乳酸菌细胞固定化发酵的研究进展
专论与综述
中 国 酿 造
2009年第5期总第206期
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乳酸菌细胞固定化发酵的研究进展
赵春燕, 张 颖, 王 丹, 刘 臻
(沈阳农业大学食品学院, 沈阳110161)
摘 要:乳酸菌是能利用糖发酵产生乳酸的一类细菌, 在食品、医药、工业、农业和科研等领域均有广泛的应用。本文综述了利用乳酸菌进行细胞固定化发酵生产乳酸、乳制品以及N isi n 的国内外研究进展情况。并对乳酸菌固定发酵技术的应用前景进行了简要论述。
关 键 词:乳酸菌; 固定化; 发酵
中图分类号:TQ92 文献标识码:A 文章编号:0254-5071(2009) 05-0011-04
D evelop m ent on fer m entation of imm obilized Lactic acid bacteria
Z HAO Chunyan , Z HANG Y ing , WANG Dan , LIU Zhen
(Department of food Science , Shenyang Agric ult ural Uni versit y Shenyang 110161)
Ab stract :Lactic ac i d bacteria is a ki nd o f bacteria wh i ch can produce lacti c ac i d by fer m enti ng suga r , it i s ex tensi ve l y used i n t he field o f f ood , m ed i c i ne , i ndustry , agr i culture , scientific resea rch and so on . Th i s paper is a brief rev ie w o f t he research progress a t ho m e and abroad about pro -duc i ng lactic ac i d , da iry products , and N isi n by m i mob ilized Lactic ac i d bacter i a . T he applicati on foreg round o f fer m entati on o f m i m ob ilized L actic ac i d bacteria i s a lso i nc l uded i n this arti c l e . K ey word s :L actic aci d bacter i a ; m i m ob ilized ; fer m entati on
乳酸菌细胞固定化发酵在20多年前就开始引起人们的关注
[1]
每升凝胶珠。ROUKA S T 和KOTZEK I DOU P 研究了共固定化混合培养方法, 即将干酪乳杆菌和乳酸乳球菌共固定在海藻酸钙﹑k -角叉莱胶﹑琼脂和聚丙烯乙酰胺上, 发酵去蛋白乳浆生产乳酸, 结果表明共固定化混合培养所获得的乳酸产量高于单独固定化细胞的乳酸产量, 其中海藻酸钙是最好的固定化材料。
吕线红等
[6]
, 随着研究的不断深入, 利用固定化乳酸菌发酵
生产的范围越来越广泛。1固定化乳酸菌发酵生产乳酸
乳酸是一种重要的有机酸, 乳酸及其盐类、衍生物在食品、医药工业中广泛用作酸味剂、防腐剂、还原剂、杀菌剂, 并且可用来生产生物可降解塑料
[2]
。国内多以传统的通过实验得出海藻酸钙固定化乳酸菌发
间歇法发酵生产乳酸, 即在发酵过程中不断添加碳酸钙以中和发酵液中的乳酸。这不仅增加了发酵染菌率, 而且工艺繁杂。如何在发酵过程中, 降低细胞周围的乳酸浓度, 消除产物抑制, 提高原料的利用率, 缩短生产周期, 降低生产成本, 是乳酸发酵生产需要解决的关键问题要求, 减少产物的抑制作用。
HANG Y D 等
[4]
[3]
酵生产L -乳酸是一种比较理想的固定化方法。固定化细胞发酵的最适培养基为葡萄糖50 0g /L、酵母粉3 0g /L, 比游离细胞的发酵培养基氮源用量减少。陈晔等
[7]
在单因
素试验基础上, 利用响应曲面法, 对固定化植物乳杆菌发酵生产L -乳酸的条件进行优化, 建立了显著影响因素和响应值之间的函数关系, 得到回归方程。结果表明, 最适合乳酸发酵的固定化细胞制备条件为海藻酸钠浓度2%、包埋量20mL 菌悬液/mL凝胶、固定化增殖时间22h 、颗粒直径1mm 左右、氯化钙浓度2%。
传统的乳酸制备主要以粮食为原料, 为了节约粮食, 降低乳酸发酵成本, 近年来, 国内外开展了利用有机废弃物为原料发酵乳酸的研究。G I VRY S 等
[8]
。利用固
定化乳酸菌发酵乳酸可以提高乳酸产率, 降低对培养基的
研究表明:游离细胞的乳酸产率只在
第一个循环中比固定化细胞高, 在随后的分批循环发酵中乳酸产量急剧下降。海藻酸钙固定化细胞能长时间保持反应活力, 在18d 中成功完成9个循环发酵生产乳酸, 在第5个反应中得到最大的乳酸产量为62g /L。L I NKO P 等使用海藻酸钙固定保加利亚乳杆菌和瑞士乳杆菌, 研究了不同种类碳水化合物对乳酸生产的影响。R I CHTER K 等
[5]
利用海藻酸钙
固定化乳杆菌, 发酵半纤维水解液生产乳酸, 乳酸产量为62 77g /L, 而自由细胞发酵产量只有41 3g /L。S HEN X L 等
[9]
在分批发酵中, 使用含菌体数量达1011个/L的凝胶研究了海藻酸钙固定化德氏乳杆菌Z U-S2发酵纤维
珠进行发酵, 结果每小时的乳酸的最高产量达到139g /L
收稿日期:2009-02-26
基金项目:辽宁省教育厅资助项目(05L387)
质水解液生产乳酸。最终的乳酸产量和糖利用率分别为
作者简介:赵春燕(1966-), 女, 辽宁沈阳人, 副教授, 研究方向为食品生物技术。
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48 7g /L和95 2%, 而且固定化细胞十分稳定, 重复利用性好, 在12批反复发酵中乳酸的转化率为95%。在稀释率为0 13h 的连续化生产中乳酸的转化率为92 4%。徐忠等
[10]
-1
度上升最高, 凝乳现象明显, 适合制备酸奶。海藻酸钙固定化乳酸菌的胶珠放置7d 时间, 其乳酸菌的含量仍可制备酸奶。PREVO ST H 等施安辉
[19]
[18]
利用海藻酸钙凝胶包埋固定化
对影响固定化乳酸菌发酵大豆秸秆酶解液的因素进保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行连续发酵生产酸奶。
报道了利用固定化细胞技术连续发酵生产酸牛
奶的方法, 与传统的间歇生产工艺相比, 具有简化菌种制备过程、乳酸菌种和发酵设备利用率高、控制简单等优点。
贺银凤等
[20]
行了研究, 并与游离乳酸菌进行了对比, 结果表明, 随着底物糖浓度的增加, 游离乳酸菌与固定化乳酸菌发酵乳酸的产量均有提高, 但固定化发酵的乳酸产量要明显高于游离乳酸菌发酵。固定化乳酸菌对温度以及pH 值的稳定性也比游离乳酸菌好。
在固定化细胞反应器使用方面, ARNAUD J P 等
[11]
对乳酸菌固定化工艺参数及发酵特性进
行了研究, 结果表明, 乳酸菌包埋法固定最佳工艺条件为:
将
海藻酸钠的浓度为2%, 菌体的稀释比例为1 1, CaCl 2溶液的浓度为1 5%, 固定化温度为42 。固定化细胞胶珠含菌量为4 59 10个/g 。凝胶珠直径不同, 对产酸能力影响不同。小胶珠(直径2mm~2 5mm ) 在发酵过程中比大胶珠(直径4mm~4 5mm ) 产酸速度快, 更适合用于发酵制备酸奶。固定化乳酸菌产酸和耐酸能力强, 菌种活力得到保持, 具有持久和可重复利用的特点。
王树宁等
[21]
9
k -卡拉胶固定化细胞接入一个连续化搅拌反应器(CSTR ) 中, 并将搅拌速度由50提高到150转, 结果表明, 乳酸的转化率由10%提高到24%。齐香君等
[12]
在柱式反应床
中对固定化乳酸菌发酵生产乳酸进行了研究, 结果表明, 固定化细胞在柱式反应床中可以连续化进行乳酸菌发酵, 连续发酵5批次无细胞泄漏, 产酸稳定。具有良好的操作稳定性, 乳酸产量为69 28g /L, 未固定化细胞产酸量为37 6g /L, 可见固定化乳酸菌的产酸量明显提高。为了消除产物的反馈抑制作用, 柳萍等
[13]
探讨了海藻酸钙包埋乳酸菌技术, 并对
凝胶珠的保藏性进行了研究, 认为乳酸菌固定在海藻酸钙凝胶珠中, 可使乳酸菌长期保存活力不减, 避免过多传代造成的菌种退化。在所制得的嗜热链球菌凝胶珠中, 菌种活力在保存过程中几乎与活化后的嗜热链球菌活力相当。由此可知, 利用凝胶珠包埋乳酸菌的方法是可行的, 可以直接用于酸奶的生产, 极为方便。
海藻酸钙包埋细胞时, 凝胶颗粒的稳定性和机械强度一般, 不利于固定化细胞的多次利用。采用混合包埋, 凝胶机械强度明显提高
[22]
提出了固定化细胞发酵生
产乳酸的新方法。确定固定乳酸菌的条件为海藻酸钠浓度3 0%, Ca C l 2浓度为5%, 细胞悬浮液体积 海藻酸钠溶液体积为1 4。该法以海藻酸钙为载体包埋固定干酪乳杆菌发酵生产乳酸, 用离子交换树脂从发酵液中分离出乳酸, 分离出产物后的发酵液返回反应器循环利用, 成功地消除了产物的反馈抑制作用, 缩短了发酵时间, 提高了乳酸的生产速率。与常规的发酵法相比, 利用离子交换树脂吸附发酵使糖转化率和乳酸生产速率分别由86 2%和0 328g /(L h) 提高到94 7%和0 482g /(L h) 。
在降低固定化载体成本方面, 张强等
[14]
。吴定等
[23]
将1 2%海藻酸钠与
1 5%聚乙烯醇混合作包埋试剂, 分别制备嗜热链球菌和保加利亚杆菌固定化球, 按照1 2组合, 前发酵(38 ~40 ) 时间约为20m i n , 后发酵时间控制为12h (8 ~10 ), 可确保大豆酸乳有良好的风味。蔡华珍等
[24]
用市售的卡
拉胶和廉价易得的木质刨花制备了2种固定化乳酸菌。用0 5%戊二醛和0 2mo l/L乙二胺混合水溶液处理1h 使卡拉胶交联加固, 强化后的卡拉胶包埋乳酸菌连续使用11次, 共528h , 其产酸能力不变。同时半连续发酵产酸实验表明, 刨花吸附乳酸菌反复产酸8次, 持续时间达384h , 其产酸能力仍为初始状态的90%。同时对刨花吸附乳酸菌的机理作了进一步的研究, 指出这是一种静电吸附作用。
2固定化乳酸菌发酵生产乳制品
在食品中工业广泛应用的固定化技术是将细胞包埋于食品级的多孔聚合载体
[15]
以甘
蔗作吸附材料, 以海藻酸钠作包埋剂, 吸附包埋嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌, 以此作发酵剂连续发酵酸乳。结果表明, 包埋甘蔗方块的海藻酸钠胶体溶液的浓度为3%, 固化剂Ca C l 2为3%, 固化6h~8h , 制得的甘蔗菌块机械强度高, 性能优良。
固定化乳酸菌在干酪生产中也有应用, SOD I N I I 等
[25]
以k -卡拉胶包埋的固定化细胞接种于混合培养基中
[26]
发酵生产干酪, 干酪的凝乳时间比传统的发酵过程降低了约50%。党亚丽等
对海藻酸钠固定化乳酸菌促熟干酪
6
。k -卡拉胶、琼脂糖、明胶、
[16]
的效果进行了研究。结果表明, 在干酪粒中添加10cfu /g固定化乳酸菌, 水溶性氮(WSN ) 、三氯乙酸氮(TCA S N ) 和磷钨酸氮(P TA SN ) 含量较对照组明显增加; 感官评定结果表明, 干酪粒中添加105cfu/g 固定化乳酸菌, 干酪成熟30d
海藻酸盐、壳聚糖都可以用来生产凝胶珠。这些聚合体作为食品添加剂得到广泛的认可, 尤其是在乳品工业余冬生等
[17]
。
通过游离乳酸菌和固定化乳酸菌的凝乳实验
, p
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左右。
3固定化乳酸菌发酵生产N i si n
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程伴随着细胞的大量游离, 连续发酵则克服了这一缺点, 发酵连续运行144h 未见发酵液效价下降, 发酵液效价稳定在600I U /mL~800I U /mL。研究采用柱式填充床反应器进行发酵, 该反应器操作平稳可以避免固定化细胞的大量脱落。
焦中高等
[31]
细菌素是某些细菌利用核糖体合成机制产生的一种具有抗菌作用的蛋白质或多肽类物质。近年来, 用乳酸菌生产细菌素引起了人们相当大的兴趣。N isi n 是应用比较广泛的细菌素之一, 极易受消化酶的分解而降解成氨基酸, 具有天然、高效、无毒的特点, 可用作食品防腐剂。
分批发酵是N isi n 生产最常用的方法, 但并不适合工业化生产。以固定化乳酸菌进行连续发酵生产N isi n 是降低生产成本的好方法。许多文献报道了乳酸菌质粒的不稳定性是连续化生产的一个限制性因素, 而细胞固定化能够改进许多重组细胞质粒的稳定性, 尤其有利于质粒编码的细菌素的生产。
在国外有关N isi n 的研究中, SCANNELL A G M 等[29]
的研究表明乳酸菌固定化提供了一个更稳定长期的生产N isi n 的可能性。将海藻酸钙固定化细胞接入MR S 培养基连续发酵180h , 同时以游离细胞做对照来证明固定化在细菌素生产中的作用。由游离细胞细胞生产细菌素要比固定化细胞快。然而, 达到反应平衡后, 固定化菌株能够在连续发酵中保持其最大生产力。相反, 游离细胞在反应中途效价急剧下降, 在反应进行到80h 后效价由18h 时的5120AU /mL下降为160AU /mL。在含有固定化细胞的反应器中最大生产力能维持相当长的一段时间。SONOMOTO K 等
[28]
采用k -卡拉胶作为固定化载体, 并添加
磷酸三钙, 包埋固定化乳酸乳球菌DL -203发酵生产N -i si n 。确定最佳固定化条件为k -卡拉胶3 5%(w /v), 磷酸三钙0 1%(w /v),细胞浓度5%~10%(v /v), 发酵培养基添加0 2%吐温-20, 30 摇床培养进行分批重复发酵, 连续使用5批以上, 发酵液N isi n 效价未有下降, 达游离细胞发酵液的50%~60%。采用柱式填充床反应器进行固定化连续发酵生产N isi n , 可连续稳定生产150h 以上, 而且固定化小球未有明显的细胞外漏, 发酵液N isin 效价可达游离细胞发酵液的30%~40%。虽然不能达到游离细胞的发酵水平, 但由于缩短了发酵时间, 避免了频繁接种可能带来的杂菌污染, 易于自动化控制, 因此仍是一种极具应用前景的发酵方法。相信随着科学技术的发展, 固定化细胞必将取代游离细胞, 成为天然防腐剂N isin 发酵生产的主要方式。
以上的研究充分证明了固定化乳酸菌连续生产N isin 是可行的, 也为N isi n 的商业化生产和应用提供了一种新的技术和方法。4展望
将乳酸菌进行固定化有很多优点, 固定化细胞应用于食品工业的主要优点在于能保护细胞不受外界不利条件如酸、碱、有害离子等的影响, 并且能起到连续生产的目的。目前, 固定化细胞技术不够成熟, 在细胞固定化载体的有无毒性、性能、机械强度和微生物污染等方面还存在不足, 所有这些都限制了固定化细胞技术的发展和应用。但是随着对细胞固定化技术的深入研究, 固定化乳酸菌发酵技术必将在医药、化学、食品等领域充分发挥潜力, 在现代化工业生产中占据重要地位。参考文献:
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N isi n 产生菌株, 指出吸附法要好于包埋法, 将细胞吸附于多孔渗水的壳聚糖珠子(Ch itopearl SH-2510), N isin 的产量比自由细胞发酵生产提高了1 7倍。然而在反复培养期间, 发现N i si n 的效价下降。但将细胞吸附于光敏树脂凝胶珠(ENTG-3800), N isi n 产量比游离细胞提高, 而乳酸产量下降, 操作稳定性也很好。
国内也有关于固定化乳酸菌生产N isi n 的报道, 孔健等
[29]
以海藻酸钙为材料, 固定乳酸乳球菌S M 526, 研究不
同条件对N isin 合成的影响。结果表明, 利用2%海藻酸钠在10mm ol/LCa C l 2条件下, 得到的固定化细胞颗粒稳定性较好, 可维持90h 无破裂, 在研究中, 去掉三种缓冲盐成分, 而向培养基中加入10mm ol/mLCa C l 2, 提高了颗粒的稳定性。通过72h 3批次循环的半连续培养, N isi n 活性为850I U /mL, 无明显的细胞渗漏现象。连续化生产70h , N isi n 活性达1150I U /mL, 相当于游离细胞的发酵水平。而且连续生产N isi n , 大大提高了生产效率, 发酵液中游离细胞少, 有利于产品分离纯化。
王永华等
[30]
以卡拉胶为材料对乳酸乳球菌进行固定
化, 分别测定分批发酵和连续发酵情况下发酵液效价、细
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