黄瑞香愈伤组织培养及其二次代谢产物的研究
第31卷第3期2008年3月北京中医药大学学报
Vol.31No.3Mar.2008JournalofBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine
・199・
黄瑞香愈伤组织培养及其二次代谢产物的研究
李 银
1
王凤林 李书慧 吴立军
233
(1北京同仁堂股份有限公司科学研究所 北京100079;2武警总医院;3沈阳药科大学)
摘要:目的 运用组织培养技术对黄瑞香的愈伤组织进行诱导,对其二次代谢产物的化学成分进行
系统研究。方法 用组织和细胞培养技术进行愈伤组织培养,用制备高效液相、液2液萃取、硅胶柱层析、制备薄层层析法分离,波谱法鉴定结构。结果 从黄瑞香的二次代谢产物中分离得到了5个
β2化合物单体,分别为瑞香酮、72羟基香豆素、72羟基82O2D2葡萄糖香豆素、西瑞香素和丁香苷。
结论 首次成功诱导得到了黄瑞香的愈伤组织,确定了其最佳诱导条件;首次从黄瑞香的二次代谢产物中分离得到了C62C52C6型化合物。
关键词:黄瑞香;组织培养;二次代谢产物;化学成分中图分类号:R284.2
StudyoncalluscultureofD1giraldiiitsLIYin,WANGFeng2lin,LIShu2hui,WULi21
2
3
3
(1ScientificResearchInstitute,BeijingTiBeijing10079;2GeneralHospitalofArmedPharmacy)Abstract:veD.giraldiicallusbyusingplanetissueculturetechniqueandtosystethechemicalcomponentsoftheD.giraldiiculturedcells.Methods Highperformanceliquidchromatography(HPLC),Gelcolumnchromatography,liquid2liquidextraction,silicagelthin2layerchromatographywereusedtoisolatethecompositionsandthespectrumwasusedtoidentifythestructureofthecompositions.Results Fivecompoundswereisolatedandidentifiedasfollows:
β2daphneolone(Ⅰ),umbelliferone(Ⅱ),daphnetin282O2D2glucoside(Ⅲ),daphnoretin(Ⅳ)andsyringin(Ⅴ).Conclusion ItwasthefirsttimeusingplantcellculturetechnologytoobtainD.giraldiicallusandthebestinductiveconditionwasestablished.TheC62C52C6carbonskeletoncomponentswereisolatedfromD.giraldiiculturecellsforthefirsttime.
Keywords:D.giraldii;cultureofcallus;secondarymetabolites;chemicalconstituents
我国中药应用历史悠久,但伴随着人类文明的进步,其生存环境遭受到了前所未有的破坏,中药用植物受到破坏的程度已经开始制约我国中药现代化的发展。植物组织和细胞培养技术作为保护中药资源的重要手段之一,对于自然资源有限、生长环境要求特殊、天然生长缓慢的中药资源的保护和开发发挥着重要作用。植物组织和细胞培养作为中药研究与开发的技术平台,既有助于实现中药生产标准化的建立,又能对较高经济价值的中药材二次开发,且
能丰富中药资源的基因和种子库,对我国中药现代化的实现起着推动作用。
中药祖师麻为瑞香科(Thymelaeaceae)瑞香属植物黄瑞香(DaphnegiraldiiNitsche)的根皮和茎皮,具有“祛风除湿、止痛散瘀”之功效,主治“风湿痹痛、四肢麻木、头痛、胃痛及跌打损伤”等症
[1]
。鉴
于黄瑞香对其生长环境的要求较为苛刻,而且由于大量采挖,导致植物资源匮乏,祖师麻已被列为国家三级保护中药材。因此,我们拟利用组织和细胞培
李 银,女,硕士,主管药师
・200・北京中医药大学学报 第31卷
养技术对该植物进行研究与开发。这一研究具有重大意义。1 仪器与试药
响,实验设计的4种培养基中,在不含NH4NO3的培养基中诱导出了黄瑞香愈伤组织,表明MS培养基中的NH4NO3不适合黄瑞香愈伤组织的诱导;高浓度的2,42二氯苯氧乙酸对细胞分裂速度无明显影响,且在继代培养中阻碍愈伤组织的增长。不同温度的愈伤组织未出现形态上的明显变化,但生长量有明显差别,实验结果表明,黄瑞香愈伤组织经继代培养16周后,10、20、25、30℃下的收获量分别为最初接种量的2.1、5.2、10.4、2.1倍,此与原植物自然生长环境相符,因此,确定25℃为黄瑞香愈伤组织的最佳培养温度,在此温度下,细胞分裂速度最快,温度过高,褐化严重,细胞分裂速度减慢。本实验运用植物细胞培养技术首次建立了黄瑞香愈伤组织的培养条件。确定黄瑞香愈伤组织最佳诱导条件为:MS8+1mg/L2,42二+0.1mg/L激动
超净工作台:日本PCCTechnology株式会社;暗室培养箱:日本IWAKIGLASS公司;光照培养箱:日本IWAKIGLASS公司;温度调节培养箱:NipponMedical&ChemicalInstrument公司;高压灭菌锅:日
本TOMY公司;核磁共振波谱仪:JEOLECA2500型核磁共振波谱仪;高效液相色谱仪:岛津高效液相色
谱仪(LC210ADvp型泵、SPD210Avp型紫外检测器、RID210A型示差检测器、CTO210ACvp型柱温箱,色
μBONDASPHERE5μmC18100A谱柱:MILLIPPORE19×150mm)。CAL公司;蔗糖、琼脂粉、NH4NO3等试药均购于日
。
实验用各种生长激素均购于SIGMACHEMI2本和光纯药工业株式会社;硅胶柱色谱:WakoGDl2RC2200(和光纯药工业株式会社);Merck60(和光纯药工业株式会社,9385);硅胶薄层色谱:MERCKKCaA20cm×20cmKieselGDl60F254,20cm×20cmSilicaGDl60DAIONHP220(NIPP);素+3%+0.04%硝酸钾;pH
5.:组织形态:黄.化合物Ⅰ:无色针晶(MeOH),254nm下可观察到暗斑,TLC用10%H2SO4显棕黄色,三氯化铁2铁
20
氰化钾反应阳性,[α]D为+7.9°(c0.1062,
纯()原植物材料:,2003年9月采于陕西秦岭。22.1
(c0.1680,CHCl3)。该化合物MeOH),[α]D+6.7°
20
的C2NMR(δ)谱在sp杂化区可观察到1个酮羰基碳信号199.5,8个芳碳信号160.6、141.8、130.7、129.8、128.5、128.4、125.9、115.4,其中130.7、128.5、128.4、115.4为重叠碳信号,提示该化合物
132
方法
愈伤组织培养方法
选取具有较强生长力的黄瑞香嫩叶和茎作为实
验材料,经过灭菌后将黄瑞香嫩叶和茎制成约0.5cm长的外植体,平放在愈伤组织诱导培养基(CM、DK、D2N、D102N)上,进行暗室培养,4周继代1次。
存在部分对称结构。在sp杂化区可观察到1个连氧碳信号67.3和3个烷基碳信号44.3、38.1、
1
31.8。H2NMR(500MHz,CDCl3,δ)谱在芳香区给出对位取代苯环质子信号7.86(2H,d,J=7.9Hz),6.87(2H,d,J=7.9Hz);还给出5个芳质子信号7.15～7.30(5H,m),在HMQC谱中分别与2个叠
3
在相同的培养条件(D2N琼脂培养基、pH5.8、暗室、静止、每4周继代1次)下,考察了不同温度(10、20、25、30℃)对黄瑞香愈伤组织的影响,经16
周培养后,观察生长量的变化。2.2
碳原子128.4、128.5和125.9的碳信号相关,推测结构中存在1个单取代苯环,且与631.8的亚甲基碳相连。经查阅文献,该化合物的氢谱数据与文献[2-3]中记载的124’2羟基苯基232羟基252苯基212戊
愈伤组织二次代谢产物的提取与分离
黄瑞香培养细胞(鲜重564.24g)经粉碎后,用
甲醇提取,甲醇提取物回收至无醇味后,加入水,依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取,采用硅胶柱层析、薄层制备色谱、高效制备液相等多种色谱技术,共分离得到5个化合物。3
酮(即daphneolone)的氢谱数据基本一致,且实验测
20
(c0.1062,MeOH),得化合物Ⅰ的[α]D为+7.9°
20
(c与文献[2]daphneolone的数据[α]D+9.0°
1.01,MeOH)相符,因此鉴定化合物Ⅰ为daphneolo2
20
(c0.1680,CHCl3)与ne。化合物Ⅰ的[α]D+6.7°
结果
培养基组分对愈伤组织诱导的形成有直接影
3.1 黄瑞香愈伤组织的最佳培养条件
S2(+)232羟基21,52二苯基2122戊酮
[4]
的比旋光度
第3期李 银等 黄瑞香愈伤组织培养及其二次代谢产物的研究・201・
[α]D+34.4°比较,旋光方向相同,故鉴定3位碳原
子的构型为S型。
化合物Ⅱ:无色针晶(Acetone),365nm下可观
1
察到亮蓝色荧光,三氯化铁2铁氰化钾反应呈阳性。H2NMR(500MHz,CDCl3,δ)谱可观察到一组香豆素3,4位特征质子信号7.64(1H,d,J=9.7Hz)、6.26(1H,d,J=9.7Hz)和一组苯环AMX耦合系统质子信号7.36(1H,d,J=8.6Hz)、6.79(1H,dd,J1=8.6Hz,J2=2.6Hz)、6.82(1H,d,J=2.6Hz)。推测该化合物为72羟基香豆素或62羟基香豆
1
到暗斑,TLC用10%H2SO4显紫红色。H2NMR(500MHz,CD3OD,δ)谱在芳香区可观察到2个化学环境
相同的芳质子信号6.75(2H,s),1组反式烯氢耦合质子信号6.54(1H,d,J=16.0Hz)、6.32(1H,dt,J=16.0Hz,5.7Hz),在饱和区显示有2个化学环
13
境相同的甲氧基质子信号3.85(6H,s)。C2NMR(125MHz,CD3OD,δ)谱显示有6个芳碳信号,1组糖的碳信号以及1个甲氧基碳信号,化合物的碳氢数据与文献[7]中报道的丁香苷的碳氢数据基本一致,故鉴定化合物Ⅴ为丁香苷(syringin)。
参考文献:
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素。经与文献[4]对照,其核磁数据与文献中报道
的72羟基香豆素的核磁数据基本一致,故鉴定化合物Ⅱ为72羟基香豆素,即伞形花內酯。
化合物Ⅲ:白色粉末,365nm下可观察到黄绿色荧光,三氯化铁2铁氰化钾反应呈阳性,薄层酸水
1
解检测到D2葡萄糖。H2NMR(500MHz,DMSO2d6,δ)谱在芳香区给出1组香豆素3,4位特征质子信号6.23(1H,d,J=9.5Hz)和7.93(1H,d,J=9.5Hz),1组苯环AM耦合系统的质子信号7.31(d,J=8.6Hz)和6.87(1H,d,J=.)区3.0～5.2之间给出1子为4.96(1H,J913
糖为β构型。C15个碳信号,其中69个sp杂化碳信号。该化
2
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合物的碳氢核磁数据与文献[5]报道的72羟基282O2β2D2葡萄糖香豆素的核磁数据基本一致,故鉴定化
β2合物Ⅲ为72羟基282O2D2葡萄糖香豆素,即瑞香素2
β2β282O2D2葡萄糖苷(daphnetin282O2D2glucoside)。化合物Ⅳ:黄色粉末,365nm下可观察到蓝色荧
1
光,三氯化铁2铁氰化钾反应呈阳性。该化合物H2NMR(500MHz,DMSO2d6,δ)谱给出8个芳质子,其中有1组香豆素特征的3,4位质子信号:8.03(1H,d,J
),6.37(1H,d,J=9.4Hz,H2);1组=9.4Hz,H24’3’
苯环AMX耦合系统质子信号:7.70(1H,d,J=8.3
),7.10(1H,brHz,H25’.d,J=8.3Hz,H26’),7.17(1H,br);3个孤立芳质子信号:7.87(1H,s,H2.s,H28’4),7.20(1H,s,H25),6.86(1H,s,H28);在饱和区观
13
察到1个甲氧基质子信号3.81(3H,s)。结合C2NMR谱给出19个碳信号,除了甲氧基外,剩下的18
2
个碳信号均在sp杂化区,可推测该化合物为双香豆素。经查阅文献[2,6],该化合物的碳氢数据与文献中报道的西瑞香素的碳氢数据基本一致,故鉴定化合物Ⅳ为西瑞香素(daphnoretin)。
化合物Ⅴ:无色针晶(MeOH),254nm下可观察
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(收稿日期:2007209227)