几种结核杆菌检测方法在结核病中的诊断价值
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确实能改善精精索静脉曲张不育患者的精液质量。
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【收稿日期:2005一12—13)
几种结核杆菌检测方法在结核病中的诊断价值
马兴钢1,韩中波2
(1.吉林省临床检验中心血液科,吉林长春130000;2.吉林市结核病防治研究所检验科,吉林吉林132011)
结核病是一种较严重的传染病,目前的疫情呈上plus,片刻静置。(4)表达:向标本中加1ml帮助细升趋势。结核病的实验室诊断是发现传染源的主要胞(Helpercell),倒入平板中,加入5IIll融化的琼脂途径和手段,是确定结核病诊断和化疗方案的重要依胶(不易过热50一60℃),迅速旋转混匀,静置,37。C
据,也是考核疗效、评价治疗效果的可靠标准。痰中过夜。
结核杆菌的检测方法常规采用痰涂片及痰培养。涂结果判定:0—19个菌斑;表明阴性结果,说明片虽简单易行,但阳性率低,培养虽为金标准,但周期标本中无活着的结核杆菌;20或更多菌斑表明阳性太长,均难以满足临床需要。近年来,一些针对结核结果,说明标本中有活着的结核杆菌。
分支杆菌检测的新方法陆续报道。本文对聚合酶链1.2.3
PCR。斑点杂交法
反应(PCR)法、噬菌体裂解法、PCR-斑点杂交法,几种杂交膜的制备以INS一1(5’CGTGAGGGCATC—
结核分支杆菌检测方法的应用进行评价。
GAGGTGGC)和INS一2(5’GCGTAGGCGTCGGT—
1材料与方法
GACAAA)为引物,以BCG的DNA为模板,经PCR扩
1.1检测对象肺结核组121例肺结核病住院患者增,得到245bp扩增产物[1|。取3m点膜,晾干;碱
(经临床确诊),其中痰菌涂片阳性者49例,涂阴者72变性5min,80℃烘干10min,备用。
例钆非结核肺疾病组54例,他们中间慢阻肺者9例,标本前处理,标本加入1—2倍体积NoAc溶液,上呼吸道感染者21例,肺炎20例,其它疾病4例。
液化20min,90℃水浴30min,离心去上清,向沉淀1.2检测方法
cPJJnA.溶菌酶(promega公司)30min,加入SDS/蛋白1.2.1
PCR法
酶K
20
min。经PCR扩增,以dUTP-Dig:dTrP=3:1
华美公司生产结核杆菌PCR检测试剂盒(电泳代替反应体系中的dTrP的量(dUTP-Dig:Roche公法),按说明进行操作。司)。扩增产物变性的探针进行杂交,42℃3h。杂1.2.2噬菌体裂解法
交后洗膜加入anti.Dig-Ap(Roche公司)与探针上标试剂:英国BIOTEC公司结核杆菌检测试剂盒
记的地高辛反应。采用发光自显影技术(CDP-star:(FASTPlaque硼掣)。
Roche公司)检测杂交带。方法(1)痰标本用NALC.NAOH去污染,用15“
1.2.4改良罗氏培养法
PhageTekMBMedi
Plus冲洗,37。C过夜(菌液不用去
培养基的制备、培养及结果判定,按《结核病诊污染)。(2)感染噬菌体:向标本中加100m噬菌体断细菌学检验规程》进行。(Actiphage),37℃孵育1h。(3)杀死,IB体外游离的’1.2.5涂片法
噬菌体:向标本中加100出强效病毒(Virus01),充分直接涂片,常规抗酸染色法。[2]
震荡,静置5min。(4)中和:向标本中加5
mlMedium
2结果
万
方数据
~1202—
2.1几种检测方法对结核分支杆菌的最低检测浓度
结核杆菌菌液分别配制不同浓度(Mcfarland
3.0
浊度相当于细菌浓度107cFu/Inl)进行四种方法检测结核杆菌。培养法、PCR法、PCR.斑点杂交法、噬菌体裂解法检出最低浓度分别为103、50、20、5×102
cFu/mlo
2.2几种检测方法对涂阳、涂阴、非结核病标本的检出率
培养法的检出率分别为95.9%、18.1%、o;PCR法的检出率分别为89.8%、29.2%、1.9%;PCR一斑点杂交法的检出率分别为98.0%、43.1%、1.9%;噬菌体裂解法的检出率分别为93.9%、23.6%、0。见表1。
2.3几种检测方法的灵敏度、特异度PCR法、培养法、PCR一斑点杂交法、噬菌体裂解法检测结核杆菌其灵敏度分别为53.7%(65/121)、49.6%(60/121)、65.3%(79/121)、52.1%(63/121),特异度分别为98.1%、100%、98.1%、100%。见表1。
表1四种方法检测结核杆菌的结果
阳性数(%)
献糊馓PCR法燃点篡萎墓篓
结核组涂阳49
44(89.8)4:7(95.9)48(98.0)46(93.9)涂阴72
21(29.2)13(18.1)31(43.1)17(23.6)非结核
54
1(1.9)
o(o.0)
I(1.9)
o(o.0)
3讨论
对于肺结核的实验室诊断,涂片找抗酸杆菌还是最普及和经济的方法,但其阳性率很低(30%左右)。结核杆菌培养仍是目前诊断I坦I'B的金标准,
尤其是药敏实验结果在指导临床用药及耐药性监测
等方面具有重要作用,但其耗时太长(8一lO周)则有待改进。
万
方数据ChinJLabDiagn,October,——2——006£Vol10,No.10
培养法、PCR法、PCR一斑点杂交法、噬菌体裂解法检测结核杆菌其敏感性分别为102、50、20、3×102cFu/ml,检测浓度均低于痰涂片的检测浓度(5×103eFu/m1)。
PCR法检测结核杆菌其灵敏度为53.7%、特异度为98.1%。该方法具有敏感性高、诊断速度较快
等优点,但还存在一定程度的不稳定性。[3]3本文中出
现一例假阳性,可能是标本内抑致物引起或标本、试剂污染所致。PCR一斑点杂交法检测结核杆菌其灵敏度为65.3%、特异度98.1%。说明特异性强的DNA探针杂交与敏感性高的PCR技术相结合已成为结核病实验研究、诊断应用的一种良好途经。【4J
应用噬菌体进行结核菌的研究亦开始起步,通过实验得出噬菌体裂解法检测结核杆菌其灵敏度为52.1%\特异度为100%。该方法为结核菌的检测和生、死菌的鉴别、特别是在结核菌药物敏感性实验上的应用开辟了一个新途径。b】
本文中介绍的几种方法都具有较高的敏感性,对于结核病的诊断有较高灵敏度和特异度;随着这几种检测方法的不断成熟和完善、实验试剂的商业
化、实验步骤的标准化,这几种方法有望成为结核病实验室诊断及鉴别诊断的有效方法之一。
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(收稿日期:2005—12—18)