第三章 酶的提取与分离纯化

第三章 酶的提取与分离纯化

◆酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。

◆主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥、结晶等。 1.细胞破碎

细胞破碎方法可以分为机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法和酶促破碎法等,如表3-1所示。

表1细胞破碎方法及其原理

1.1 机械破碎法

通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。 常用的破碎机械有组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。 机械破碎法分为3种:捣碎法，研磨法和匀浆法。 1.2物理破碎法

通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。

常用的物理破碎法方法有温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法等，现简介如下：

(1)温度差破碎法：利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。 (2)压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。常用的有高压冲击法、突然降压法、及渗透压变化法等。

(3)超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（ cavitation）而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法。 1.3化学破碎法

通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法称为化学破碎法。

常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂，和特里顿（Triton）、吐温（Tween）等表面活性剂。

有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。

表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。

1.4酶促破碎法

通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法称为酶促破碎法，或称为酶学破碎法。

将细胞在一定的pH值和温度条件下保温一段时间，利用细胞本身酶系的作用，使细胞破坏，而使细胞内物质释出的方法，称为自溶法。

自溶法效果的好坏取决于温度、pH值、离子强度等自溶条件的选择与控制。

为了防止其他微生物在自溶细胞液中生长，必要时可以添加少量的甲苯、氯仿、叠氮钠等防腐剂。 根据细胞外层结构的特点，还可以外加适当的酶作用于细胞，使细胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中，使细胞破裂。 2.酶的提取

酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。

酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 2.1酶提取的主要方法

表2 酶的主要提取方法

2.2影响酶提取的主要因素

主要影响因素是酶在所使用的溶剂中的溶解度以及酶向溶剂相中扩散的速度。 此外，还受到温度、pH值、提取液体积等提取条件的影响。

(1)温度：提取时的温度对酶的提取效果有明显影响。一般说来，适当提高温度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的扩散速度。

(2)pH值：溶液的pH值对酶的溶解度和稳定性有显著影响。为了提高酶的溶解度，提取时pH值应该避开酶的等电点。

(3)提取液的体积：增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。但是过量的提取液，会使酶的浓度降低，对进一步的分离纯化不利。所以提取液的总量一般为原料体积的3～5倍，最好分几次提取。

此外，在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小，则扩散面积越大，有利于提高扩散速度；适当的搅拌可以使提取液中的酶分子迅速离开原料颗粒表面，从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速率；适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出来，直至达到平衡。

在提取过程中，为了提高酶的稳定性，免致在引起酶的变性失活，可适当加入某些保护剂。如酶作用的底物、辅酶、某些抗氧化剂等。 3.沉淀分离

沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。

沉淀分离是酶的分离纯化过程中经常采用的方法。

沉淀分离的方法主要有盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法等。

表3 沉淀分离方法

3.1盐析沉淀法

盐析沉淀法简称盐析法，是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。盐

蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。

一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。

而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。

盐之所以会改变蛋白质的溶解度，是由于盐在溶液中离解为正离子和负离子。由于反离子作用，使蛋白质分子表面的电荷改变，同时由于离子的存在改变了溶液中水的活度，使分子表面的水化膜改变。

酶在溶液中的溶解度与溶液的离子强度关系密切。它们之间的关系可用下式表示： S

Log - KsI

S0

式中， S：酶或蛋白质在离子强度为I时的溶解度（g/L）

S0：酶或蛋白质在离子强度为0时（即在纯溶剂中）的溶解度（g/L） Ks：盐析系数 I：离子强度

在温度和pH值一定的条件下，S0为一常数。所以上式可以改写为： LogS = LogS0 - KsI = β- KsI

式中，β= LogS0， 主要决定于酶或蛋白质的性质，也与温度和pH值有关。当温度和pH 值一定时，β为一常数。

Ks为盐析系数，主要决定于盐的性质。Ks的大小与离子价数成正比、与离子半径和溶液的介电常数成反比，也与酶或蛋白质的结构有关。

离子强度I 是指溶液中离子强弱的程度，与离子浓度和离子价数有关。即： 1 I = — ∑miZi 2

式中， mi ：离子强度（mol/L） Zi： 离子价数

2

对于含有多种酶或蛋白质的混合液，可以采用分段盐析的方法进行分离纯化。

在一定的温度和pH值条件下（β为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为

Ks分段盐析；

而在一定的盐和离子强度的条件下（KsI为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为β分段盐析。

在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。

在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。饱和度是指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比值。 3.2等电点沉淀法

利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为等电点沉淀法。

由于在等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在,在实际使用时，等电点沉淀法往往与其它方法一起使用。

在加酸或加碱调节pH值的过程中， 要一边搅拌一边慢慢加进，以防止局部过酸或过碱而引起的酶变性失活。

3.3有机溶剂沉淀法

利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为有机溶剂沉淀法。

有机溶剂之所以能使酶沉淀析出是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。

常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。有机溶剂的用量一般为酶液体积2倍左右，不同的酶和使用不同的有机溶剂时，有机溶剂的使用浓度有所不同。

有机溶剂沉淀法的分离效果受到溶液pH值的影响，一般应将酶液的pH值调节到欲分离酶的等电点附近。 3.4复合沉淀法

◆在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的方法称为复合沉淀法。

◆常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。 3.5选择性变性沉淀法

选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，这种分离方法称为选择性变性沉淀法。

根据酶和所含杂质的特性，通过加热或改变pH值或加进某些金属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。 在应用该法之前，必须对欲分离的酶以及酶液中的杂蛋白等杂质的种类，含量及其物理、化学性质有比较全面的了解。 4.离心分离

离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 4.1离心机的选择

离心机通常按照离心机的最大转速的不同进行分类，可以分为常速（低速）离心机、高速离心机和超速离心机 3种。

常速离心机（低速离心机）：最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104× g 以下。主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。

高速离心机（设有冷冻装置）：最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力达到 1×104～1×105 ×g 。主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。

超速离心机：最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105× g甚至更高。主要用于

DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。 4.2离心方法的选用

对于常速离心机和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和离心时间，就能达到分离效果；

如果希望从样品液中分离出2种以上大小和密度不同的颗粒，需要采用差速离心方法。 而对于超速离心，则可以根据需要采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。 4.2.1差速离心：

差速离心是指采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。 4.2.2密度梯度离心：

密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。

为了使沉降系数比较接近的颗粒得以分离，必须配制好适宜的密度梯度系统。密度梯度系统是在溶剂中加入一定的溶质制成的。这种溶质称为梯度介质。

常用的梯度介质有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系统，其适用范围是：蔗糖浓度5～60%，密度范围1.02～1.30 g/cm2。

密度梯度一般采用密度梯度混合器进行制备。制备得到的密度梯度可以分为线性梯度、凹形梯度和凸形梯度等(图4-1)。

密度梯度混合器由贮液室、混合室、电磁搅拌器和阀门等组成，如图所示。

B

a b c

图4-1 三种梯度形式示意图 a:线性梯度 b:凸形梯度 c:凹形梯度

图4-2 梯度混合器示意图

A:混合室 B:贮液室

具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带。 4.2.3等密梯度离心：

当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围内时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒或向下沉降，或向上飘浮，只要时间足够长，就可以一直移动到与它们各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度点），形成区带。这种方法称为等密梯度离心，或称为平衡等密度离心。

等密梯度离心常用的离心介质是铯盐，如氯化铯（CsCl）、硫酸铯（Cs2SO4）、溴化铯（CsBr）等。有时也可以采用三碘苯的衍生物作为离心介质。 4.3离心条件的确定

选择好离心力（或离心速度）和离心时间。 4.3.1离心力：

低速离心一般可以用离心速度，即转子每分钟的转数表示。如5000r/min等。

在高速离心，特别是超速离心时，往往以相对离心力（RCF）表示。如60000×g等。相对离心力是指颗粒所受到的离心力与地心引力之比值。即： Fc

RCF = —— = 1.12×10-5·n2·r Fg

式中: RCF:相对离心力

(×g)

Fc：离心力 Fg：地心引力

n: 转子每分钟转数 (r/min) r: 旋转半径 (cm) 4.3.2离心时间：

对于常速离心、高速离心和差速离心来说，离心时间是指颗粒从离心管中样品液的液面完全沉降到离心管底的时间，称为沉降时间或澄清时间；

对于密度梯度离心而言，离心时间是指形成界限分明的区带的时间，称为区带形成时间； 等密梯度离心所需的离心时间是指颗粒完全达到等密度点的平衡时间，称为平衡时间。 最常用到的是沉降时间。

沉降时间是指颗粒从样品液面完全沉降到离心管底所需的时间。沉降时间决定于颗粒的沉降速度和沉降距离。

对于已经知道沉降系数的颗粒，其沉降时间可以用下列公式计算： 1 lnr2 - lnr1 t = — （ ------------ ） S ω2 式中，t：沉降时间（s） S：颗粒的沉降系数 （s） ω：转子角速度（rad/s）

r1，r2：分别为旋转轴中心到样品液液面和离心管底的距离（cm）

上式中括号中部分可以用转子因子K表示。即： lnr2 - lnr1

K =（

ω2

转子的效率因子K与转子的半径和转速有关。生产厂家已经在转子出厂时表示出了最大转速式的K值。据此，可以根据公式ω12K1 =ω22K2 计算出其他转速式的K值。对于某一具体的颗粒来说，沉降系数S为定值，所以K值越小，其沉降时间就越短，转子的使用效率就越高。

4.3.3温度和pH值：

◆离心温度一般控制在4℃左右，对于某些耐热性较好的酶，也可以在室温条件下进行离心分离。 ◆离心介质的pH值必须是处于酶稳定的pH值范围内，必要时可以采用缓冲溶液。 5.过滤与膜分离

◆过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。

◆过滤介质常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等。 ◆根据过滤介质的不同, 过滤可以分为膜过滤和非膜过滤两大类。

◆根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤可以分为粗滤、微滤、超滤和反渗透等4 大类。它们的主要特性如表4所示。

表4 过滤的分类及其特性

5.1非膜过滤

采用高分子膜以外的材料,如滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属等作为过滤介质的分离技术称为非膜过滤。包括粗滤和部分微滤。 5.1.1粗滤：

借助于过滤介质截留悬浮液中直径大于2μm的大颗粒，使固形物与液体分离的技术称为粗滤。通常所说的过滤就是指粗滤而言。

粗滤主要用于分离酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、培养基残渣及其它大颗粒固形物。 粗滤所使用的过滤介质主要有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属等。

为了加快过滤速度，提高分离效果，经常需要添加助滤剂。常用的助滤剂有硅藻土、活性炭、纸粕等。 根据推动力的产生条件不同，过滤有常压过滤，加压过滤，减压过滤等3种。 (1)常压过滤:以液位差为推动力的过滤。

实验室常用的滤纸过滤以及生产中使用的吊篮或吊袋过滤都属于常压过滤。 (2)加压过滤:以压力泵或压缩空气产生的压力为推动力。 生产中常用各式压滤机进行加压过滤。

添加助滤剂、降低悬浮液粘度、适当提高温度等措施，均有利于加快过滤速度和提高分离效果。 (3)减压过滤: 又称为真空过滤或抽滤，是通过在过滤介质的下方抽真空的方法，以增加过滤介质上下方之间的压力差，推动液体通过过滤介质，而把大颗粒截留的过滤方法 实验室常用的抽滤瓶和生产中使用的各种真空抽滤机均属于此类。

减压过滤需要配备有抽真空系统。由于压力差最高不超过0.1 MPa，多用于粘性不大的物料的过滤。 5.1.2微滤:

微滤又称为微孔过滤。微滤介质截留的物质颗粒直径为 0.2～2μm，主要用于细菌、灰尘等光学显微镜可以看到的物质颗粒的分离。

非膜微滤一般采用微孔陶瓷、烧结金属等作为过滤介质。也可采用微滤膜为过滤介质进行膜分离。 5.2膜分离技术

借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。

膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。

根据物质颗粒或分子通过薄膜的原理和推动力的不同，膜分离可以分为 3大类。

(1)加压膜分离:以薄膜两边的流体静压差为推动力的膜分离技术。在静压差的作用下，小于孔径的物质颗粒穿过膜孔，而大于孔径的颗粒被截留。

◇根据所截留的物质颗粒的大小不同，加压膜分离可分为微滤、超滤和反渗透等3 种。

①微滤：以微滤膜（也可以用非膜材料）作为过滤介质的膜分离技术。微滤膜所截留的颗粒直径为0.2～2μm 。微滤过程所使用的操作压力一般在0.1 MPa 以下。

◇在实验室和生产中通常利用微滤技术除去细菌等微生物，达到无菌的目的。

②超滤：超滤又称超过滤。是借助于超滤膜将不同大小的物质颗粒或分子分离的技术。超滤膜截留的颗粒直径为 20～2000 Å。相当于分子质量为 1×103～5×105 道尔顿。 ◇主要用于分离病毒和各种生物大分子。

◇膜的透过性一般以流率表示。流率是指每平方厘米的膜每分钟透过的流体的量。超滤时流率一般为0.01～5.0 mL/cm2• min。膜的孔径大，流率也大。

◇影响流率的主要因素是膜孔径的大小。此外，颗粒的形状与大小，溶液浓度，操作压力，温度和搅拌等条件对超滤流率也有显著影响。

◇在酶的超滤分离过程中，压力一般由压缩气体来维持，操作压力一般控制在 0.1～0.7 MPa 。

③反渗透：反渗透膜的孔径小于20 Å，被截留的物质分子质量小于 1000道尔顿。操作压力为0.7～13 MPa 。 ◇主要用于分离各种离子和小分子物质。 (2)电场膜分离

电场膜分离是在半透膜的两侧分别装上正、负电极。在电场作用下，小分子的带电物质或离子向着与其本身所带电荷相反的电极移动，透过半透膜，而达到分离的目的。 ◆电渗析和离子交换膜电渗析即属于此类。 ①电渗析：

◆渗析时要控制好电压和电流强度，渗析开始的一段时间，由于中心室溶液的的离子浓度较高，电压可低些。当中心室的离子浓度较低时，要适当提高电压。

◆电渗析主要用于酶液或其它溶液的脱盐、海水淡化、纯水制备以及其它带电荷小分子的分离。也可以将凝胶电泳后的含有蛋白质或核酸等的凝胶切开，置于中心室，经过电渗析，使带电荷的大分子从凝胶中分离出来。

② 离子交换膜电渗析：

◆离子交换膜电渗析的装置与一般电渗析相同。只是以离子交换膜代替一般的半透膜而组成。 ◆离子交换膜的选择透过性比一般半透膜强。

◆离子交换电渗析在酶液脱盐、海水淡化、以及从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸等带有电荷的小分子发酵产物等。 (3)扩散膜分离

◆扩散膜分离是利用小分子物质的扩散作用，不断透过半透膜扩散到膜外。而大分子被截留，从而达到分离效果。常见的透析就是属于扩散膜分离。

◆透析膜可用动物膜、羊皮纸、火棉胶或赛璐玢等制成。

◆透析主要用于酶等生物大分子的分离纯化，从中除去无机盐等小分子物质。 6.层析分离

◆层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同比例分布在两相中。

◆其中一个相是固定的称为固定相，另一个相是流动的，称为流动相。

◆当流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分分离纯化。

◆分离纯化酶采用的层析方法常用的有吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等，如表4-5所示。

表4-5 层析分离方法

6.1吸附层析 6.1.1吸附层析原理：

◆任何两个相之间都可以形成一个界面，其中一个相中的物质在两相界面上的密集现象称为吸附。 ◆凡是能够将其它物质聚集到自己表面上的物质称为吸附剂。吸附剂一般是固体或者液体，在吸附层析中通常应用的是固体吸附剂。

◆固体物质之所以具有吸附作用，是由于固体表面的分子（原子或离子）与固体内部的分子所受到的作用力不相同。

◆能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物。

◆吸附剂与被吸附物之间的相互作用力主要是范德华力。其特点是可逆的。即在一定条件下，被吸附物被吸附到吸附剂的表面上；而在另外的某种条件下，被吸附物可以离开吸附剂表面，这称之为解吸作用。 ◆吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。

◆层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。 ◆在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。

◆移动距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力以及洗脱挤兑该物质的洗脱能力有关。 6.1.2洗脱方法：

◆为溶剂洗脱法，置换洗脱法和前缘洗脱法等。

①溶剂洗脱法：采用单一或者混合的溶剂进行洗脱的方法，是目前应用最广泛的方法。

洗脱曲线（图4-3）。 物质 浓 度

洗脱液体积

图4-3 溶剂洗脱法的洗脱曲线 6.1.3吸附剂与洗脱剂的选择：

①吸附剂的选择：吸附层析的关键因素。目前尚无固定的法则可循。在实际应用过程中，可以根据前人的经验或者通过小样试验来确定。

◆极性物质容易被极性表面吸附；非极性物质容易被非极性表面吸附；溶液中溶解度越大的物质越难被吸附。

◆无机吸附剂和有机吸附剂。吸附剂通常由一些化学性质不活泼的多孔材料制成，比表面积很大。 ◆常用吸附剂包括：硅胶、 活性炭、磷酸钙、碳酸盐、氧化铝、硅藻土、泡沸石、陶土、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖、琼脂糖、菊糖、纤维素等。此外，还可以在吸附剂上连接亲和基团而制成亲和吸附剂。 ◆通常用于酶的分离纯化的吸附剂有硅藻土、氧化铝、磷酸钙、羟基磷灰石和活性炭等。

②洗脱剂的选择：将目的物从吸附剂上洗脱下来，要根据吸附剂的性质和被吸附物的特点来选择合适的洗脱剂。

◆对于极性组分，用极性大的溶剂洗脱效果较好。 ◆而对于非极性组分，则用非极性溶剂洗脱较佳。

◆洗脱剂的种类有：饱和烃、醇、酮、酚、醚、卤代烷、水等。 ◆洗脱剂的选择要注意下列各点：

◇洗脱剂不会与吸附剂起化学反应，也不会使吸附剂溶解。

◇洗脱剂对混合液中的各组分的溶解度大，粘度小，流动性好，容易与被洗脱的组分分离。 ◇洗脱剂要求一定的纯度，以免杂质对分离带来不利影响。 6.4分配层析

◆分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。

◆分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数，以K表示。

◆在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。

◆另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。当某溶质在流动相◆的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。其分配系数为：

固定相中溶质的浓度 K = 流动相中溶质的浓度

◆由于不同的溶质有不同的分配系数，移动速度不同，从而达到分离。 ◆分配层析主要有纸上层析、分配薄层层洗、分配气相层析等方法。 6.5离子交换层析

◆离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。

◆离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。

◆按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。

◆由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。 在溶液的pH值大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂进行层析分离； 当溶液pH值小于酶的等电点时，酶分子带正电荷，则要采用阳离子交换剂进行分离。

◆按母体物质种类的不同，离子交换剂有离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。其中某些大孔径的离子交换树脂，离子交换纤维素和离子交换凝胶可用于酶的分离纯化。

◆在一定条件下，某种组分离子在离子交换剂上的浓度与在溶液中的浓度达到平衡时，两者浓度的比值K称为平衡常数（也叫分配系数）。即：

组分离子在离子交换剂上的浓度（mol/g） K =

组分离子在溶液中的浓度（mol/mL）

平衡常数K是离子交换剂上的活性基团与组分离子之间亲和力大小的指标。

(1)离子交换剂的选择与处理

(2)离子交换层析的操作过程：

装柱、上柱、洗脱和收集、再生

6.6凝胶层析

◆凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流

动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。

6.6.1 凝胶层析的基本原理

◆凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，各组分在层析柱内同

时进行两种不同的运动。

◆一种是随着溶液流动而进行的垂直向下的移动，另一种是无定向的分子扩散运动（布朗运动）。

◆大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度

流过凝胶柱。

◆较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移

动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，

而达到分离的目的。

◆为了定量地衡量混合液中各组分的流出顺序，常常采用分配系数Ka来量度。

Ve - Vo

Ka =

VI

式中，Ve：洗脱体积，表示某一组分从加进层析柱到最高峰出现时，所需的洗脱液体积；

Vo ：外体积，即为层析柱内凝胶颗粒空隙之间的体积；

VI ：内体积，即为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积。

如果某组分的分配系数Ka= 0，即 Ve = Vo，说明该组分完全不能进入凝胶微孔，洗脱是最先流出；

如果某组分的分配系数Ka=1，即 Ve = Vo + VI，说明该组分可以自由地扩散进入到凝胶颗粒内部的所

有微孔，洗脱是最后流出；

如果某组分的分配系数Ka在0～1，说明该组分分子大小介乎大分子和小分子之间，可以进入凝胶的

微孔，但是扩散速度较慢，洗脱时按照Ka值由小到大的顺序先后流出。

酶、右旋糖酐、球蛋白等，都有其各自特定的选择曲线（如图4-6所示）。

Kav

1.0

0.5 0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0

log M

图4-6 球蛋白的选择曲线

G200 G100

6.6.2凝胶的选择与处理：

◆凝胶材料主要有葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等。

◆层析用的微孔凝胶是由凝胶材料与交联剂交联聚合而成。交联剂加得越多，载体颗粒的孔径就越小。所

使用的交联剂有环氧氯丙烷等。

（1） 葡聚糖凝胶：一般由相对分子质量4×104～20×104的葡聚糖为单体，以1，2-环氧氯丙烷为交

联剂，交联聚合而成。商品名有多种。如Sephadex 等。葡聚糖凝胶具有良好的化学稳定性，在碱性条件下

非常稳定，在0.01mol/L的盐酸中放置半年不受影响, 可以耐受120℃甚至更高的温度，广泛应用于各种物

质的分离纯化。

（2） 琼脂凝胶与琼脂糖凝胶：琼脂凝胶是一种天然多孔凝胶，其内部孔径较大，允许较大的分子

进出，因此其用作凝胶层析时的工作范围大于聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶。

（3） 聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺（CH2＝CH-CONH2）与甲叉双丙烯酰

胺（CH2＝CH-CONH-CH2-NHCO-CH＝CH2）共聚而成。商品名称有多种，如生物胶-P（Bio-gel P）等。聚

丙烯酰胺是一种惰性凝胶，适合于各种酶、蛋白质、核酸等的分离纯化。缺点是遇强酸时，会使其中的酰

胺键水解而使结构破坏。一般在pH2～11的范围内使用。

◆选择凝胶主要是依据欲分离组分的分子质量的大小。

6.6.3凝胶层析操作过程：凝胶层析的操作一般包括装柱、上柱、洗脱等过程。

6.7.亲和层析

◆亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。

酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互

补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。

◆由于生物大分子和配基之间的结合是专一性的，故选择性非常好。亲和层析技术的特点是可减少提纯步

骤。

6.7.1亲和层析母体和配基

◆在亲和层析中,作为固定相的一方称为配基(Ligand).配基必须偶联于不溶性母体(Matrix)上.母体又称为载

体或担体.

◆在亲和层析中,一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶或纤维素等作为母体.当小分子物质(金

属离子等无机辅助因子、有机辅助因子等)作为配基时，由于空间位阻作用，难以与配对的大分子亲和吻合，

需要在母体与配基之间引入适当长度的连接臂（space arm）。

◆要使不溶性母体与配基偶联或通过连接臂与配基偶联，都必须进行母体活化。即通过某种方法，如溴化

氰法、叠氮法、高碘酸氧化法、环氧化法、甲苯磺酰氯法、双功能试剂法等，使母体引入某种活泼基团，

才能以共价键与配基偶联。

6.7.2亲和层析方法：

根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为共价亲和层析，疏水层析，金属离子亲和层析，

免疫亲和层析，染料亲和层析，凝集素亲和层析等。

（1）共价亲和层析( Covalent Affinity Chromatography )

(2）疏水层析( Hydrophobic Chromatography )

（3）金属离子亲和层析 ( Metal Ion Affinity Chromatography ,)

（4）免疫亲和层析

(5)染料亲和层析

(6)凝集素(Lectin)亲和层析

6.8.层析聚焦

◆层析聚焦(chromatofocusing)是将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组

分分离的技术。

◆在层析系统中，柱内装上多缓冲离子交换剂，当加进两性电解质载体的多缓冲溶液流过层析柱时，在层

析柱内形成稳定的pH梯度。 欲分离酶液中的各个组分在此系统中会移动到(聚焦于)与其等电点相当的pH

位置上，从而使不同等电点的组分得以分离。

7.电泳分离

◆带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。

◆按其使用的支持体的不同，可以分为纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、自由电泳和等电聚焦电

泳等。

◆颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，

还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。

（1）电场强度：电场强度是指每厘米距离的电压降。又称为电位梯度或电势梯度。电场强度对颗粒的

泳动速度起着十分重要的作用。

◆根据电场强度的大小可将电泳分为高压电泳和常压电泳。

常压电泳的电场强度一般为2～10V/cm, 电压为100～500V,电泳时间从几十分钟到几十小时,多用于带

电荷的大分子物质的分离;

高压电泳的电场强度为20～200 V/cm, 电压大于500V,电泳时间从几分钟到几小时,多用于带电荷的小

分子物质的分离.

（2）溶液的pH值: 溶液的pH值决定了溶液中颗粒分子的解离程度,也就是决定了颗粒分子所带净电

荷的多少.

◆对于两性电解质而言,溶液的pH值,不仅决定颗粒分子所带电荷的种类.而且决定净电荷的数量.

电泳时,溶液的pH值应该选择在适当的数值,并需采用缓冲液,使pH值维持恒定.

（3）溶液的离子强度:溶液的离子强度越高,颗粒的泳动速度越慢. 一般电泳溶液的离子强度为0.02～

0.2 较为适宜.

（4）电渗:在电场中,溶液对于固体支持物的相对移动称为电渗.

◆在酶学研究中，电泳技术主要用于酶的纯度鉴定、酶分子量测定、酶等电点测定以及少量酶的分离

纯化。

◆主要采用的电泳技术有纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳和等电聚焦电泳等。

8.萃取分离

◆萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。

◆萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。

◆按照两相的组成不同，萃取可以分为有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取和反胶束萃取等。

8.1有机溶剂萃取

◆用于萃取的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等。例如，用丁醇萃取微粒体或线粒体中的酶；

用苯酚萃取RNA等。

◆由于有机溶剂容易引起酶蛋白和酶RNA的变性失活，所以在酶的萃取过程中，应在0－10℃的低温

条件下进行，并要尽量缩短酶与有机溶剂接触的时间。

8.2双水相萃取

◆双水相萃取的两相分别为互不相溶的两个水相。

◆双水相萃取中使用的双水相一般由按一定百分比组成的互不相溶的盐溶液和高分子溶液或者两种互不相

溶的高分子溶液组成。

◆在双水相系统中，蛋白质、RNA等在两相中的溶解度不一样，分配系数不同，从而达到分离。

表 4-8 各种双水相系统

双水相形成的条件和定量关系可用相图表示，对于两种聚合物和水相组成的系统，其相图如图4-8所

示。

聚

合 物 Q 或 盐

(%)

聚合物P(%)

图4-8 双水相系统相图

从图中可以看到，只有当P和Q的浓度达到一定时才能形成两相，

◆影响酶在两相中分配系数的主要因素有：(1)两相的组成，（2）高分子聚合物的分子量、浓度，极性等，

（3）两相溶液的比例，（4）酶的分子量、电荷、极性等，（5）温度、pH值等。对于酶在两相中的分配系

数，目前尚无成熟的理论可作为依据，需通过试验而确定。

8.3超临界萃取 ◆超临界萃取又称为超临界流体萃取，是利 T 用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度 不同而达到分离的一种萃取技术。 ◆不同的温度和压力条件下，可以以 不同的形态存在，如固体(S)、液体(L)、气体 (G)、超临界流体(SCF)等。如图4-9所示： 图4-9 超临界系统相

◆作为萃取剂的超临界流体必须具有以下条件：

◆目前在超临界萃取中最常用的超临界流体是CO2。

二氧化碳超临界点的温度为31.1℃，超临界压力为7.3 MPa ，超临界密度为0.47 g/mL。特别适用于

生物活性物质的提取分离。

◆CO2超临界萃取的工艺过程由萃取和分离两个步骤组成。

◇萃取在萃取罐中进行，将原料装入萃取罐，通入一定温度和压力的超临界CO2, 将欲分离的组分萃

取出来。

◇分离在分离罐中进行，是将目的物与超临界CO2分离的过程。根据分离方法的不同，分离工艺过程

可以分为3种:等压分离、等温分离、3，吸附分离：

8.4反胶束萃取：

◆反胶束萃取是利用反胶束将酶或其他蛋白质从混合液中萃取出来的一种分离纯化技术。

◇反胶束，又称为反胶团，是表面活性剂分散于连续有机相中形成的纳米尺度的一种聚集体。反胶束溶液是透明的，热力学稳定的系统。

(1)胶束与反胶束的形成：将表面活性剂溶于水中，并使其浓度超过临界胶束浓度（即胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度），表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体。◇通常将在水溶液中形成的聚集体胶束，称为正胶束。

◇如果将表面活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体称为反胶束。

◇反胶束系统作为液—液萃取方法，更具有选择性。其基本过程是：首先在酶蛋白相转移最佳的条件下，将酶从水相中萃取到反胶束相中。第二步，在最佳条件下，将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相的，即将酶从有机相中提取出来。

表4-10 反胶束萃取中常用的表面活性剂及其相应的有机溶剂

最常用的是阴离子表面活性剂。如，AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸乙基己基酯磺酸钠。

(2)水相pH：水相pH决定了蛋白质表面带电基团的离子化状态。

(3)离子强度：水相中的离子强度决定带电表面所赋予的静电屏蔽程度，在反胶束萃取中静电屏蔽程度会产生两个重要的效应。

9.结晶

结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。

酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定的纯度。

酶在结晶时，酶液应达到一定的浓度。结晶时酶液浓度应当控制在介稳区，即酶浓度处于稍微过饱和的状态。

结晶过程中还要控制好温度、pH值、离子强度等结晶条件。

9.1盐析结晶法：

盐析结晶是指在适当的温度和pH值等条件下，于接近饱和的酶液中缓慢增加某种中性盐的浓度，使酶的溶解度慢慢降低 ，达到稍微过饱和状态，而析出酶晶体的过程。

盐析结晶通常采用的中性盐是硫酸铵，有时也采用硫酸钠等其他中性盐。

9.2有机溶剂结晶法：

有机溶剂结晶是在接近饱和的酶液中慢慢加入某种有机溶剂，使酶的溶解度降低，而析出酶晶体的过程。 在有机溶剂结晶的过程中，首先要将经过纯化的酶液浓缩至接近饱和状态，将酶液的pH值调节到酶稳定性较好的范围，用冰浴降温至0℃左右。然后一边搅拌一边慢慢加入有机溶剂，当酶液稍微出现混浊时，将其在冰箱中放置1～2h，离心除去沉淀。在将上清液之于冰箱中，让其慢慢析出结晶。

常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、丁醇、甲醇、异丙醇、甲基戊二醇、二甲亚砜等。如L-天门冬酰胺酶可以采用加入甲基戊二醇的方法进行结晶。

9.3透析平衡结晶法：

透析平衡结晶是将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。

透析平衡结晶之前，酶液需要经过纯化达到一定的纯度。并要浓缩到一定浓度，以减少透析时间。

9.4等电点结晶法：

等电点结晶是通过缓慢改变浓酶液的pH值，使之逐渐达到酶的等电点，而使酶析出结晶的过程。 在结晶过程中，调节酶液的pH值是一定要缓慢而且均匀，以免引起局部过酸或者过碱而影响结晶。

为了取得较好的结晶效果，可以采用透析平衡等电点结晶法或气相扩散等电点结晶法，使酶液的pH值慢慢接近其等电点，而得到酶的结晶。

透析平衡等电点结晶是将浓酶液装在透析袋中，对一定pH值的缓冲溶液进行透析，使酶液的pH值慢慢改变，逐渐接近酶的等电点，而使酶结晶析出。

气相扩散等电点结晶是将酶液装在容器中，与装有挥发性酸或挥发性碱的容器一起置于一个较大的密闭容器中，挥发性酸（如乙酸、干冰等）或挥发性碱（如氨水等）先挥发到气相中，再慢慢溶解到酶液中，使酶液的pH值慢慢接近酶的等电点而结晶析出。

10.浓缩与干燥

浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。 10.1浓缩

浓缩是从低浓度酶液中除去部分水或其它溶剂而成为高浓度酶液的过程。

浓缩的方法:离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。

蒸发浓缩。

蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。在一定的真空条件下，使酶液在60℃以下进行浓缩。

在酶液浓缩中主要采用各种真空蒸发器和薄膜蒸发器。

10.2干燥

干燥是将固体、半固体或浓缩夜中的水分或其它溶剂除去一部分，以获得含水分较少的固体物质的过程。 干燥过程中，容剂首先从物料的表面蒸发，随后物料内部的水分子扩散到物料表面继续蒸发。因此，干燥速率与蒸发表面积成正比。增大蒸发面积，可以显著提高蒸发速率。

在固体酶制剂的生产过程中常用的干燥方法有：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸附干燥等。

(1)真空干燥：

真空干燥是在与真空系统相连接的密闭干燥器中，一边抽真空一边加热，使酶液在较低的温度条件下蒸发干燥的过程。在真空泵之前需要设置水蒸汽凝结收集器，以免汽化产生的水蒸汽进入真空泵。酶液真空干燥的温度一般控制在60℃以下。

(2)冷冻干燥：

冷冻干燥是先将酶液降温到冰点以下，使之冻结成固态，然后在低温下抽真空，使冰直接升华为气体，而得到干燥的酶制剂。

冷冻干燥得到的酶质量较高，结构保持完整，活力损失少，但是成本较高。特别适用于对热非常敏感而价值较高的酶类的干燥。

(3)喷雾干燥：

喷雾干燥是通过喷雾装置将酶液喷成直径仅为几十微米的雾滴，分散于热气流中，水分迅速蒸发而得到粉末状的干燥酶制剂。

喷雾干燥由于酶液分散成为雾滴，直径小，表面积大，水分迅速蒸发，只需几秒钟就可以达到干燥。 在干燥过程中，由于水分迅速蒸发，吸收大量热量，使雾滴及其周围的空气温度比气流进口处的温度低，只要控制好气流进口温度，就可以减少酶在干燥过程中的变性失活。

(4)气流干燥：

气流干燥是在常压条件下，利用热气流直接与固体或半固体的物料接触，使物料的水分蒸发而得到干燥制品的过程。

气流干燥设备简单，操作方便，但是干燥时间较长，酶活力损失较大。需要控制好气流温度、气流速度和气流流向，同时要经常翻动物料，使之干燥均匀。

(5)吸附干燥：

吸附干燥是在密闭的容器中用各种干燥剂吸收物料中的水分，达到干燥的目的。

常用的吸附剂有硅胶、无水氯化钙、氧化钙、无水硫酸钙、五氧化二磷以及各种铝硅酸盐的结晶等。可以根据需要选择使用。