固定化米曲霉发酵大豆多肽

三峡大学学位论文原创性声明

本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所

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学位论文作者签名：郭少华

日 期： 2006.6.5

目 录

摘要 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(1) 关键词 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(1) 前言 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(1)

1. 选题背景 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(3)

2. 方案论证 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(4)

3. 实验部分

3.1实验材料 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(6)

3.1.1菌种 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(6)

3.1.2培养基 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(6)

3.1.3溶剂与试剂 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(6)

3.1.4主要仪器设备 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(6)

3.2实验方法 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(6)

3.2.1大豆多肽菌种的分离及纯化 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(6)

3.2.2米曲霉菌球的制备 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(6)

3.2.3固定化方法 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(7)

3.2.4水解条件的确定 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(7)

3.2.5大豆多肽溶液的制备 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(7)

3.3发酵上清液的检测 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(7)

3.3.1 DH值(水解度) 的测定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(7)

3.3.2纸层析法分析发酵上清液中大豆多肽分子量 „„„„„„„„„„„„„„(8)

3.3.3 Folin-酚法测定大豆多肽含量 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(8)

3.3.4大豆多肽溶液的苦味评定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(8)

4. 结果分析 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(8)

4.1甘氨酸标准曲线的测定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(8)

4.2固定化方法的确定 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(9)

4.3大豆蛋白水解条件的优化 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(9)

4.4纸层析法分析发酵上清液中大豆多肽分子量„„„„„„„„„„„„„„„(11)

4.5分光光度计法定量测定大豆多肽含量„„„„„„„„„„„„„„„„„„(11)

4.6大豆多肽溶液的苦味评定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(13)

5. 小结„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(13) 致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(13) 附录„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(13) 参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(14)

固定化米曲霉发酵大豆多肽

学生:郭少华

指导老师:邵伟

三峡大学 化生学院 20021133班

摘要：大豆多肽是从大豆蛋白质中获取的最佳营养方式。由于传统的大豆多肽制备多以各种蛋白酶水解大豆蛋白为主，其蛋白酶来源有限且成本较高。米曲霉在发酵的过程中能分泌多种蛋白酶，包括内切酶和外切酶，因此可以直接用米曲霉对大豆蛋白进行降解来制备风味良好的大豆多肽。本实验对米曲霉的固定化以及固定化米曲霉来发酵大豆多肽进行初步研究。结果表明海藻酸钠的浓度为2.0%，固定化的时间为4h 为最佳固定化条件。pH 值为6、时间为84h 、接种量为10%、大豆蛋白含量为6%的条件是米曲霉发酵大豆蛋白的最佳条件。固定化细胞具有反应速度快、微生物流失少、产物容易分离、反应过程控制较容易等优点。其发酵产物中所含大豆多肽的含量比游离米曲霉的要少一些。

Abstract : Soybeen polypepetide is the best alimentation manner of soybeen proteide. Since traditional preparation of soybeen polypepetide mainly use kinds of proteide enzyme, the source of proteide enzyme is finity and high cost. In the process of ferment using by Aspergillus oryzae, Aspergillus oryzae can excrete kinds of proteide enzyme , including endoprotease and exoprotease. So, it can straightly use Aspergillus oryzae for hrdrolyzing soybenn protein to preparataion good flavor ’s soybeen polypeptie. This experimentation also pilot study immobilized Aspergillus oryzae and using immobilized Aspergillus oryzae ferment soybeen polypeptide. As a result, it indicate that pH value is six, time is 84h, inoculation is 10% and soybeen protein is 6% is the best condition of using Aspergillus oryzae ferment soybeen protein. Immobilized cell has excellences of high speed reaction, less loss microbe, easy to separate production and easy to control the process. It’s production is less than dissociation Aspergillus oryzae..

关键词：大豆多肽；固定化；米曲霉

Key words: soybeen polypepetide；immobilized ；Aspergillus oryzae

前言

大豆蛋白质丰富，氨基酸分布合理，且具降低胆固醇的作用。但是由于大豆蛋白质的分子结构复杂，80 %的蛋白质分子质量10 万以上, 大多数分子内部结构呈反行β-helix 非有序结构，分子高度压缩、折叠，从而使得大豆蛋白质消化率和生物效价远不及牛奶、蛋等动物性蛋白。但是大豆蛋白质的降解产物大豆多肽，它是由不同氨基酸排列的低分子肽混合物组成，而且大豆多肽的必需氨基酸组成与大豆蛋白质完全一致, 含量平衡且丰富，而且多肽化合物更容易被人体消化吸收，尤其是某些低分子的肽类，同时还具有防病、治病、调节人体生理机能的功效，这些功效是原大豆蛋白质及其所组成的氨基酸所不具备的。因此可以说，大豆多肽克服了大豆蛋白质在营养学上的弱点，具有比大豆蛋白质更丰富的营养和功能特性

[1]。

大豆蛋白资源丰富，氨基酸组成比较完全，是最优良的植物蛋白，是食品加工中的重要原料。为了进一步改善大豆蛋白的营养功能及其加工特性，拓宽其应用领域，充分发挥大豆蛋白质在维系人体健康方面的重要作用，提高大豆产品的附加值，把大豆蛋白有限水解，生成大豆多肽已成为许多研究者的选择[2]。

关于蛋白质改性研究的历史可以追溯到20世纪40年代，当时一些西方学者用酶法改性蛋白质来补充极其紧缺的鸡蛋。60年代以来, 随着生物技术的进步和生命科学的发展，大豆多肽的生理功能逐渐被人们所认识，一些活性肽的结构和功能逐渐明确，也进一步推动了活性肽的研究，大豆蛋白的酶法改性也成为众多学者关注的课题。美国和日本在这方面一直处于领先地位。1974年美国成立了由J.Adle-Nissen 领导的专门研究水解蛋白课题的机构；从70年代到90年代日本不二制油公司在制油副产品的开发中也致力于大豆多肽的研究，从产酶菌的选育，到水解工艺的确定，水解产物的脱苦均取得了技术上的突破。日本的Kodera Tomohiro 和Asano Minao 等也在脱苦方面进行了研究，他们不添加任何苦味吸附剂或掩盖剂，而是直接利用酶的作用，他们利用一种内切酶切除疏水性末端氨基酸，得到低苦味值的肽类产品，这种肽可以添加到食品、药品、保健品以及调味料中，并不会给产品带来不良的风味。在国外的研究中，大多数采用双酶法水解大豆蛋白(包括大豆分离蛋白和大豆浓缩蛋白) ，如Per Munk Nielsend等和Mcneil MarcelC采用Alcalase 和Neutrase 酶双酶分步酶解；J.feng 等利用Alcalase 和Flavourzyme 酶水解大豆分离蛋白，水解产物添加到肉制品中来改善肌肉组织的物理性能。M.Qi ，N.S. Hettiarachchy等利用胰蛋白酶水解大豆分离蛋白来提高其溶解性及乳化性能，水解产物可作为功能性成分添加到乳化产品或低pH 值的食品中[3]。

国内从20世纪80年代也开始了大豆多肽的开发和应用研究，华南理工大学、无锡轻工业大学、武汉粮食工业学院和中国农业大学等相继开展了对大豆蛋白的酶水解方面进行了深入的探索，已在蛋白酶的选择，酶解工艺参数，水解液的脱苦、脱盐、分离精制等方面取得了一定的进展。在水解方面，刘通讯等采用多酶协同作用对大豆分离蛋白进行水解生产大豆多肽进行了研究，最终选择多酶与Flavourzyme 酶采用分步加酶方式作为研制大豆多肽饮料的酶解条件。吴建中等对采用Alcalase 和Flavourzyme 酶双酶法分步酶解工艺来生产低苦味大豆多肽的方法进行了研究。也有人采用单一酶对大豆蛋白进行水解，如刘大川等采用碱性蛋白酶，确定其酶解条件；钱方等研究了胃蛋白酶水解大豆蛋白的水解条件，但这些水解产物苦味都比较强。另外，有人利用微生物所产蛋白酶对大豆蛋白进行酶解。据李理、罗泽民等报道，他们利用腐乳生产菌种梨形毛酶生产出的大豆多肽无任何苦涩味，可直接调配成酸性蛋白肽饮料。李理、潘进权等对液体发酵技术制备大豆多肽进行了研究。结果表明，采用液体发酵法制备的发酵液水解度较高，收率高，而且风味色泽等感官特性均优于酶法水解的产物，这一方法是制备大豆多肽的一种很有潜力的方法[4]。

要进行大规模工业化生产时需要进行液态深层发酵，但是这种方法发酵效果差，只有固态的10%左右，因而难以推广。传统的固态发酵法可为霉菌提供吸附和支持的骨架而有利于其生长代谢，细胞固定化技术，可以综合固态发酵与液态深层发酵的双重优点，有效提高发酵效果。

固定化细胞技术是指通过化学的或物理的手段，将游离细胞定位于限定的空间区域，使之成为不悬浮于水但仍保持生物活性，反复利用的方法。固定化细胞具有细胞密度大、反应速度快、微生物流失少、产物容易分离、反应过程控制较容易等优点，与游离细胞相比，明显地显示出优越性。其中微生物被固定化后， 细胞内酶系保存完整，相当于一个多酶生物反应器。这是生物工程领域的一项新技术。目前还没有人利用固定化米曲霉来发酵大豆多肽。本实验对米曲霉的固定化以及固定化米曲霉来发酵大豆多肽进行初步研究[5]。

1. 选题背景

1.1 大豆多肽的加工特性

大豆蛋白经酶法水解后, 其加工特性发生了明显的改变。如高溶解性、高稳定性、高吸湿性、低黏度、高流动性、乳化性、抗凝胶性、抗氧化性和促进微生物生长代谢等。

1.2 大豆多肽的功能特性如下：①大豆多肽营养特性及其低抗原性：大豆蛋白的7 S 和11 S 亚基有很强的抗原性，同时由于一些蛋白质酶抑制因子的存在, 使大豆蛋白消化率和生物学效价大大降低。有研究表明酶免疫测定法( EL ISA)测得大豆多肽其抗原性比SP I的大豆蛋白降低了0. 1%～1% , 所以在食用后不会产生或大大减弱了由大豆蛋白质引起的过敏反应, 可满足对大豆蛋白易发生过敏反应的人群对氨基酸的需要, 尤其适用于生产低抗原性的婴儿食品。②高吸收利用率：传统观念认为, 大豆蛋白只有经蛋白酶降解成氨基酸后才能为人体消化吸收利用。而现代医学大量研究表明, 大豆多肽可为人体直接吸收利用, 特别是一些短肽(如二肽或三肽) 比同样氨基酸组成的蛋白质吸收利用率更高、更快。因此, 多肽具有比蛋白质更容易利用的优点。③具有降低胆固醇含量，降血压、促进脂肪代谢，促进钙吸收，促进蛋白质的合成和抗疲劳作用等保健作用。

大豆多肽因易为人体消化吸收利用、较好的稳定性和良好的物理加工特性以及诸多的功能特性而成为当前食品科学研究中的热点。由于多肽不仅能为人体提供生长发育所需氨基酸、能量等, 还具有防病、治病和提高人体免疫能力等功效, 特别是近些年来, 多肽生理功能受到普遍重视。 随着多肽功能特性与结构之间关系的明了, 活性肽的研究将成为大豆蛋白深加工的一个重要的研究方向。随着人们生活水平的提高, 对食品营养需求的增强, 多肽产品也将具有广阔的市场前景。美国和日本已有各种功能性肽类食品问世，但我国目前还无此类产品上市。主要有两个因素制约了肽类食品的产业化：一是成本居高不下，二是苦味造成的口感不适性。大豆来源广泛，价格低廉，如果使用食品级的米曲霉发酵大豆蛋白质溶液生产大豆多肽，可以大大降低生产成本[6]。

2. 方案论证

2.1 固定化方案的论证[7]

任何一种限制细胞自由流动的技术，都可以用于制备固定化细胞。目前用于制备固定化细胞的方法种类繁多。新方法也层出不穷。加之，不同的研究者采用不同的分类方法。因此， 很难对此作出精确的分类。但是，根据大多数研究者的意见，大体可以分成吸附法、包埋法、共价结合法，交联法等几大类。其中以包埋法使用最为普遍。

很多细胞都具有吸附到固体物质表面，或其他细胞表面的能力。这种吸附能力可以是天生具有的， 也可以是经过处理诱导产生的。依靠这种吸附能力，人们发展起许多廉价而又有效的固定化方法。吸附法又可以分为如下两类：①表面吸附法：很多类型的微生物细胞， 具有吸附在同体物质表面的天然倾向供吸附细胞用的载体， 都是多孔性物质， 包括高岭土、硅藻土、多孔硅、聚氯乙烯碎片、活性炭， 木屑、离子交换树脂、多孔玻璃等。这种方法早在1820年就用于由酒精生产“速酿酸”。曾有人用此法生产啤酒、酒精和污水处理等方面。②细胞聚集法：某些细胞具有形成聚集体或絮凝物颗粒的倾向。当将它们进行长时间的悬浮培养、细胞浓度很高时，这种倾向更为明显。某些酵母菌株， 包括酿酒酵母，就能形成聚集体，可以置于连续塔式反应器内生产酒精。甚至某些细菌，如运动发酵单胞菌的某些菌株，在剪切力很高的流化床反应器内，也能形成絮凝物颗粒，用于生产酒精 。上述细胞聚集体或细胞絮凝物颗粒，在柱式反应器内，非常稳定。由于细胞浓度很高， 因而表现出很高的生物转化速率。

包埋法是细胞固定化最常用的方法。包埋法可以分为凝胶包埋法和微胶囊法两种。凝胶包埋法又分为聚丙烯酰胺凝胶法、海藻酸钙凝胶法、卡拉胶法、琼脂糖胶法等。凝胶包埋法常用的试剂有聚丙烯酰胺、海藻酸钠和氯化钙、卡拉胶还有琼脂糖胶。此法具有良好的化学的、机械的和热的稳定性。千烟一郎早在1973年采用此法固定大肠杆菌，实现工业化生产L-天门冬氨酸 。近年米，这种方法广泛地用于生产L-苯果酸、L-色氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨

酸、L-瓜氨酸、青霉素G 、6-APA 、衣康酸、d-酒石酸、蛋白酶、q-淀粉酶、甾体激素、NADP 、CoA 等各种代谢产物。微胶囊法是利用半通透性聚合物薄膜将细胞包裹起来，形成微型胶囊， 直径一般在1～100µm 微胶囊法叉可分为界面聚合法、液休

干燥法、分相法、液膜法等几种。有人用此法处理工业废水 ， 也有人用于固定动物胰岛细胞， 进行治疗糖尿病的研究。

共价结合法是利用细胞表面的反应基团，如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等，与已活化的无机载体或有机载体相反应，形成共价键，而成为固定化细胞有人利用此法将卡尔酵母固定在已活化的多孔玻璃珠上。也有人利用此法将藤黄小球菌固定在琼脂糖胶珠的羧基上 。虽然细胞已经死亡，但仍然保留生产尿刊酸的活性。利用此法制备的固定化细胞，细胞大多已死亡。

交联法是利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团(例如氨基、酚基、巯基．咪唑基等) 发生反应， 使细胞彼此交联，形成网状结构，即成固定化细胞 常用的交联剂有戊二醛、甲苯二异氰酸酯、双重氮联苯胺等。千烟一郎曾用此法制得具有天门冬氨酸酶活力的固定化大肠杆菌细胞。也有人用此法制得具有葡萄糖异构酶活力的固定化细胞。 比较以上方法再根据现有的实验条件及实验经验下可选择包埋法，此法既方便又简单，可谓上选。

2.2多肽脱苦方案论证

在大豆多肽成为人们研究热点的同时，多肽脱苦的研究也成为研究的热点之一。酶水解的各种蛋白质经常表现苦味的原因是形成了苦味肽，大部分苦味肽的苦味是其中的疏水性氨基酸引起的。在完整的球蛋白分子中，大部分疏水性侧链藏在内部，它们不接触味蕾，让人感觉不到苦味。当蛋白质水解时，肽链含有的疏水性氨基酸暴露出来，能够接触味蕾产生苦味。随着水解进程的继续，越来越多的疏水性氨基酸侧链暴露出来使苦味增加。而且，这些肽的苦味与疏水性氨基酸的含量及次序有密切的关系[8]。

1972年，日本学者首先阐明其结构和苦味肽之间的关系，并提出了去除苦味的方法：如外肽酶水解和类蛋白反应等，脱苦的基本原理都是去除或掩盖蛋白水解物中的疏水氨基酸。就如何祛除和改善蛋白酶水解液的苦味，大致有以下几种方法[9]：

①选择分离法：利用苦味肽的性质，采用吸附剂，如活性炭、葡聚糖、琼脂、玻璃纤维等吸附作用脱除苦味；也可以利用一些有机溶剂，如乙醇、丙醇、丁醇等抽提出苦味肽；另外也可以利用疏水性多肽在水溶液的不稳定性，可以通过调节水溶液的pH 值使其优先沉淀除去，对于具体的某一类活性肽的性质中也可以根据分子量的不同用超滤膜除去苦味肽分子。

②掩盖法：据研究，有许多物质对于蛋白水解物的苦味有掩盖作用，通过适量添加这类物质可以达到降低苦味阈值的目的。Tokita 在酪蛋白溶液中添加聚磷酸盐可有效降低水解物的苦味。Nissen 等发现添加柠檬酸、苹果酸等有机酸能有效降低水解物之苦味。Tamura 等则发现环糊精、淀粉、酸性氨基酸对某些蛋白质的苦味有掩盖作用。

③酶法。以前的研究表明，大多苦味肽含有较多的疏水性氨基酸，而且主要位于苦肽的末端。如果切除此类疏水性氨基酸则苦肽的苦味明显降低。最近的研究也表明，通过多种蛋白酶的混合作用可以有效地降低蛋白水解物的苦味阈值。因此，可以采用外切多肽酶切除苦肽两端的疏水性氨基酸而达到脱苦的目的，即可以通过选用合适的蛋白酶及外切酶，在它们的共同作用下降低蛋白水解物的苦味。

④利用类蛋白反应。此反应是利用游离氨基酸，肽含量多的环境下，肽生成一种加和产物，是一种无苦味的类蛋白。因此通过改变水解物的条件使之形成类蛋白可以达到脱苦的目的。

⑤微生物脱苦法。由于某些微生物可以分泌多种蛋白酶，包括内切酶和外切酶，因此可以直接用微生物对大豆蛋白进行降解来制备风味良好的大豆多肽。

在众多的脱苦方法中，微生物酶法脱苦成为最具有发展前景的脱苦方法。微生物生长快，

发酵周期短，产量大，比动植物来源的酶成本低。而且酶的反应条件温和，容易控制，不会引起氨基酸分解，使营养成分减少。因此，本实验选用米曲曲霉酶法来降低大豆多肽溶液的苦味值。

3. 实验部分

3.1 实验材料

3. 1. 1 菌种： 米曲霉(Aspergillus oryzae) 菌株（三峡大学微生物实验室保藏）

3. 1. 2培养基制备：

①马铃薯培养基：淀粉10克，葡萄糖4克，琼脂3克，水200mL ，自然pH 值。经0.1MPa 蒸汽灭菌30min 备用。

[10]②斜面培养基，种子培养基：葡萄糖2 g，蛋白胨1 g, 牛肉膏1 g, 酵母膏0.15 g, MgSO4

0.1 g, K2HPO 4 0.2 g, 蒸馏水100 mL, 琼脂1.5 g，pH 6.5～7.0。0.1MPa 蒸气灭菌30min 备用。

[11]③发酵培养基：分离蛋白4，5，6克，加蒸馏水至100ml ，自然pH 值。经0.1MPa 蒸汽灭菌30min

备用。

3.1.3 溶剂与试剂：

2%海藻酸钠的6%PVA溶液、1%氯化钙的5%硼酸固定液、0.9%氯化钠溶液、浓盐酸、甘氨酸、40%（V/V）乙醇、盐酸奎宁溶液、碳酸钠、氢氧化钠、无水硫酸铜、酒石酸钾钠、钨酸钠、钼酸钠、磷酸、硫酸锂、可溶性淀粉、电极缓冲液、茚三酮显色剂、Folin-酚试剂甲、Folin-酚试剂乙、还原型谷胱甘肽等。

茚三酮显色剂：水合茚三酮0.5克，十水磷酸氢二钠10克及磷酸二氢钾6克，果糖0.3克，定容至100mL 。

电极缓冲液：四硼酸钠pH9.10，邻苯二甲酸氢钾pH4.0。

Folin-酚试剂甲：贮液A （4g/100mL Na 2CO 3）, 贮液B(0.2mol/L NaOH), 贮液C(1g/100mL CuSO 4·5H 2O), 贮液D(2g/100mL酒石酸钾钠) 。临用前将A 与B 等体积混合成为碳酸钠-氢氧化钠溶液，C 与D 混合配成硫酸铜-酒石酸钾钠溶液。然后将这两种试剂按50:1的比例混合成为Folin-酚试剂甲。

Folin-酚试剂乙：取钨酸钠100g 、钼酸钠25g, 置于2000mL 磨口回流装置内，加蒸馏水700mL 、85%磷酸50mL 和浓盐酸100mL 。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h （烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液贱出），再加入硫酸锂150g, 蒸馏水50mL 及液溴数滴，在通风橱中开口煮沸15min ，以除去多余的溴。冷却后定容至1000mL ，过滤即成Folin-酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色。置棕色瓶中，可在冰箱长期保存。

3.1.4主要仪器设备

恒温培养箱、恒温振荡器、超净工作台、显微镜、蒸汽灭菌器、数字pH 计、7230G 分光光度计等。

3.2实验方法

3.2.1大豆多肽发酵菌种的分离及纯化[12]

将已制备好的马铃薯培养基倒入已灭过菌的培养皿中。在超菌工作台上用接种环取一环储藏的米曲曲霉菌种于无菌水中制成米曲霉的菌悬，接着划平板，最后将其置于30℃的恒温培养箱中。培养3天后，再进行平板划线分离和镜检。反复进行几次，即可得到品质较好的用于发酵大豆多肽的菌种。

3.2.2 米曲霉菌球的制备[13]

①菌种的斜面培养：在超净工作台下取出米曲霉用接种环挑取少量接种到斜面培养基上

放入恒温培养箱在30℃下培养24-36h 。

②菌体的种子培养：在1000m1三角瓶中装入100-200ml 培养液，于0.1MPa 蒸汽压下灭菌30min 。接入一定量菌悬液后于30℃下摇床上以120r/min的转速振荡培养35～40h ，得到直径为1～2mm 的浅黄色菌球，下摇床后备用。

③菌体的破碎：将装有米曲霉菌体的三角瓶直接放入超声波清洗器中破碎3至5个小时。

3.2.3 固定化方法[14]

①海藻酸钠浓度对固定化菌体的影响

将用0.9%生理盐水浸泡后破碎的菌体加入含海藻酸钠浓度为0.1% 、0.5% 、1.0% 、1.5% 和2.0%的6%PVA溶液充分混合后在用注射器将其一滴一滴的加到含1%氯化钙的5%硼酸溶液中进行4h 以上的固定化。固定化后过滤，用0.9%的无菌生理盐水冲洗菌体中未固定化的载体，反复进行三次。

②固定化时间的选择

在实验过程中，菌体固定化过程中存在着酶脱落和失活之间的矛盾。固定化时间短，酶活损失小，酶活保留率相对较高，但在使用过程中酶容易脱落，酶的使用稳定性差；固定化时间长，酶活损失大，酶活保留率低，但在使用过程中酶不容易脱落，酶的使用稳定性好。为了考察不同固定化时间的影响，将用0.9%生理盐水浸泡后搅碎的菌体加入固定液中，分别固定3、4、5、6、7和8h 。过滤，用0.9%的无菌生理盐水冲洗菌体中未固定的试剂。

3.2.4 水解条件的确定[15]

以大豆分离蛋白的浓度、pH 值、温度、时间进行四因素三水平的正交试验来确定其最佳培养条件。采用L9(34) 正交试验表。

表1 正交试验表L9(3)

4

3.2.5 大豆多肽溶液的制备

按6%～10%的接种量分别接到摇瓶发酵培养基中（500mL 三角瓶, 底物浓度4%～6%），于30℃，pH6～8,120r/min摇瓶培养36h,60h,84h ，得到的发酵液经5000r/min离心30min 后的上清液就是大豆多肽溶液。

3.3 发酵上清液的检测

3.3.1 DH 值(水解度) 的测定[16]

（1）标准曲线的绘制 取0.1000克干燥过的甘氨酸溶于蒸馏水后定容至100mL, 取出2.00mL 定容至100mL, 得20mg/L的溶液, 再取出此溶液稀释成含量为2～20µg/mL的溶液用于标准曲线的绘制。取2.00mL 测定, 用稀释液于试管中加入1.00mL 显示剂, 混合均匀后沸水浴中加热15min, 同时作空白试验, 用比色皿以空白管调零于570nm 处测定A 值。

（2）水解蛋白液中-NH2基含量的测定 取水解蛋白液0.50mL 定容至50mL, 取0.40mL 稀释

液于试管中并加入1.60mL 蒸馏水和1.00mL 显色剂混匀后置于沸水浴中加热15min, 同时作空白试验，以后操作同标准曲线。利用标准曲线计算出水解蛋白液中-NH2基的含量（mmol/L）。

（3）水解度的计算 在计算水解蛋白的h 值时，因原料蛋白中尚有一定量的-NH2基，所以必须考虑到它们的影响，取原料大豆蛋白进行测定时发现其游离-NH2基的含量为

0.33mmol/g蛋白，与氨基酸组成分析结果相近，故此计算DH 值时必须扣除此值。则DH 值可表示为：

DH=[ ( 水解蛋白-NH2含量-0.33mmol/g)/(7.8mmol/g) ]×100%

3.3.2 纸层析法分析发酵上清液中大豆多肽分子量

（1）点样：滤纸一边2.5厘米处划线，在线上等距离划6个点毛细管吸样品（约2cm 高）点样，直径小于0.5cm ，电吹风吹干，重复一次。

（2）层析：将滤纸垂直放置在培养皿中，盖紧缸盖，层析只2/3～3/4处取出滤纸，电吹风吹干，划前沿线。

（3）显色：喷雾器均匀喷上茚三酮溶液，电吹风吹干至看到彩色斑点。

3.3.3 Folin-酚法测定大豆多肽含量[17]

（1）取16mm ×150mm 试管11支，标明号码，放置在试管架，在1～11号试管内分别加入标准谷胱甘肽（0.3mg/mL）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL ，补足重蒸水至每管总体积1.0mL 。

（2）在试管内分别加入待测样品100μL ，并补足重蒸水至每管总体积1.0mL 。

（3）加入5.0mL 新配制的试剂甲，立即摇匀，在室温下放置10min 。

（4）各管中加入0.5mL 试剂乙（1mol/L），充分混合，然后在室温下放置30～60min 。

（5）将标准样与待测样品在可见光光度计上比色。

（6）根据已知含量的标准样品测得的光吸收值做标准曲线，然后根据待测样品的光吸收值在标准曲线上查出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算出发酵上清液中所含大豆多肽的含量。

3.3.4 大豆多肽溶液的苦味评定[18]

感官评定小组由5人组成。评定员用蒸馏水漱口之后, 取待评定液2～3mL 置于口中, 10 s 后吐出; 漱口后取与之苦味程度相近的标准液品尝, 如确认两苦味相近, 即可将待评定液的苦味值定为该标准液的苦味值, 否则需取其他标准液再尝, 直至确定苦味值。结果取5 人评定值的平均值。以奎宁为基准物质, 按L. Mogen sen 和J. A dler2N issen的方法配置标准液。经评定当标准液浓度为c (c= 3×10-6mol/L 时, 刚好无苦味, 定c 值为下限, 32c 为上限(此时若再增加奎宁浓度, 苦味基本上不再增加) , 在c ～32c 之间, 奎宁浓度成倍增加, 苦味值也相应增加。据此设定评分标准见表1。

表2 枯味评分标准

注 c=3×10mol/L

4. 结果分析

4.1 甘氨酸标准曲线的测定

将甘氨酸标准品在可见光谱范围内扫描，测得它在570nm 波长处有一吸收峰, 故将分光光度计的波长调节到570nm 处对该标准样品进行测定，测定结果见表2：

表3 不同浓度的甘氨酸溶液A-C 关系

c （µg/mL） 0 2 4 6 8 10 15 20 A 0.000 0.084 0.186 0.270 0.335 0.468 0.660 0.902 根据甘氨酸标准品的测定结果绘制甘氨酸标准曲线见图1

甘氨酸的含量(ug/ml)

图1甘氨酸标准曲线

4.2 固定化方法的确定

4.2.1 海藻酸钠浓度的确定

将用0.9%生理盐水浸泡后破碎的菌体加入含海藻酸钠浓度为0.1% 、0.5% 、1.0% 、1.5% 和2.0%的6%PVA溶液充分混合后在用注射器将其一滴一滴的加到含1%氯化钙的5%硼酸溶液中进行4h 以上的固定化。固定化后过滤，用0.9%的无菌生理盐水冲洗菌体中未固定化的载体，反复进行三次。其中海藻酸钠浓度0.1%,0.5%的固定化小球在120r/min的摇床上培养一夜就消失了。可见是其机械化强度不够而引起的。经过连续三天的发酵后，测定由海藻酸钠浓度分别为1.0% 、1.5% 和2.0%而制成的固定化小球发酵后的水解液的水解度。测定结果:7.9%,8.1%,9.3%。故选择海藻酸钠的浓度为2.0%。

4.2.2 固定化时间的选择

用0.9%生理盐水浸泡后搅碎的菌体加入固定液中，分别固定3、4、5、6、7和8h 。过滤，用0.9%的无菌生理盐水冲洗菌体中未固定的试剂。经过连续三天的发酵后，测定其水解液的水解度。测定结果:6.7%、8.2%、7.5%、7.0%、6.1%、5.4%、5.2%。所以选择固定化的时间为4h 。

4.3 大豆蛋白水解条件的优化

以大豆蛋白浓度、pH 值、温度、时间进行四因素三水平的正交试验来确定其最佳培养条件。采用L9(34) 正交试验表，结果见表3、表4。由正交实验结果可知，发酵的最佳条件为A1B3C3D3，即pH 值为6、时间为84h 、接种量为10%、大豆蛋白含量为6%的条件是米曲曲霉发酵大豆蛋白的最佳条件。从极差R 的大小看出，因素B （发酵时间）是影响酸溶性多肽含量最大的因素，其次是因素C （接种量），因素D （底物浓度）极差最小，是四因素中相对不重要的因素。

表4 固定化米曲霉发酵大豆多肽正交试验结果

表5 游离态米曲霉发酵大豆多肽正交试验结果

由表3和表4中水解度的数据可绘制图2如下:

图2 固定化与游离态米曲霉发酵大豆多肽水解度的比较

由图2可以直观的看出经过固定化后的米曲霉比游离态的米曲霉的水解效果要差一些, 但反应速度却要快一些。同时在实验过程中还可以看出固定化细胞具有微生物流失少、产物容易分离、反应过程控制较容易等优点。

4.4纸层析法分析发酵上清液中大豆多肽分子量

将大豆多肽标准样品、谷胱甘肽标准品、酪氨酸以及固定化米曲霉发酵大豆多肽的9种样品采用纸上色谱分离法来对发酵上清液中的大豆多肽物质进行分离。纸层析分离发酵上清液后显色情况见图3。

大豆 谷胱 酪 7 8 9 大豆 谷胱 酪 4 5 6 大豆 谷胱 酪 1 2 3 多肽 甘肽 氨 多肽 甘肽 氨 多肽 甘肽 氨 标准 标准 酸 标准 标准 酸 标准 标准 酸 品 品 品 品 品 品

1: pH6,时间36h, 接种量6%,底物浓度4%; 2: pH6,时间60h, 接种量8%,底物浓度5%; 3: pH6,时间84, 接种量10%,底物浓度6%; 4: pH7,时间36h, 接种量8%,底物浓度6%; 5: pH7,时间60h, 接种量10%,底物浓度4%; 6: pH7,时间84h, 接种量6%,底物浓度5%; 7: pH8,时间36h, 接种量10%,底物浓度5%; 8: pH8,时间60h, 接种量6%,底物浓度6%； 9: pH8,时间84h, 接种量8%,底物浓度4%。

图3 纸层析分离发酵上清液显色图谱

由图3可以直观的看出样品中确含有大豆多肽。 4.5分光光度计法定量测定大豆多肽含量 4.5.1谷胱甘肽标准品（0.3mg/mL）的测定

将谷胱甘肽标准品在可见光谱范围内扫描，测得它在450nm 波长处有一吸收

峰, 故将分光光度计的波长调节到450nm 处对该标准样品进行测定，测定结果见表5：

表6 谷胱甘肽标准品吸光度的测定

试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 谷胱甘肽浓度/(mg/mL) 0 0.03 0.06 0.09 0.12 0.15 0.18 0.21 0.24 0.27 0.30 OD 值 0 0.027 0.061 0.085 0.120 0.157 0.182 0.198 0.225 0.256 0.28

根据谷胱甘肽标准品（0.3mg/mL）的测定结果绘制谷胱甘肽标准曲线见图4：

O D 值

谷 胱甘 肽 浓度/（mg/mL）

图4 谷胱甘肽标准曲线

4.5.2 待测样品的测定

将待测样品取样稀释，取1mL 待测样品，加重蒸水9mL 进行稀释，由固定化米曲霉发酵大豆多肽所得待测样品试管编号分别为1～9，而经游离态米曲霉发酵大豆多肽所得待测样品试管编号分别为10～18，样品测定结果见表6、表7。

表7 固定化米曲霉发酵大豆多肽所得待测样品吸光度的测定

试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 OD 值 0.111 0.237 0.272 0.163 0.211 0.251 0.132 0.101 0.191

试管1: pH6, 时间36h, 接种量6%,底物浓度4%; 试管2: pH6, 时间60h, 接种量8%,底物浓度5%; 试管3: pH6, 时间84, 接种量10%,底物浓度6%; 试管4: pH7, 时间36h, 接种量8%,底物浓度6%; 试管5: pH7, 时间60h, 接种量10%,底物浓度4%; 试管6: pH7, 时间84h, 接种量6%,底物浓度5%; 试管7: pH8, 时间36h, 接种量10%,底物浓度5%; 试管8: pH8, 时间60h, 接种量6%,底物浓度6%； 试管9: pH8,时间84h, 接种量8%,底物浓度4%。

表8 游离态米曲霉发酵大豆多肽所得待测样品吸光度的测定

试管号 10 11 12 13 14 15 16 17 18 OD 值 0.133 0.251 0.298 0.181 0.223 0.267 0.153 0.114 0.214

试管10: pH6, 时间36h, 接种量6%,底物浓度4%; 试管11: pH6, 时间60h, 接种量8%,底物浓度5%;

试管12: pH6, 时间84, 接种量10%,底物浓度6%; 试管13: pH7, 时间36h, 接种量8%,底物浓度6%; 试管14: pH7, 时间60h, 接种量10%,底物浓度4%; 试管15: pH7, 时间84h, 接种量6%,底物浓度5%; 试管16: pH8, 时间36h, 接种量10%,底物浓度5%; 试管17: pH8, 时间60h, 接种量6%,底物浓度6%； 试管18: pH8,时间84h, 接种量8%,底物浓度4%。

由谷胱甘肽标准曲线可查得待测样品中所含大豆多肽的含量，所查结果见表8。

表9 待测样品中大豆多肽含量(mg/mL)

试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 多肽含量 1.207 2.245 2.534 1.636 2.031 2.361 1.380 1.125 1.866

试管号 10 11 12 13 14 15 16 17 18 多肽含量 1.451 2.428 2.816 1.761 2.148 2.510 1.571 1.249 2.073

表9所显示数据可绘制图5如下:

图5 固定化与游离态米曲霉发酵上清液中多肽含量的比较

表9所显示数据基本上与水解度的相同, 从而进一步证明上面结果的正确性。 4.6 大豆多肽溶液的苦味评定

浓度分别为c ～32c 的盐酸奎宁溶液作为标准对不同发酵液的上清液进行评分, 参照表1所示的苦味评分标准通过感官品尝得到大豆多肽溶液的苦味情况见表8。

表10 大豆多肽苦味评定结果

试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 苦味值（分值） 4.5 2 1 3.5 2.5 1.5 4 5 3 试管号 10 11 12 13 14 15 16 17 18 苦味值（分值） 4.5 2 1 3.5 2.5 1.5 4 5 3

由表10可以看出, 在最优水解条件下的水解液的味最小。由此可说明米曲霉发酵大豆多肽能达到更好的脱苦效果。

6. 小结

经过此次实验可得出固定化的最优条件为海藻酸钠的浓度为2.0%,固定化的时间为4h 。pH 值为6、时间为84h 、接种量为10%、大豆蛋白含量为6%的条件是米曲曲霉发酵大豆蛋白的最佳条件。经过固定化后的米曲霉比游离态的米曲霉的水解效果要差一些, 但反应速度却要快一些。同时在实验过程中还可以看出固定化细胞具有微生物流失少、产物容易分离、

反应过程控制较容易等优点。在最优水解条件下米曲霉发酵大豆多肽能达到更好的脱苦效果。由此可说明固定化米曲霉可用于发酵大豆多肽。

致谢

在毕业设计过程中指导老师邵伟老师给了我不少的启发和帮助。在此，我要特别感谢邵伟老师；同时，还要感谢多年来给我们教诲和指导的化学与生命科学学院的全体老师；最后，我还要感谢同学们给我的帮助。谢谢！

附录

实验所用的主要仪器及设备的生产厂家为：

SZ-93型自动双重纯水蒸馏器：上海亚荣生化仪器厂。 衡新ACS 系列电子秤：中山市衡新电子有限公司。 PHS-2F 型数字pH 计：上海精密科学仪器有限公司。

YXQ-LS-18SI 型不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。 DHP-9052型电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司。 ZD-85恒温振荡器：常州国华电器有限公司。

7230G 型分光光度计：上海精密科学仪器有限公司，波长范围300-900nm ，吸光度范围-0.041-1.999，温度5℃-35℃。

BCD-227GN 型海尔冰箱：青岛海尔股份有限公司。

无菌操作室：三峡大学化学与生命科学学院实验中心提供。 KQ-100型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

DHG-9076A 型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。

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