OD值与吸光度值
OD 值
1. 朗伯——比尔(Lambert -beer )光吸收定律: A =-lgT =εb c
A ——吸光度,又称光密度“O.D”。
T ——透光度, T =I / I 。, I 。——为照射到吸收池上的光强,I ——为透过吸收池的光强。
ε——摩尔吸光系数或克分子吸光系数(L·mol -1·cm -1)。
b ——样品光程(cm ),通常使用1.0cm 的吸收地,b=1cm。
C ——样品浓度(mol/L)。
由上式可以看出:吸光度A 与物质的吸光系数“ε”和物质的浓度“C”成正比。
2. DNA 和RNA 的OD 值
2.1 原理
嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键,使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰,因此核酸具有紫外吸收特性。DNA 钠盐的紫外吸收在260nm 附近有最大吸收值(图3-25),在230nm 处为吸收低谷,其吸光率(absorbance )以A260表示,A260是核酸的重要性质,RNA 钠盐的吸收曲线与DNA 无明显区别,蛋白质在280nm 处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm 处,对于纯的核酸溶液,测定A260,即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量,核酸的比吸光系数是指浓度为1μg/mL 的核酸水溶液在260nm 处的吸光率,天然状态的双链DNA 的比吸光系数为0.020,变性DNA 和RNA 的比吸光系数为0.022。据朗波-比尔光吸收定律A =-lgT =εbc知,c =A/εb,而b 通常为1cm ,所以,通常以1OD 值相当于50μg/mL 双螺旋DNA ,或40μg/mL 单螺旋DNA (或RNA ),或20μg/mL 寡核苷酸计算。
2.2 纯度
DNA 和RNA 的纯度可以通过测定260nm ,230nm 和280nm 的紫外吸收值来测定,纯的DNA OD260/280在1.8-1.9,OD260/230应大于2.0,纯的RNA OD260/280在1.9-2.0,如果DNA 比值高于1.8-1.9,可能有RNA 没有去除干净,如果DNA 比值小于1.8-1.9,可能含有酚或者蛋白质(RNA 中含有酚或者蛋白质比值也会降低),若OD260/230小于2.0说明有残存的盐或小分子杂质污染。
2.3 浓度
DNA 和RNA 的量,据朗波-比尔光吸收定律A =-lgT =εbc知测量样品的浓度为c =A/εb,又知ε=0.020,在b =1cm 的情况下,c =A/(0.020×1)=50×A ,则未稀释的样品的浓度为50×A ×稀释倍数(μg/mL )=50×A ×稀释倍数/1000(mg /mL )
2.4 注意事项:
1) 比色杯应为石英杯,玻璃杯在此波长时读数不准。
2) 检测时应使OD260值在 0.15 到1.0之间,数值比较准确。
3) 这种比值测定的方法仅仅适用于核酸浓度大于0.25ul /ml 的时候,浓度小于0.25ul /ml 的时候测量误差较大。
4) 既含有RNA 又含有蛋白质也可能使比值维持在1.8,这个时候要根据电泳情况鉴定是不是含有RNA ,或者测定一下是不是含有蛋白质;
5) A260/A280比值可提供DNA 纯度的一个参考,但A260/A280 比值会受pH 影响。如果未调pH ,比值可能与实际差别很大。如果需要准确数值,建议在10 mM Tris Cl, pH 8.5
中检测,此时纯净的DNA A260/A280比值应为1.8-2.0(注意应使用同样缓冲液作为对照)。
6) 进行OD 值测定时,分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD 值。
7) 可以在220-330 nm 之间进行扫描,此扫描可以检测是否有其它因素影响OD 260,如在
325 nm 处有吸光值说明有污染物或比色皿不干净。)
8) DNA 的量与260 nm 处的吸光度值(OD 值)成正比,在引物设计时,1个OD 值的合
成DNA 的重量约为33 mg。