_聚赖氨酸抑菌机理研究

※基础研究食品科学

2009, Vol. 30, No. 0915

ε－聚赖氨酸抑菌机理研究

刘　蔚，周　涛＊

（南京师范大学食品系，江苏　南京　　　　　　２１００９７）

摘　　　要：以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、青霉为研究对象，考察ε－聚赖氨酸的抑菌作用。首先通过抑菌实验确定ε－聚赖氨酸对大肠杆菌，枯草芽胞杆菌的最小抑菌浓度均为２５ｍｇ／Ｌ，对青霉最小抑菌浓度为２００ｍｇ／Ｌ。对于不同细菌，ε－聚赖氨酸表现出相似的抑菌动力学特征。通过细胞损伤实验，研究ε－聚赖氨酸不同浓度、不同时间后对菌体造成的伤害。通过细胞形态观察以及生化检测研究ε－聚赖氨酸对细菌的抑菌机理。初步结论：当ε－聚赖氨酸作用于菌体细胞后，逐渐破坏细胞结构，最终导致细胞死亡，从而起到抑菌作用。关键词：ε－聚赖氨酸；抑菌机理；细菌；菌体细胞

Ａｃｔｉｏｎ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌε－Ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ

ＬＩＵ　Ｗｅｉ，ＺＨＯＵ　Ｔａｏ＊

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ，　Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｎａｎｊｉｎｇ　　　　　　２１００９７，　Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ε－ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，　Ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ａｎｄＰｅｎｉｃｉｌｌｕｍ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｙ．　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｃｅｌｌ　ｉｎｊｕｒｙ　ｗａｓ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｄｅｔｒｉｍｅｎｔａｌ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆｖａｒｙｉｎｇ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ε－ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ　ａｎｄ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｗｉｔｈ　ε－ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ　ａｔ　ｉｔｓ　ｍｉｎｉｍｕｍ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎ　ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ＭＩＣ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ　ａｂｏｖｅ　ｔｗｏ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｓ　ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　２５　ｍｇ／Ｌ　ａｎｄ　ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ２００　ｍｇ／Ｌ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ．　ε－Ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ　ｓｈｏｗｓ　ａｎａｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ．　Ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆ　ａｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｂｙ　ｃｅｌｌ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ　ａｎｄ　ｏｕｔｅｒ－　ａｎｄ　ｉｎｎｅｒ－ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ａｓｓａｙｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ．　ε－Ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ　ｋｉｌｌｅｄ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｂｙ　ｃａｕｓｉｎｇ　ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｂｏｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｎｅｒ　ａｎｄ　ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｓ．

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ε－ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ；ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ；ｂａｃｔｅｒｉａ；ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｅｌｌ

中图分类号：ＴＳ２０１．２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文献标识码：Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文章编号：１００２－６６３０（２００９）０９－００１５－０６

１９７７年，Ｓｈｉｍａ等［１］从土壤中分离出的一种放线菌

白色链霉菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂｕｌｕｓ３４６，发现其培养液过滤后有一种对德拉根道夫实验呈阳性的化合物，该物质经验证为一种由单一赖氨酸在α－羟基和ε－氨基形成酰胺键而连接成的聚氨基酸［２］，有２０～３０个赖氨酸单体，为ε－聚赖氨酸（ε－ＰＬ）。ε－　ＰＬ　具有很广的抗菌谱，对生长的细菌其最小抑菌浓度在１００μｇ／ｍｌ以下［３］。ε－ＰＬ作为一种天然防腐剂，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌以及霉菌等都有较好的抑制作用，具有抑菌谱广，水溶性好，安全性高，热稳定性好等优点，可以广泛应用于各类食品中，且只需要微量就可以起到很好的抑菌效果，因此基本不会改变食品的风味及质地等，此外，ε－ＰＬ的安全性也已在小鼠实验中

收稿日期：２００８－０７－０９

基金项目：江苏省教育厅高校自然基金项目（２００６０３１ＴＳＪ０１０８）

得到证实，不会对生殖、神经和免疫器官、胚胎和胎儿生长、后代的生长、两代的晶胚和胎儿的发育有毒性［４］，因此它完全可以作为一种天然、安全、高效的食品添加剂［５］。由于目前它的抑菌机理还没有被完全阐明，严重制约了其发展［６］。目前国内对ε－ＰＬ的研究多集中于筛选菌株与应用方面，对其抑菌机理方面报道较少，通过一系列抑菌实验，本实验对ε－ＰＬ的抑菌机理做了初步探究。１１．１

材料与方法菌种

大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）和枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）均由南京师范大学食品科学与工程系保存。

作者简介：刘蔚（１９８２－　），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｗｅｉ８２ｖ＠１６３．ｃｏｍ＊

16 2009, Vol. 30, No. 09

１．２

食品科学※基础研究

培养基［７］

牛肉膏蛋白胨培养基：将牛肉膏５ｇ、蛋白胨１０ｇ、ＮａＣｌ　５ｇ、琼脂２０ｇ、溶解于１Ｌ蒸馏水中。土豆汁培养基：将土豆２５０ｇ、葡萄糖２０ｇ、琼脂２０ｇ、溶解于１Ｌ蒸馏水中。１．３

试剂

ε－ＰＬ　　　　Ｓｉｇｍａ公司；碱性磷酸酶试剂盒　　　　南京建成仪器与设备

１０６ＣＦＵ／ｍｌ的菌悬液，加入１倍ＭＩＣ浓度的ε－ＰＬ溶液，以蒸馏水代替ε－ＰＬ溶液作为对照组，３７℃、１５０ｒ／ｍｉｎ培养，分别于０、１、２ｈ取样做为待测样品。１．５．４．２

扫描电镜样品制备［１１－１２］

离心待测样品，菌体沉淀用磷酸缓冲液洗涤３次，２．５％戊二醛固定２ｈ，乙醇梯度脱水，涂至金属箔片上，真空干燥固定、喷金，于扫描电镜下观察形态结构变化，蒸馏水代替ε－ＰＬ作为对照组。

１．５．４．３透射电镜样品制备［１１］

离心待测样品，菌体沉淀用磷酸缓冲液洗涤３次后分别进行以下操作：２．５％戊二醛固定２ｈ、缓冲液漂洗、２％琼脂预固定、缓冲液漂洗、锇酸固定、缓冲液漂洗、乙醇梯度脱水、丙酮梯度脱水、包埋剂浸透、包埋、聚合、修块、超薄切片、染色后透射电镜观察。１．５．５１．５．５．１

ε－ＰＬ对细胞完整性的影响ε－ＰＬ对菌体细胞壁的影响

生物工程公司。１．４

ＪＳＭ－５６１０ＬＶ扫描电镜　　　　日本电子公司；Ｈ６００－Ⅱ透射电镜　　　　日本Ｈｉｔａｃｈ公司；ＪＹ９２－Ⅱ超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司；７２２Ｎ分光光度计、ＤＤＳ－１１Ｃ电导率仪　　　　上海精密科学仪器有限公司。１．５１．５．１

方法

菌悬液的制备

分别取菌种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基与土豆汁培

养基斜面上，选择形态相同的菌落４～５个，接种于液体培养基中，分别在３７、２８℃条件下培养１６ｈ后，６０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液，菌体沉淀用已灭菌培养液稀释至菌落总数１０６ＣＦＵ／ｍｌ作为测试菌液，备用［８］。１．５．２

ε－ＰＬ对大肠杆菌、枯草芽胞杆菌，青霉的最

小抑菌浓度（ＭＩＣ）确定

将ε－ＰＬ配成浓度为４００、３００、２００、１００、７５、５０、２５ｍｇ／Ｌ溶液，不同稀释液各取１ｍｌ，菌种液取１ｍｌ，于不同试管内混合，另取一支加蒸馏水的试管只与菌种液混合，作为对照组，分别于３７、２８℃培养２４ｈ，观察菌落生长情况，以不长菌的ε－ＰＬ最低浓度为ε－ＰＬ对大肠杆菌、枯草芽胞杆菌及青霉的ＭＩＣ［９］。

抑菌活力测定

将１倍ＭＩＣ浓度的ε－ＰＬ溶液分别加入到两种菌悬液中，相应温度下１５０ｒ／ｍｉｎ摇床培养，用蒸馏水代替ε－ＰＬ溶液做为对照组，不同时间后用自动酶标仪在波长６３０ｎｍ处检测吸光度（Ａ），绘制曲线，得出活性峰出现的时间与数量。按Ｈｕｌｔｍａｒｋ［１０］等的方法计算抗菌活力。

　　　　　　　　　　　

Ａ０－Ａ１／２

Ｕ＝（————）

Ａ０

　　　　　　　　　　　　　　　

式中：Ａ０为对照组的吸光度。１．５．４１．５．４．１

ε－ＰＬ对菌体细胞超微结构的影响样品前处理

１．５．３

将１倍ＭＩＣ浓度的ε－ＰＬ溶液加入到两种菌悬液中，３７℃、１５０ｒ／ｍｉｎ摇床培养，用蒸馏水代替ε－ＰＬ溶液作为对照组，定时取样，３５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液用试剂盒方法测定碱性磷酸酶（ＡＫＰ）的含量，随时间延长检测ＡＫＰ的变化情况。

１．５．５．２ε－ＰＬ对菌体细胞膜通透性的影响

分别将１倍ＭＩＣ、２倍ＭＩＣ浓度的ε－ＰＬ溶液分别加入到两种菌悬液中，３７℃、１５０ｒ／ｍｉｎ摇床培养，用蒸馏水代替ε－ＰＬ溶液作为对照组，按照Ｌｅｅ等的方法［１３－１４］并加以改进，定时取样，测定培养液的电导率值，从而确定金属离子的渗出变化趋势。１．５．５．３

ε－ＰＬ对菌体细胞表达蛋白的影响

将１倍ＭＩＣ浓度的ε－ＰＬ溶液加入到两种菌悬液中，３７℃、１５０ｒ／ｍｉｎ摇床培养，用蒸馏水代替ε－ＰＬ作为对照组，分别于０、１、４ｈ取样，３５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取菌体沉淀，经洗涤后定量无菌水溶解，超声波细胞粉碎机破碎后离心，３５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液２０μｌ，于４℃备用，然后根据电泳样品制备步骤上样进行ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳［５］。１．５．５．４

ε－ＰＬ对细菌菌体紫外吸收物的渗透检测将１倍ＭＩＣ浓度的ε－ＰＬ溶液加入到两种菌悬液中，３７℃、１５０ｒ／ｍｉｎ摇床培养，用蒸馏水代替ε－ＰＬ作为对照组，定时取样，３５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液于紫外分光光度计２６０ｎｍ波长处测定其吸光度。２２．１

结果与分析

ε－ＰＬ对大肠杆菌（Ｅ）、枯草芽胞杆菌（Ｂ）、青霉（Ｐ）

以１倍ＭＩＣ浓度的ε－ＰＬ溶液处理大肠杆菌为例，用扫描电镜与透射电镜宏观对比处理不同时间后ε－ＰＬ对菌体超微结构的影响。

取对数生长期的细菌，３５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液，无菌缓冲液洗涤３次，并稀释成菌落总数

最小抑菌浓度的确定

※基础研究

表１　　　ε－ＰＬ对Ｅ、Ｂ、Ｐ的最小抑菌浓度

食品科学

2009, Vol. 30, No. 0917

破损情况，内溶物未溢出，折光性好（图２，０ｈ）；经ε－ＰＬ处理１ｈ后，菌体开始皱缩、无饱满感，部分细胞表面出现缢痕，同时在这些区域可以看到少量原生质向外扩散（图２，１ｈ）；经ε－ＰＬ处理２ｈ后，大部分菌体细胞干瘪，扭曲变形，表面粗糙，破裂塌陷，同时在这些区域可以看到大量原生质外泄（图２，２ｈ）。由此可见，ε－ＰＬ对大肠杆菌菌体有损伤作用，并且随着作用时间的延长，损伤作用愈加明显。２．３．２

透射电镜观察

Table 1 MICs of　ε－poly-L-lysine against E. coli, Bacillus subtilis

and Penicillium

ε－ＰＬ（ｍｇ／Ｌ）

ＢＥＰ

２５＋＋＋

５０－－＋

７５－－＋

１００－－＋

２００－－＋

３００－－＋

４００－－－

注：“＋”表示有菌落生长；“－”表示无菌落生长。

从表１可以看出，ε－ＰＬ对大肠杆菌、枯草芽胞杆菌的抑制作用较明显，最小抑菌浓度为２５ｍｇ／Ｌ，对青霉有一定抑制作用但不显著，最小抑菌浓度达２００ｍｇ／Ｌ。２．２

抑菌实验结果

１．２１．０活性（Ｕ）

０．８０．６０．４０．２００

２

４

６８时间（ｈ）

１０

１２

１４

大肠杆菌

枯草芽胞杆菌

图１　　　ε-ＰＬ对大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的抑菌动力学

Fig.1 Antibacterial kinetics of ε-poly-L-lysine again E.coli and

Bacillus subtilis

０ｈ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｈ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２ｈ图３　　　ε-ＰＬ分别处理０、１、２ｈ的大肠杆菌透射电镜图Fig.3 Transmission electron microscopy of E.coli at different

incubation time with ε

-poly-L-lysine

利用液体抑菌实验，测定ε－ＰＬ的抑菌活性与作用时间的关系，即ε－ＰＬ的抑菌动力学。ε－ＰＬ对大肠杆菌、枯草芽胞杆菌的抑菌动力学测定见图１，ε－ＰＬ与大肠杆菌、枯草芽胞杆菌作用的１２ｈ内，都基本只在２．５ｈ左右出现了一个活性峰。对于不同细菌，ε－ＰＬ表现出相似的抑菌动力学特征。２．３２．３．１

ε－ＰＬ对菌体细胞结构的影响扫描电镜观察

由图３可知，透射电镜下观察，未经处理的对照组大肠杆菌菌体细胞壁和细胞膜连续完整、光滑，结构紧密饱满，细胞壁与细胞膜紧密结合，细胞质均匀，胞内可见细胞核及核仁，核膜连续完整（图３，０ｈ）；经ε－ＰＬ作用１ｈ后，大肠杆菌部分菌体细胞开始出现皱缩，胞质不均匀，细胞壁模糊，质壁略有分离，有空泡状物及斑片状低电子密度区形成（图３，１ｈ）；经ε－ＰＬ作用２ｈ后，菌体变形、质壁严重分离，细胞质固缩加剧，凝集成块，大部分菌体细胞模糊不清甚至缺失，细胞膜破裂，有些细胞质甚至解体出现空泡结构

细胞核碎裂，细胞器溶解，胞质成碎渣样（图３，２ｈ）。２．４２．４．１

ε－ＰＬ对细胞完整性的影响

ε－ＰＬ对菌体细胞壁的影响

微生物细胞壁对维持微生物细胞生存是特有的重要的结构，这些结构不出现在人体中，因此是引起微生物失活最理想的目标，干扰微生物细胞壁的正常合成可以使菌体抗渗透压能力下降，引起菌体变形、破裂甚至死亡。

碱性磷酸酶是存在于细胞壁与细胞膜之间的一种酶，正常情况下在胞外不能检测到其活性。但当细胞壁或细胞膜遭到破坏后，透性增加，其将泄漏到细胞

０ｈ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｈ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２ｈ图２　　　ε-ＰＬ分别处理０、１、２ｈ的大肠杆菌扫描电镜图Fig.2 Scanning electron microscopy of E.coli at different

incubation time with ε

-poly-L-lysine

由图２可知，扫描电镜下，未经ε－ＰＬ处理的对照组大肠杆菌菌体细胞表面光滑、形态饱满，未有细胞

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食品科学※基础研究

外，通过检测细胞外酶的变化可以反映细胞壁的透性变化［１０，１６］。

膜流动性降低也影响细胞内外渗透压的调节，使细胞吸胀破裂受损甚至死亡。

１０电导率（×１０μｓ／ｃｍ）

７ＡＫＰ（金氏单位／１００ｍｌ）

６５４３２１００

１

２

３４时间（ｈ）

５

６

７

ＣＫ２５ｍｇ／Ｌ

９．５９８．５８７．５

０

ＣＫ２５ｍｇ／Ｌ５０ｍｇ／Ｌ

１

２时间（ｈ）

３４

图６　　　ε-ＰＬ引起的大肠杆菌细胞的细胞质渗漏

Fig.6 Cytoplasmic leakage curves of E.coli cells caused by ε-poly-L-lysine at concentrations of 25 mg/L and 50 mg/L

图４　　　ε－ＰＬ对大肠杆菌菌体细胞壁的影响

Fig.4 Effects of ε-poly-L-lysine on cell wall of E.coli

１．４ＡＫＰ（金氏单位／１００ｍｌ）

１．２１．００．８０．６０．４０．２０．０

０

电导率（×１０μｓ／ｃｍ）

ＣＫ２５ｍｇ／Ｌ

８７．５７６．５６５．５５０

ＣＫ２５ｍｇ／Ｌ５０ｍｇ／Ｌ

１２

３４时间（ｈ）

５６７

１

２时间（ｈ）

３４

图５　　　ε－ＰＬ对枯草芽孢杆菌菌体细胞壁的影响

Fig.5 Effects of ε-poly-L-lysine on wall of Bacillus subtilis

图７　　　ε-ＰＬ引起的枯草芽孢杆菌细胞的细胞质渗漏 Fig.7 Cytoplasmic leakage curves of Bacillus subtilis cellscaused by ε-poly-L-lysine at concentrations of 25 mg/L and 50 mg/L

从图４、５可以看出，ε－ＰＬ作用大肠杆菌约２．５ｈ后，作用枯草芽胞杆菌３ｈ后培养液中胞外渗出的碱性磷酸酶量开始增多，约３．５ｈ后经ε－ＰＬ作用的两种菌液中的碱性磷酸酶量达到最大值，随后趋于平稳，且远远高于对照组。该实验反映了ε－ＰＬ对两种菌的细胞壁都有一定的破坏作用，且对大肠杆菌的作用要快于枯草芽胞杆菌。这一结果与２．２中的抑菌动力学结果基本一致，该结果说明，ε－ＰＬ造成了细胞壁通透性的增加，从而破坏细胞结构的完整性。２．４．２

ε－ＰＬ对细胞膜渗透性的影响

施庆珊等［１７］指出ε－ＰＬ呈高聚合多价阳离子态，它能破坏微生物的细胞膜结构，引起细胞的物质、能量和信息传递中断，还能与胞内的核糖体结合影响生物大分子的合成，最终导致细胞死亡。

当微生物处于不利环境或受到药物毒害时，往往会导致其生物膜流动性降低和半透性丧，此时细胞内Ｋ＋等电解质大量外泻，培养液电导率的改变可以反映细胞膜渗透性的改变，这些离子的丢失导致多种代谢途径受阻，同时影响多种酶的活性以及膜的稳定性；另一方面

由图６、７可知，经ε－ＰＬ处理的大肠杆菌、枯草芽胞杆菌的培养液电导率明显高于未经处理的对照组，但２倍ＭＩＣε－ＰＬ浓度的处理组与１倍ＭＩＣ浓度组相比差别不大。随着ε－ＰＬ对菌体作用时间的延长，培养液电导率持续增加，且处理１ｈ后电导率变化的速率明显升高，这说明经过ε－ＰＬ处理的菌体细胞随着作用时间的延长均有细胞质渗漏，电解质的渗出量不断增大，可能造成细胞膜流动性降低，细胞内环境稳定性被破坏，从而导致原生质外渗，破坏菌体细胞，从而起到抑菌作用。２．４．３

ε－ＰＬ对菌体细胞表达蛋白的影响

由图８可见，ε－ＰＬ作用的枯草芽胞杆菌菌体蛋白电泳谱带与对照组枯草芽胞杆菌菌体蛋白电泳谱带，呈现明显差别。经ε－ＰＬ作用后，枯草芽胞杆菌菌体内总蛋白含量明显下降，而且随时间延长，蛋白含量的减少更加明显，如枯草芽胞杆菌的部分蛋白谱带在ε－ＰＬ作用１ｈ后与对照组相比染色很浅，作用４ｈ后颜色几乎消失。

※基础研究

４

９７．４ｋＤ６６．２ｋＤ４３．０ｋＤ３１．０ｋＤ２０．１ｋＤ１４．４ｋＤ

Ｍ

３

２

１

０

食品科学

2009, Vol. 30, No. 0919

中紫外吸收物的含量趋于稳定；由图１１可知，枯草芽胞杆菌与ε－ＰＬ作用后，渗透液中紫外吸收物含量逐渐上升，约４．５ｈ后含量趋于稳定。

０．７０．６０．５Ａ２６０ｎｍ

０．４０．３０．２０．１０．０

０

１

２

３

４

５

６

７

ＣＫ２５ｍｇ／Ｌ

０为正常枯草芽胞杆菌菌体培养０ｈ后的谱带；１、３分别为对照组枯草芽胞杆菌培养１、４ｈ后的谱带；２、４分别为处理组枯草芽胞杆菌培养１、４ｈ后的谱带；Ｍ为标准蛋白。

　图　８　受ε-ＰＬ作用的枯草芽胞杆菌的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱

Fig.8 SDS-PAGE pattern total protein of Bacillus subtilis treated

with ε-poly-L-lysine for 1 h and 4 h

时间（ｈ）

　图１０　　　ε-ＰＬ对大肠杆菌的紫外吸收物渗透性影响

０

９７．４ｋＤ６６．２ｋＤ４３．０ｋＤ３１．０ｋＤ２０．１ｋＤ１４．４ｋＤ

１２３Ｍ４

Fig.10 Effects ofε-poly-L-lysine on permeability of ultraviolet

absorbing compounds in E. coli１．００．８Ａ２６０ｎｍ

０．６０．４０．２

ＣＫ２５ｍｇ／Ｌ

０为正常大肠杆菌菌体培养０ｈ后的谱带；１、３分别为对照组大肠杆菌培养１、４ｈ后的谱带；２、４分别为处理组大肠杆菌培养１、４ｈ后的谱带；Ｍ为标准蛋白。　图９　　　受ε-ＰＬ作用的大肠杆菌的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱

Fig.9 SDS-PAGE pattern total protein of E. coli treated with ε-poly-L-lysine for 1 h and 4 h

０．０

０１２

３４时间（ｈ）

５６７

图１１　　　ε-ＰＬ对枯草芽胞杆菌的紫外吸收物渗透性影响 Fig.11 Effects of ε-poly-L-lysine on permeability of ultraviolet

absorbing compounds in Bacillus subtilis

由图９可见，ε－ＰＬ作用的大肠杆菌菌体蛋白电泳谱带与对照组大肠杆菌菌体蛋白电泳谱带，也呈现类似差别，且小分子量蛋白电泳谱带区颜色最先变浅至消失，最终细胞完全破裂后，大分子量蛋白电泳谱带区颜色才逐渐消失。

由上述分析表明，ε－ＰＬ对菌体的表达蛋白正常代谢有一定的抑制作用，且这种作用随着培养时间的增长而增强，因此可以推出，在ε－ＰＬ与菌体作用初期，细胞完整性略有破坏，小分子量蛋白最先溢出，导致细胞内小分子量蛋白缺失；随着时间的延长，至ε－ＰＬ将菌体细胞的细胞壁细胞膜完全破坏，大分子量蛋白也逐渐溢出，细胞内大分子量蛋白也最终缺失。２．４．４

细菌菌体紫外吸收物的渗透检测

正常情况下，细菌细胞壁的微孔仅容小于１ｎｍ的分子通过［１８］。本实验表明处理组在２６０ｎｍ波长处的吸光度始终高于对照组，且当细菌与ε－ＰＬ作用后随时间延长２６０ｎｍ波长的紫外吸光度显著升高。

由图１０可以看出，大肠杆菌在与ε－ＰＬ作用前１ｈ，紫外吸收物渗透速率较快，在作用约３．５ｈ后，渗透液

由此可以推测，随着细菌细胞与ε－ＰＬ作用时间的延长，细菌细胞通透性屏障受损，其核心也遭到破坏，使细胞内的组分包括具有紫外吸收特性的物质漏出，前面的实验也证明ε－ＰＬ对枯草芽胞杆菌的影响不如对大肠杆菌敏感，ε－ＰＬ需要更多时间在其细胞上形成孔道，所以较大肠杆菌而言，枯草芽胞杆菌的紫外吸收物渗出速率较慢，量稳定值出现时间较晚。３３．１

结　　论

ε－ＰＬ的抑菌谱很广，对细菌的抑制作用比对霉菌

强一些。ε－ＰＬ对大肠杆菌、枯草芽胞杆菌的抑制作用较明显，最小抑菌浓度为２５ｍｇ／Ｌ，对青霉有一定抑制作用但不显著，最小抑菌浓度达２００ｍｇ／Ｌ。对于不同细菌，ε－ＰＬ表现出相似的抑菌动力学特征。３．２

浓度为２５ｍｇ／Ｌ的ε－ＰＬ可以导致大肠杆菌和枯草芽胞杆菌细胞在１ｈ时，即出现电子显微镜可观察到的变化，如细菌细胞壁同细胞质分离，菌体塌陷，细胞质溢出等现象。３．３

浓度为２５ｍｇ／Ｌ的ε－ＰＬ处理大肠杆菌和枯草芽胞杆

20 2009, Vol. 30, No. 09

食品科学

［４］

※基础研究

菌，能够逐步破坏其细胞壁的完整性，使得碱性磷酸酶渗出，继而破坏细胞膜的完整性，使其丧失生理作用并在细胞膜上形成孔道，先导致小分子物质的渗出，使得胞外离子含量升高，当细胞膜发生崩解时，大分子物质溢出，如影响细胞内外蛋白质的合成，最终导致细胞死亡，起到抑菌作用。３．４

当ε－ＰＬ与菌体细胞膜结合后，在膜上形成孔洞，破坏微生物的细胞膜结构，导致少量细胞内容物外泄，但细胞形状保持不变，仍然存活。而后ε－ＰＬ继续与菌体细胞作用，通过膜上孔道进入细胞，进而影响细胞膜的结构和功能，破坏细菌的正常生理代谢，引起细胞的物质、能量和信息传递中断，与细胞内部物质发生作用，破坏细胞核心，造成紫外吸收物溢出，最终导致细胞死亡。但有关聚赖氨酸的抑菌机理还需要进一步的研究。

参考文献：

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