. 2011AA02A206)，国家重点基础研究发展计划 (973计划) (No. 2013CB733605) 资助。
网络出版时间： 2014-09-24 09:30 网络出版地址： http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140166.html
ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech March 25, 2015 Vol.31 No.10
Shuai Gu1, Qiang Liu1, Hao He2, and Shuang Li1
1 College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, Jiangsu China 2 Petrochemical Research Institute of Petrochina Co. Ltd ., Beijing 100195, China
Abstract: Filamentous fungi have been used in industrial fermentation extensively. Based on non-phosphorylating electron transport process, alternative respiration pathway (ARP) acts as an energy overflow, which can balance carbon metabolism and electron transport, allow the continuance of tricarboxylic acid cycle without the formation of ATP, and of fungi and the physiological function of conditioned pathogen. (AOX) is the terminal oxidase Owing to the property that alternative oxidase (AOX) is sensitive acid (SHAM) and insensitive to conventional inhibitors of cytochrome respiration, alternative is also named as oxidase Keywords : 生产应用非常广泛，酸、乳酸、富马酸等) (霉素、头孢菌素等
了交替呼吸途径 (Alternative respiration pathway, ARP) ，该条途径是真菌细胞平衡物质代谢和能量代谢的天然途径，对真菌的抗逆反应、发酵产物的代谢积累以及条件致病菌的生理作用都具有非常重要的影响[1-3]。
工业真菌是现代微生物发酵产业的主力军，研究真菌代谢产物积累原理至关重要，而交替呼
于真菌的交替呼吸及其交替氧化酶的最新研究结果作一综述，探讨对工业真菌交替氧化酶的认识。
1 真菌的交替呼吸途径
交替呼吸途径最早发现于植物中，随后在藻类、原生动物和真菌中也相继发现了该途 径[4]。目前，有关交替呼吸途径和交替氧化酶的调控机制及其生理学意义已成为呼吸代谢领域的研究热点。
真菌如同其他真核生物一样，细胞色素呼吸链由4个蛋白复合物构成 (图1所示) ：复合物Ⅰ (NADH∶泛醌氧化还原酶) 、复合物Ⅱ (琥珀酸:泛醌氧化还原酶) 、复合物Ⅲ (泛醌∶细胞色素c 氧化还原酶) 和复合物Ⅳ (细胞色素c 氧化
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酶) 。在电子传递过程中，能量由线粒体内膜跨膜复合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ处泵出质子而保留。每个复合物都有特异性的抑制剂，如鱼藤酮和粉蝶霉素 (piericidin) 可以抑制复合物Ⅰ，抗霉素抑制复合物Ⅲ
和氰化物抑制复合物Ⅳ。
在真菌中，交替呼吸途径以两种形式存在[5]：一条是以交替NADH 脱氢酶 (Alter na tive NADH dehydrogenases) 介导的，交替电子传递
链中的复合物Ⅰ，接受NADH 的电子并直接转移到泛醌，但这一过程并不泵出质子，NADH 和泛醌之间的自由能 (73 kJ/2e–) 以热量的形式散发。交替NADH 脱氢酶对鱼藤酮不敏感，因
图1 酵母的线粒体呼吸途径示意图[4]
Fig. 1 Schematic representation of the mitochondrial respiratory chain in yeasts [4]. I, II, III, IV: respiratory chain complexes; AOX: alternative oxidase; UQ: ubiquinone; NDI: internal NADH dehydrogenase; NED: external NADH dehydrogenase; TCA: tricarboxylic acid cycle; Cyt c: cytochrome c; SHAM: salicylhydroxamic acid; AA: Antimycin A; CN–: cyanide.
交替NADH 脱氢酶。另一条是以交替氧化酶 (Alternative oxidase, AOX) 介导的，能将泛醌处的电子直接交给终端受体O 2，绕过复合物Ⅲ和Ⅳ，与交替NADH 脱氢酶一样，AOX 也不产生
可保留的能量，而是以热量形式散失[6]。由于AOX 介导的交替呼吸途径对氰化物具有抗性，因此，这种交替呼吸途径又被称为抗氰呼吸途径 (Cyanide-resistant respiration, CRR)。真菌的
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交替呼吸途径同植物的交替呼吸途径一样，起到了能量溢流的作用。
在真菌的代谢过程中，交替呼吸途径的存在与否及其强度是可被诱导调节的。在柠檬酸生产菌株黑曲霉Aspergillus niger中，Hattori 等
[7]
替呼吸途径的呼吸活动区分开，常用于氧电极 (Oxygen electrode) 测定交替呼吸的活性[2]。
2.1 交替氧化酶AOX 的结构
虽然对CN –不敏感的交替呼吸途径很早就AOX 的存在；由于难以AOX ，有关其结构[13-14]。随着SUM 模式 (图2A) (。SUM 模式是由Siedow 等
发现交替呼吸途径是一直存在的；而Li 等[8]
发现在粗糙脉孢霉Neurospora crassa 中，交替呼吸途径可被线粒体蛋白抑制剂氯霉素诱导产生；用细胞色素呼吸链的抑制剂抗霉素A 或者KCN 处理汉逊氏酵母Hansenula anomala 同样能够诱导交替呼吸途径[9]。作者也在米 Rhizpous oryzae [10]。AOX 是一个完整的跨膜蛋
2个跨膜的α-螺旋镶嵌在线粒体内膜末端和C 末端为亲水结构域，伸向线粒体基质，C 末端存在4个小α-螺旋，其中第1和第4个螺旋都包含有一个EXXH 的保守序列单元，形成双核铁中心。其中铁离子与该蛋白的活性密切相关。Andersson 等[16]认为上述的SUM 模式与其他结构明确的双铁羧酸盐蛋白并非完全一致，因此提出了与其他双铁蛋白结构类似的AOX 活性位点模式，即AN 模式。AN 模式认为AOX 是一种膜间蛋白，而不是跨膜蛋白，不包含跨膜螺旋结构，是双核铁羧基蛋白家族中的一员，由4个长螺旋束组成，并认为这可能是AOX 的活性位点，EXXH 保守序列位于第2和第4螺旋上。该模式被大多数学者所接受，Berthold 等[17]研究了AOX1a 在大肠杆菌中的表达，且首次获得了交替氧化酶的电子顺磁共振
2 该发现[11]。AOX 似，氧化泛醌并转移4个电子与氧结合生成 水[6]，即在细胞色素呼吸链抑制剂 (如抗霉素A 或氰化物) 存在时，电子传递过程依然能继续进行，电子依次传递给AOX 和O 2。水杨氧肟酸 (Salicylhydroxamic acid, SHAM) 和没食子酸丙酯 (n -propyl gallate) 能特异性抑制AOX 活性[12]，但不影响细胞色素呼吸链的呼吸活性；所以AOX 特异性抑制剂能把细胞色素呼吸途径和交
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(Electron paramagnetic resonance, EPR) 信号，证明了交替氧化酶具有双铁羧酸基蛋白家族中氢氧桥键的特征。AOX 中的E217或E268发生丙氨酸 (Ala)突变后，在AOX 失活的同时EPR 信号也消
失了，该实验支持AOX 的蛋白结构是AN 模式。
核苷酸如AMP 、ADP 、d-AMP 或GMP 可以促进AOX 的活性[20]，但其作用机制尚不明确。
与真菌细胞色素呼吸调控不一样，AOX 的调控有着更为复杂的调控机理。2009年，日本学者发现在柠檬酸发酵过程中黑曲霉的AOX 在[7]。作者在研究中发现米根霉AOX 也在转录水平上受starve stress) 3.72倍，交替呼吸倍[10]。然而，AOX 的调控Magnaporthe grisea 的AOX 的活录水平与AOX 活性表现不一致[21]。
2.2 交替氧化酶AOX 的调控
虽然真菌交替呼吸和植物交替呼吸有很多相似之处，但是在AOX 的调控方式上却不尽相同。植物与部分真菌的交替呼吸诱导物和诱导条件如表1所示，例如在植物中，酮戊二酸和丙酮酸可以有效促进AOX 活力，线粒体的交替呼吸活性可提高4倍[19]生物中，尚未发现有机酸对AOX 而在酵母菌如P. anomala 、lipolytica
图2 AOX 结构模式[18]. A：SUM 模式；B ：AN 模式
Fig. 2 Two proposed structural models of the AOX [18] (A) the SUM model. (B) the AN model IMS: intermembrane space; IM: inner membrane; M: matrix.
表1 植物与部分真菌的AOX 活性诱导条件
Table 1 The induction condition of the AOX in plants and parts of fungi
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pastotis 的交替呼吸时，发现过量表达aox 或敲除aox 后均能影响酵母细胞的生长和底物的代谢水平；Xu 等[1]研究发现，在核盘菌Sclerotinia
sclerotiorum 中，交替呼吸能促进菌丝的生长发育及菌核的形成，在培养过程中加入SHAM 后能明显地抑制菌丝的生长和菌核的形成。在树
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干毕赤酵母Pichia stipitis 中，交替呼吸可能作为氧化还原缓冲池，在木糖的限氧发酵过程中防止木糖转化为木糖醇[4]。
径降低；柠檬酸的产量和生产速率随着交替呼吸途径的增强而增强，当发酵液中添加SHAM 时，柠檬酸的产量和产率迅速下降[42]。1987年，Hilgendorf 在研究溶氧对顶头孢霉Acremonium chrysogenum C 的影响时，提出该菌1991年Kozma 证实促作用机制[40]。孢霉Acremonium C 的过程中，交替呼[3]，菌体的AOX C 生产之间具有良好的正相关0.9；使用SHAM 特异性抑制交C 的合成速率会快速下降至几乎为0，而生物量的合成不受影响[43]。
本课题组对米根霉利用木糖和葡萄糖的代谢差异研究发现，米根霉在木糖培养条件下胞内还原力 (NADH/NAD+) 和ATP 含量较高，胞内代谢趋向于合成反应，米根霉生物量较高；而在葡萄糖培养条件下米根霉胞内还原力以及ATP 的含量较低，但有机酸积累量较高[44]。对米根霉的呼吸特征研究表明[10]，米根霉代谢木糖时，不存在交替呼吸活性，而米根霉代谢葡萄糖时交替呼吸活性较强，在米根霉利用葡萄糖发酵产富马酸阶段，富马酸的生产速率和米根霉交替呼吸强度成正相关关系，发酵过程中添加SHAM 会抑制富马酸的积累。这一现象表明交替呼吸起到了减少细胞内氧化还原力，调
3.1 交替呼吸对代谢产物积累的影响
真菌的呼吸途径同其他真核生物的呼吸途径一样，在电子传递过程中，能量由线粒体内膜跨膜复合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ处泵出质子而被保留，驱动合成ATP ，因而每传递两个电子产生2.5分子ATP 。NADH/NAD+通过呼吸链与ATP 的产生密切相关，ATP 在细胞的生理功能上发挥着中枢作用。当合成代谢产物消耗的ATP 就会造成ATP 减少[40]。但是以AOX 递至AOX 两个电子只产生的作用，将ATP 合成与TCA TCA 循环继物的生成[41]。
柠檬酸、头孢霉素C 等重要工业真菌发酵过程的代谢调控都与交替呼吸 (抗氰呼吸) 有关。1980年，Zehentgruber 在黑曲霉Aspergillus niger 中发现了交替呼吸途径，随后Kubicek 证实该途径与柠檬酸过量积累有重要关系。Kirimura 等报道，在A. niger发酵产柠檬酸阶段，SHAM 敏感呼吸途径增强，氰化物敏感呼吸途
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节胞内氧化还原状态的作用，并且最终导致了代谢产物的变化。
但是，交替呼吸现象的存在也并不总是表现为促进产物合成。Shi 等[45]对树干毕赤酵母Pichia
stipitis 的SHAM 敏感型末端氧化酶 (PsSto1p) 的基因 (PsSTO1) 进行了敲除，结果表明突变株生长周期更短，发酵木糖产乙醇量增加了20%；同时，在酿酒酵母中异源表达PsSTO1能增加总体氧消耗速率并使重组菌获得了抗氰呼吸能力。
细胞内的活性氧物质ROS 对交替呼吸途径的激活有着重要作用[47]。对生存不利的环境如含有电子传递链的抑制剂氰化物、抗霉素A ，线粒体中蛋白质合成抑制剂氯霉素，以及高温、低pH 、H 2O 2ROS 作为调控信号影响一系列aox 基因的AOX 清除剂，可以在线粒体呼2[48]，而且AOX 可以抑制线粒体ROS ，并激活ROS 清除系统来降低ROS ，从而减少ROS 对细胞的伤害[49-50]。Mangnani 等研究发现烟曲霉Aspergillus fumigates 在受到百草枯处理导致的氧化胁迫时，其交替氧化酶在核酸水平和蛋白水平上都有了提高[51]。Maxwell 等[52]发现抑制AOX 可导致线粒体ROS 上升；而反过来表达AOX 则能降低ROS ，并可以同时增强ROS 清除系统的活性。因此，可以说交替呼吸途径是一个强力的抗ROS 系统，这对微生物适应环境胁迫，平衡体内氧化还原水平至关重要。
图3 胞内氧活性物质ROS 的代谢机制[46]
Fig. 3 ROS metabolism mechanism in intracellular[46].
3.2 交替呼吸对真菌抗氧胁迫 stress) 的作用
的活性氧 (Reactive oxygen ROS ， (细胞内ROS 实际上从摇瓶培养接种到高溶氧发酵罐中时，往往导致延滞期增加，生长速率下降，底物消耗速率下降，胞内蛋白质和ATP 含量下降。这一现象的产生与增加溶氧时O 2导致细胞内活性氧物质ROS 的大量积累有关，ROS 抑制了初级代谢关键酶 (3-磷酸甘油醛脱氢酶、顺乌头酸酶等) ，导致代谢速率下降。
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4 结束语
近年来的工业生物技术的相关研究表明，ATP 、NADH 及NADPH 等能量因子参与了各种重要平台化学品和聚合物的合成途径，如何调
的热点[53]式。[1] Xu T, 594–602.
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(本文责编 陈宏宇)