黄芩总黄酮提取及纯化工艺的研究

第28卷　第11期C h i n e s eT r a d i t i o n a l P a t e n t M e d i c i n e V o l . 28　No . 11

提高后, 由于物料黏性的增加, 需加入一定浓度的乙

醇作为润湿剂, 否则影响微丸的成型, 即物料的流变学性质对挤出滚圆工艺具有重要影响, 与文献报道吻合。但其具体机理有待深入研究。3. 3　当归补血汤系祖国医学经典方剂之一, 全方由黄芪和当归两味药组成, 近年来有关其配伍、药理及药效方面的研究报道颇多

[8～10]

[7]

[3]　陆　彬主编. 药物新剂型新技术[M].北京:人民卫生出版

社, 1998, 292-294.

[4]　Be c r t L , R e m o n J P . I n f l u e n c e o f a m o u n t o f g r a n u l a t i o n l i q u i d o n

t h ed r u g r e l e a s e r a t e f r o mp e l l e t s m a d e b y e x t r u s i o n s p h e r o n i z a t i o n [J ].I n t J P h a r m , 1993, 95(1) :135-141.

[5]　Kl e i n e b u d d e P . T h ec r y s t a l l i t e -g e l -m o d e l f o r m i c r o c r y s t a l l i n e c e l -l u l o s ei n w e t -g r a n u l a t i o n , e x t r u s i o n , a n d s p h e r o n i z a t i o n[J ].P h a r m R e s , 1997, 14(6) :804-809.

[6]　陈大为, 张　莉, 高子彬, 等. 国产挤出滚圆机制备法莫替丁

微丸及其性质的考察[J ]. 中国药学杂志, 2002, 37(10) :753-755.

[7]　王文刚, 崔光华. 挤出-滚圆制微丸工艺的进展[J ].中国新药

杂志, 2001, 10(9) :661-664.

[8]　金　芳, 孙小燕. 当归补血配伍比例的比较研究[J ].中国实

验方剂学杂志, 1995, 1(1) :33-37.

[9]　黄兆胜, 危建安, 王宗伟. 当归补血汤实验研究进展[J ]. 中成

药, 2001, 23(9) :680-683.

[10]　黄兆胜, 危建安, 吴　利. 当归补血汤补血功效及其物质基础

研究(二) [J ].中药药理与临床, 2003, 19(5) :10-11.

, 该方主治气血不

足、心虚惊悸等, 具有补血、养血安神等功效。本研究用挤出滚圆技术成功制备了该复方的微丸制剂, 同时也开创了中药微丸制备的新技术, 但目前仍存在着辅料偏多、载药量低等技术障碍。如何提高载药量等问题还需进一步研究。

参考文献:

[1]　汪　芸, 姜洪芳, 汪国华. 微丸的成型性研究进展[J ]. 江西中

医学院学报, 2002, 14(1) :59-60.

[2]　黄胜炎. 口服控释制剂的类型[J ].药学学报, 1986, 21(2) :

152-153.

黄芩总黄酮提取及纯化工艺的研究

姚　干, 　何宗玉, 　方积年

1

1

2

(1. 重庆邮电大学生物信息学院, 重庆400065; 2. 中国科学院上海药物研究所, 上海201203)

关键词:黄芩; 总黄酮; 黄芩苷; 正交试验

摘要:目的:确定黄芩总黄酮提取及纯化的最佳工艺条件和参数。方法:以黄芩总黄酮和黄芩苷提取转移率作为评价指标, 采用正交试验方法进行优选。结果:黄芩总黄酮提取及纯化的最佳工艺为:取黄芩颗粒, 加10倍量水, 煎煮3次, 每次2h , 药液浓度调整至0. 25g (生药) /mL , 调p H 至2, 80℃保温60m i n , 50乙醇沉淀, 醇液调p H 至2, 80℃保温60m i n , 静置12h , 沉淀用50乙醇洗至p H 为4. 0。结论:该工艺合理、可行, 适合工业化生产。中图分类号:R 284. 2　　　　　文献标识码:A 　　　　　文章编号:1001-1528(2006) 11-1568-03

E x t r a c t i o n a n d p u r i f i c t i o n p r o c e s s o f t o t a l f l a v o n o i d c o m p o u n d s i n S c u t e l l a r i a b a -i c a l e n s i s

Y A OG a n , 　HEZ o n g -y u , 　FA N GJ i -n a n

(1. C o l l e g e o f B i o i n f o r m a t i o no f C h o n g q i n g U n i v e r s i t y o f P o s t s a n d T e l e c o m m u n i c a t i o n s , C h o n g q i n g 400065, C h i n a ; 2. S h a n g h a i I n s t i t u t e o f M a t e r i a M e d i -c a , C h i n e s e A c a d e m y o f S c i e n c e s , S h a n g h a i 201203, C h i n a )

1

1

2

K E YWO R D S :S c u t e l l a r i a b a i c a l e n s i s ; t o t a l f l a v o n o i d c o m p o u n d s ; o r t h o g o n a l e x p e r i m e n t

A B S T R A C T :A I M:T o d e t e r m i n e t h e s u i t a b l e c o n d i t i o n a n d t h e o p t i m a l p a r a m e t e r s f o r t h e e x t r a c t i o n a n d p u r i f i c -收稿日期:2005-08-24

作者简介:姚　干(1970～) , 男, 四川省阆中市人, 副研究员, 中药学博士, 博士后, 主要从事中药药效物质基础、作用机理及中药新药研究。电话:023-62471381, E -m a i l :c d y a o g a n @et a n g . c o m

第28卷　第11期C h i n e s eT r a d i t i o n a l P a t e n t M e d i c i n e V o l . 28　No . 11

t i o n p r o c e s s o f t o t a l f l a v o n o i d c o m p o u n d s i n S c u t e l l a r i a b a i c a l e n s i s . ME T H O D S :I t w a s i n v e s t i g a t e d b y o r t h o g o n a l

4

e x p e r i m e n t d e s i g n o f f o r mL 3) w i t h t h e e x t r a c t i o n p e r c e n t a g e o f t h e t o t a l f l a v o n o i d c o m p o u n d s a n d b a i c a l i n f r o m 9(S c u t e l l a r i a b a i c a l e n s i s a s t h e s t a n d a r d . R E S U L T S :T h e o p t i m a l c o n d i t i o n o f e x t r a c t i o n w a s w i t h w a t e r a s m u c h a s t e n t i m e s o f t h e m e d i c i n e a m o u n t a n d w a s b o i l e d f o r 2h a n d t h r e e t i m e s , a n d t h e o p t i m a l c o n d i t i o n o f p u r i f i c t i o n w a s a s f o l l o w s :s o l u t i o n c o n c e n t r a t i o n 0. 25g (c r u d e m e d i c i n a l m a t e r i a l s )/mL , a d j u s t i n gp Ht o 2, 80℃h e a t p r e s e r v a t i o n u p t o 60m i n , 50

a l c o h o l a s p r e c i p i t a n t a n d t h e p r e c i p i t a t e d a d j u s t e d p Ht o 4. 0. C O N C L U S I O N S :

T h e o p t i m a l p r o c e s s i s r a t i o n a l , p r a c t i c a l a n d a d a p t e d t o i n d u s t r y p r o d u c t i o n . 　　黄芩是中医临床常用中药, 具有清热燥湿、泻火解毒等功效, 其抗菌、抗病毒、抗炎等药理作用的有效成分是以黄芩苷为代表的黄酮类化合物。采用文献方法能较理想地分离黄芩苷, 但在制剂生产中存在种种局限

[2]

[1]

m L 量瓶中, 加甲醇至刻度, 超声30m i n 。取续滤液1m L , 置10m L 量瓶中, 加5m L 甲醇, 摇匀, 加5三氯化铝溶液3m L , 加甲醇至刻度, 摇匀, 室温放置40m i n , 取1m L 用甲醇稀释至5m L , 即得。3. 1. 3　最大吸收波长的确定

取对照品溶液和供试品溶液, 在紫外分光光度计上200～400n m 处进行扫描, 随行空白。结果表明, 二者峰型相似, 最大吸收波长均为290n m , 故选用290n m 作为测定波长。

3. 1. 4　线性关系考察

精密吸取对照品溶液(13. 2μg /mL ) 4, 5, 6, 7, 8m L , 置10m L 量瓶中, 加甲醇至刻度, 290n m 测定吸收度。以吸收度为纵坐标, 浓度为横坐标, 绘制标准曲线, 得回归方程:y =0. 05742x +0. 01300, r =0. 999997, 线性范围:5. 28～10. 56μg /mL 。3. 1. 5　回收率试验

取已知含量的黄芩总黄酮提取物, 精密称定, 加入黄芩苷对照品适量, 制备供试品溶液, 测定吸收度, 计算平均加样回收率为99. 06, R S D 为1. 91(n =6) 。

3. 2　黄芩苷含量测定3. 2. 1　色谱条件

[4]

。作者结合工业化生产实际, 兼

顾干膏收率和指标成分含量, 选用总黄酮和黄芩苷提取转移率作为评价指标, 对其制备工艺进行优化。

结果表明, 本文方法既能提高干膏精制度和指标成分含量, 最大限度地保留有效组分, 又能合理利用药材资源, 满足现代中药制备的要求。1　仪器与材料

A g i l e n t 1100S e r i e s 液相色谱仪, 美国安捷伦公司:U V -2401P C 紫外分光光度计, 日本岛津; A G 285分析天平(M a x 81g /210g , d =0. 01m g /0. 1m g ) , M E T T L E RT O L E D O , 瑞士; D Z F -1B 真空干燥箱, 上海跃进医疗器械厂; 数显式电热恒温水浴锅, 上海跃进医疗仪器厂。

无水三氯化铝, 高纯试剂, 上海:中国同济微量元素研究所; 甲醇, H P L C 高纯溶剂, 南京大唐化工有限责任公司; 其余试剂均为市售分析纯。

黄芩苷对照品(供含量测定用) , 中国药品生物制品检定所, 批号:7200111, 纯度100(H P L C 法) ; 黄芩, 扬子江药业集团药材库提供, 经鉴定符合《中华人民共和国药典》2000年版一部黄芩项下规定。2　统计方法

采用浙江大学唐启义创制的D P S 数据处理系统, 对实验数据进行统计分析。3　方法与结果

[3]

3. 1　总黄酮含量测定3. 1. 1　对照品溶液的制备

取黄芩苷对照品2m g , 精密称定, 加甲醇25m L , 摇匀, 加5三氯化铝溶液15m L , 加甲醇定容至50m L , 摇匀, 室温放置40m i n , 取1m L 用甲醇稀释至5m L , 即得。

3. 1. 2　供试品溶液的制备

取黄芩总黄酮提取物20m g , 精密称定, 置50

色谱柱为K R 100-5C 5μm , 4. 6m m×25018柱(m m ) , 流动相为甲醇-水-磷酸(47∶53∶0. 2) , 流速1m L /mi n , 柱温30℃,检测波长280n m , 进样量10

μL , 理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于2500。3. 2. 2　对照品溶液的制备

精密称取黄芩苷对照品适量, 加甲醇制成每1m L 含60μg 的溶液, 即得。3. 2. 3　供试品溶液的制备

取黄芩总黄酮提取物25m g , 精密称定, 置50m L 量瓶中, 加甲醇至刻度, 超声30m i n , 放冷, 加甲醇至刻度, 取续滤液1m L , 用甲醇稀释至10m L , 摇匀, 即得。

3. 2. 4　测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10

1569

第28卷　第11期C h i n e s eT r a d i t i o n a l P a t e n t M e d i c i n e

表3

变异来源黄芩苷总黄酮

A B C

误差A B C 误差

V o l . 28　No . 11

μL , 注入液相色谱仪, 测定, 即得。

3. 2. 5　线性关系考察

取对照品溶液(150. 2μg /mL ) , 以2、4、6、8、10μL 进样, 测定峰面积。以平均峰面积为纵坐标, 进样量为横坐标, 绘制标准曲线, 得回归方程:y =3451. 10827x -27. 68725, r =0. 999920, 线性范围:0. 3004～1. 5020μg 。

3. 2. 6　回收率试验

取已知含量的黄芩总黄酮提取物, 精密称定, 加入黄芩苷对照品适量, 制备供试品溶液, 测定峰面积, 计算平均加样回收率为99. 57(n =6) 。3. 3　制备工艺研究3. 3. 1　水煎煮提取

按L 3) 正交试验设计表的条件进行试验, 因9(

素水平设计见表1, 结果见表2、表3。

表1

水平123

4

正交试验方差分析(水煎煮提取)

平方和3. 73632082. 9360216. 893952. 26993. 18641760. 4281183. 930344. 3032

自由度

222

22222

均方1. 86814108. 4469426. 134951. 59321880. 2140491. 9651422. 15162

F 值0. 044. 150. 0739. 744. 15

P 值>0. 10. 1>0. 10. 1

1041. 4680139. 85

　　注:F (2, 2)=99. 00, F (2, 2)=19. 00, F (2, 2)=9. 00。0. 010. 050. 1

, R S D 为1. 32

　　直观分析表明, 在所选因素水平范围内, 提取次数对黄芩总黄酮、黄芩苷提取转移率影响最大, 提取时间影响较小, 溶媒用量影响最小。方差分析表明,

因素B 为主要影响因素, 具有显著性, 因素A 和C 不显著。故确定最优方案为A 取黄芩颗2B 1C 1, 即:粒, 加10倍量水, 煎煮3次, 每次2h 。

按上述优化条件进行3次重复性验证试验。结果, 干膏收率为39. 92(R S D 0. 73) , 提取物中黄芩苷、黄芩总黄酮:含量分别为23. 790. 63

) 、30. 78

(R S D 1. 01

为87. 70(R S D 0. 133. 3. 2　纯化精制

4

正交试验因素水平(水煎煮提取)

用量(A , 倍)

12108

4

次数(B , 次)

3

21

时间(C , 小时)

2

1. 51

(R S D ) 。

) , 提取转移率分别

) 、80. 87(R S D 0. 54

表2

试验号

123456789ⅠⅡⅢ

黄

芩Ⅰ/3苷

Ⅱ/3

Ⅲ/3R ⅠⅡ总Ⅲ黄Ⅰ/3酮

Ⅱ/3

Ⅲ/3R

L 9(3) 正交试验结果(水煎煮提取)

A [**************]96. 28199. 52194. 9165. 4366. 5164. 971. 54180. 19183. 14178. 8760. 0661. 0559. 621. 42

B [1**********]7. 50220. 06133. 1579. 1773. 3544. 3834. 79218. 04202. 04122. 12

72. 6867. 3540. 7131. 97

C 21. 511. 512121. 5213. 02200. 27177. 4271. 0166. 7659. 1411. 87195. 59183. 81162. 80

65. 2061. 2754. 2710. 93

黄芩苷87. 5972. 9935. 7079. 1870. 9949. 3570. 7376. 0848. 10

总黄酮80. 4567. 0232. 7272. 6865. 1745. 2964. 9169. 8544. 11

转移率() 转移率()

按L 3) 正交试验设计表的条件进行试验, 因9(素水平设计见表4, 结果见表5, 表6。

表4

水平123

正交试验因素水平(纯化精制)

浓度(g 生药/mL , A )

1

0. 50. 25

酸沉时p H 酸沉时保温时间醇沉浓度(B )

123

(m i n , C )

40

6080

(, D ) 405060

　　直观分析表明, 在所选因素水平范围内, 药液浓度对总黄酮、黄芩苷提取转移率影响最大, 酸沉时p H 影响次之, 酸沉时保温时间影响较小, 醇沉浓度影响最小。方差分析表明, 因素A 为主要影响因素, 具有显著性, 因素B 、C和D 不显著。故确定最优方案为A 取药液(0. 25g 生药/mL , 3B 2C 2D 2, 即:室温相对密度约为1. 15) 调p H 至2, 80℃保温60m i n , 50乙醇沉淀, 醇液调p H 至2, 80℃保温60m i n , 静置12h , 沉淀用50乙醇洗至p H 为4. 0。

按上述优化条件进行3次重复性验证试验。结果, 干膏收率为6. 93

(R S D 1. 01

) , 提取物中黄

芩苷、黄芩总黄酮:含量分别为80. 40(R S D 0. 21) 、96. 88(R S D 0. 05) , 提取转移率分别为51. 42(R S D 1. 17

) , 44. 17(R S D 1. 02

) 。

第28卷　第11期表5

试验号123456789ⅠⅡ

A 1110. 50. 50. 50. 250. 250. 25

C h i n e s eT r a d i t i o n a l P a t e n t M e d i c i n e V o l . 28　No . 11

L 34) 正交试验结果(纯化精制) 9(

B 12

3123123

C [***********]

D [***********]

黄芩苷44. 1448. 7544. 0445. 0645. 9843. 2151. 5251. 1551. 06

总黄酮37. 8941. 84

37. 8238. 6839. 5037. 1044. 2443. 9443. 81

转移率() 转移率()

4　讨论

黄酮类化合物可以与铝盐形成络合物而获得稳定的特征吸收峰

[4]

, 故本文选用铝盐络合比色法测

定黄芩总黄酮含量。结果表明该法既有较强的科学性, 又有实际工作中的可操作性和经济性。

游离黄芩苷几乎不溶于水, 难溶于甲醇、乙醇、丙酮等, 在植物体内, 黄芩苷等成分常以盐的形式存在, 在水中溶解度增大。黄芩苷具有在碱性溶液中

[5]

溶解、酸性溶液中析出的性质。因此, 我们结合预试验, 选用黄芩水提液酸沉、沉淀碱溶加醇、在醇液中酸沉的工艺路线。实验室及中试研究结果均表明, 该制备工艺可明显降低干膏收率, 显著提高黄芩总黄酮和黄芩苷含量, 易于操作。药理研究还证实, 本品具有抗甲型, 乙型流感病毒、金黄色葡萄球菌和肺炎双球菌的作用, 小鼠M T D 为203g (生药) /kg , 相当于临床成人日用剂量的677倍。这为利用常用中药开发安全、有效、质量可控的现代中药提供了新的思路。

致谢:扬子江药业集团新药研究基金资助。参考文献:

[1]　梁　英, 韩鲁佳. 黄芩中黄酮类化合物药理学作用研究进展

136. 93140. 72138. 50141. 18134. 25145. 88144. 87143. 48

73138. 31141. 54140. 25黄Ⅲ153.

芩Ⅰ/345. 6446. 9146. 1747. 06苷Ⅱ/344. 7548. 6348. 2947. 83

Ⅲ/351. 24R Ⅰ总

黄Ⅰ/3酮Ⅱ/3

R ⅡⅢ

6. 49

46. 102. 52

47. 182. 12

46. 751. 08

117. 55120. 81118. 93121. 20115. 28125. 28124. 33123. 18131. 99118. 73121. 56120. 4439. 1838. 435. 57

40. 2741. 7639. 582. 18

39. 6441. 4440. 521. 80

40. 4041. 0640. 150. 91

Ⅲ/344. 00

表6

变异来源黄芩苷总

黄酮

A B C D (误差)

A

B C D (误差)

正交试验方差分析(纯化精制)

平方和74. 32149. 97106. 76751. 843154. 7656

7. 46784. 86111. 3340

自由度22222

222

均方37. 160714. 985483. 383740. 9215427. 382813. 733882. 430540. 66698

F 值40. 325. 413. 671. 0041. 05

5. 603. 641. 00

P 值0. 05>0. 05>0. 05

>0. 05>0. 05>0. 05

[J ]. 中国农业大学学报, 2003, 8(6) :9-14.

[2]　刘彬果, 钟　蕾, 郭文勇, 等. 大孔树脂吸附法对黄芩总黄酮富

集纯化工艺的研究[J ].第二军医大学学报, 2004, 25(5) :562-564.

[3]　孙佩霞, 叶丽卡. 比色法测定淫羊藿胶囊中总黄酮的含量[J ].

沈阳药科大学学报, 1999, 16(1) :68-70. [4]　中国药典一部[S ].2000.

[5]　刘　岱, 毛宏德, 杨立新, 等. 黄芩的化学分析与质量研究进展

[J ]. 时珍国医国药, 2001, 12(10) :934-936.

　　注:F 2, 2)=99. 00, F 2, 2) =19. 00, F 2, 2) =9. 00。0. 01(0. 05(0. 1(

甘草皂苷分级泡沫分离工艺研究

苏艳桃, 　韩　丽, 　张艳艳, 　王虎山, 　马鸿雁, 　杨　明, 　邹文铨

1

1

1

1

1

1

2

(1. 成都中医药大学, 四川成都610075; 2. 四川大学分析测试中心, 四川成都610054)

关键词:分级泡沫分离; 甘草皂苷; 除杂; 精制; 工艺研究

收稿日期:2006-03-15

基金项目:国家“十五”科技攻关重点项目中药生产新工艺新技术的标准化研究———泡沫分离技术在皂苷成分分离中的应用的课题部分内容。(项目编号:2004B A 721A 43)

作者简介:苏艳桃(1981～) , 女, 湖南人, 硕士生。研究方向:中药生产新技术和新剂型研究。电话:028-87825696, E -m a i l :s u y a n t a o 1@163. c o m 。

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