植物染色体常规分析技术

第一章 植物染色体常规分析技术

染色体由DNA 和组蛋白构成，不仅是生物，包括植物，的遗传信息载体，起到调节基因活动和有性后代重组频率的作用，而且还控制着真核生物的育性。因此无论是在植物遗传育种，还是在植物系统进化领域，染色体研究技术都是重要手段之一。此外该技术还是染色体分带、基因和基因组原位杂交技术的基础。也就是说染色体常规分析技术是生物学研究的基本技术之一，学习掌握该技术是学生将来从事科学研究工作的必要知识储备。

仪器设备、试剂及其他用品

明视野显微镜（每人一台）；水浴锅一个；控温培养箱一台；载玻片，盖玻片若干(清水洗过，70%酒精保存备用，用前纱布擦干) ；纱布， 滤纸若干；钟表镊子, 铅笔(未销) ，双面刮胡刀片各一个；500ml 烧杯（或广口瓶）若干只；培养皿若干（最好直径90mm ）；小药瓶或1.5ml 塑料离心管若干。

对二氯代苯饱和水溶液；0.002M 八羟基喹啉；改良石炭酸品红；1mol/L盐酸；0.1mol/L盐酸；45%乙酸；

材料

玉米、燕麦、小麦、蚕豆种子，洋葱、大葱鳞茎或种子，最好当年产。或者自己准备其他感兴趣的材料，如校园及周围环境中采集和市场购买，要有一定数量, 至少几百颗。有意向后及时与老师联系，了解你预备的种子是否适合用于实验，因有些种子存在休眠，短时间不能萌发。 实验流程

1 种子和鳞茎根尖的培养

种子培养前首先进行种子筛选，去除空瘪和霉变者以及杂质，保留饱满种子,10至30倍自来水浸泡24小时。取培养皿内垫湿滤纸，将浸泡后的种子铺于培养皿内，注意滤纸表面不要有流动水，种子量要适当，不要太多而互相堆积在一起，室温培养即可。每天流水洗一次，培养过程中如发现有霉烂种子及时清除以免影响种子萌发。

鳞茎培养采用水培。取烧杯一只盛满自来水，将鳞茎外部干皮和鳞茎盘底部残留泥土及根去掉，洗净，坐于烧杯口上，使底部浸泡水中。

虽然是染色体分析实验，一定不要忽略材料培养，要提供具体材料以理想的培养条件。只有根尖生长旺盛，才可能获得具有高比例分裂细胞的根尖，这是得到满意中期分裂相的前提。一般质量好的根尖为乳白色，可见大量根毛。

2 预处理

所谓预处理是指使用化学试剂和物理方法（如低温）抑制细胞纺锤体微管的形成和活动，保证更多的细胞处于有丝分裂中期，同时使染色体缩短变粗利于观察。待根尖伸长约1厘米，取根尖或在小种子情况下，如小麦，连带种子置小药瓶内对二氯代苯饱和溶液中处理3-6小时。注意环境温度不要过高以免产生药物毒害作用。还要注意不要盖瓶盖，保证材料呼吸所需氧气供应。如果处理时间较长，如超过5小时，应该间隔一定时间摇晃小药瓶以增加溶液中的溶解氧。

3 固定

固定就是在化学试剂的作用下使细胞内染色体结构保持不变。染色体制片常用的固定剂为卡诺固定液。方法很简单，倾去预处理液，加卡诺固定液[95%(或100%)酒精:冰乙酸=3:1]固定过夜。常温下材料在固定液可以保存一周左右，冰箱冷藏可以保存一个月左右。保存时间过长，压片时染色体粘连而不易分散。

4 解离

解离的作用是使根尖分生组织的细胞易于分散。一般是将材料从固定液中取出装入小瓶或离心管中，蒸馏水洗一次，加入1mol/L盐酸，放入事先预热到60℃的水浴锅中，保持5至10分钟取出，用吸管吸出解离液，加入蒸馏水洗一次，加45%醋酸软化。

5 染色和压片

染色和压片的目的是使细胞中的染色体着色并分散开以利于染色体形态结构的观察。截取

根尖置载玻片上，用镊子或双面刀片切取分生区组织，去掉其他部分，包括伸长区和成熟区。如果根尖较粗，如蚕豆根尖，最好将根冠也切去。滴加一滴染色剂改良石炭酸品红染色，加盖玻片。将载玻片放在铺有滤纸的平坦桌面上。取小片滤纸覆于盖玻片一角，用左手食指压在滤纸上。在盖玻片相对的另一角插入双面刀片，使盖玻片垫起，载玻片和盖玻片保持一定的空间。而后右手执镊子，用镊子柄端轻轻敲击盖玻片有材料的地方而使分生组织的细胞分散。初学者不要一味用力敲，可以敲一敲，拿到显微镜仔细观察一下，视细胞分散情况以决定敲打力度。镜检细胞分散开后，将小滤纸片盖在整个盖玻片上，左手压住盖玻片一角，右手拿铅笔，以铅笔平整的端部稍用力敲打盖玻片，使染色体分散，压平于同一平面上。

整个压片操作是一个手工活，只有用心操作才能掌握其中的规律。要使染色体分开，首先要使细胞分散且不破裂。理想的分散就是细胞不存在互相压叠，为下一步细胞内染色体的分散留出空间。否则在进行染色体压散操作时，由于细胞的重叠造成染色体没有足够空间而互相搭叠。如果细胞破裂，因此时载玻片和盖玻片间溶液较多，染色体会随液体飘散而无法识别染色体的归属。第二步才是染色体的散开，此步敲片力度也是需要在实践中细心摸索。

理想的制片至少有一个分裂相的所有染色体都在100倍物镜（油镜）下的同一焦面上，也就是通过调焦可以同时清晰看到（见图1），每一条染色体为棒状，不发生弯曲，其着丝点和次缢痕很容易分辨。只有如此才有利于染色体长度数据的测量。

图1 多星韭（Allium wallichii Kunth ）四倍体细胞型有丝分裂中期染色体照片。基本上每个染色体都为棒状，着丝点清晰可见（云南大学生命科学学院99级生物学基地班学生史军作）。

核型分析

一般地讲，种子植物的核型就是体细胞分裂中期所表现出来的染色体数目、大小和形态结构，如着丝点和次缢痕的位置。对于核型的定性定量描述就称为核型分析。

描述染色体数目变异的常用指标有体细胞染色体数目（简写为2n ）和染色体基数（简写为x ）。前者的意思是相对于配子体或生殖细胞配子的孢子体体细胞染色体数目，如被子植物等的根尖或茎尖细胞染色体数目。许多植物类群中存在染色体的倍性变化，如自然状态下的多星韭（Allium wallichii Kunth）存在两种类型的植物体，2n=14和2n=28，那么其染色体基数x=7。x （小写）也就是一个类群中体细胞染色体数最少类型的配子或配子体染色体数，称为染色体基数。

核型分析的第二步工作就是染色体形态结构的定性定量描述，包括染色体的绝对大小（长短）、相对大小、着丝点、次缢痕以及随体的位置的测量和统计。

首先说测量染色体的大小。在测量之前按染色体数的多少准备一份表格（见表1）。手工方法是将拍摄的电子照片放大打印出来，而后用毫米尺在照片上进行。因为种子植物体细胞内来自双亲的同源染色体大小相同，着丝点位置一致而成对存在，在开始测量时，首先目测，大致

按染色体长度从长到短顺序编号并配对。其次用毫米尺分别测量每一条染色体的长臂和短臂，将数值填入表中。有时因为非同源染色体长度差距不大，或者因为制片而造成染色体形变，仅仅根据目测排序会存在问题，所以在测量完成之后再次对排序进行权衡，调整其排列顺序。

表1 ××××染色体测量数据

染色体序染色体长度 臂比=

号 长臂/短臂 长臂 短臂（s ）

1 1 2 2 „ „

为使所得到的染色体定量数据具有代表性，一般如此测量5个细胞，得到5个测量数据表，而后进行统计处理得到平均值。

接下来首先按下列公式可以将照片上的染色体长度转换为绝对长度。

某一条染色体长度（um ）= 照片该染色体长度（mm ）/放大倍数×1000。

一般地说，由于染色体收缩程度极易发生变化，比较不同类群染色体绝对长度意义不大。人们设计出可比较的参数，即染色体相对长度。考虑到同一分裂相不同染色体收缩程度的一致性（也不尽然），以一个分裂相中某染色体长度除以所有染色体长度总和就成为相对值。该数值用于不同类群比较时，消除了因处于有丝分裂不同时期同源染色体绝对长度必定存在的明显差异。具体计算方法是首先将一张照片上（同一分裂相）每对同源染色体的长臂、短臂长度以及两者的比值分别相加，除以2得到平均值，而后将该分裂相中所有染色体长臂和短臂平均值求和，并以各个平均值除以其总和得到每对同源染色体的长臂和短臂的相对值，再乘以100就得到染色体长短臂的相对长度。其他4个分裂相也做同样处理。最后将5个分裂相相对应的数值相加，除以5得到每对同源染色体平均的长臂和短臂相对长度以及平均的臂比值，结果列于表2。

表2 ××××核型参数 染色体编长臂（%） 短臂（%） 总长（%） 臂比值 着丝点类型 号 1 2 „ „

为了更简明地定性说明着丝点的位置，很多学者用符号来表明着丝点的位置而把染色体进行形态上的分类。应用比较广泛的就是Levan et a（1964）建立的着丝点两点四区系统。所谓两点就是正端部着丝点和正中部着丝点，四区就是中部着丝点区、近（亚）中部着丝点区、近（亚）端部着丝点区和端部着丝点区。这些染色体类型与相应的臂比值列于表3。当所研究的染色体臂比值落入表3中某一范围就称其为某种类型的染色体。具体工作时，将表2中每对同源染色体的臂比值对照表3中的臂比值范围，将相应的着丝点位置简称填入表2的着丝点类型一栏即可。

表3 李懋学等（1985）修改的Levan et al（1964）

染色体着丝点命名系统

着丝点位置 简称 臂比值范围

M 1.00 正中着丝点

m 1.01—1.70 中部着丝点

sm 亚中部着丝点 1.71—3.00

st 亚端部着丝点 3.01—7.00

t 端部着丝点 7.01—∞

T 端部着丝点 ∞

此外很多植物在染色体组中某些染色体上具有次缢痕，也就是常规染色情况下，染色体表

现缢缩且着色相对较浅的位置。现在已经很清楚这一位置实际上就是处于表达状态的核糖体RNA 基因（rDNA ），因此称为核仁组组织者区（NOR ）。相应地染色体上次缢痕远端的染色体片断就称为随体（SAT ）。带有随体的染色体成为随体染色体。一般地讲，相对所在的染色体随体都很小。在这种情况下，只要在核型参数表和核型公式中以简写“SAT ”标示即可。如果随体较大，在进行核型分析时也要测量随体的长度。

次缢痕和随体的存在是区别同一核型组成中不同染色体的重要标致，也是区别某些近缘种的核型特征。因此在核型分析过程中不可忽视随体的存在。

核型分析到此完成，下面就是为发表而进行的表达。所谓表达就是用文字和图表把核型分析的结果表述出来，使读者清楚地领会所传达的信息。

一般说来，在发表文章时首先给出一张染色体组成的模式照片（如图2）。这一照片（现在一般都是数字图片）肯定选择所拍照片中最好的，其上染色体结构清晰且无互相重叠，代表作者的技术水平，也最能说明作者所作工作的可信性。选中的照片要适当裁剪，去掉不必要的背景以突出显示要表现的染色体。必要时可使用图像处理软件提高反差。如果照片表现很差，文章的审阅者第一印象就不好。其次是由模式照片上裁剪的染色体配对粘贴组成的核型（见图3）。第三给出核型参数表（见表4）。第四给出表示染色体组成和相对大小的模式核型（图4）。该模式核型实际上就是按照核型参数表中给出的各对染色体的相对长度绘制的模拟核型。它比核型参数更直观，更容易比较核型中染色体的个性。

2 M 10.08 6.05 16.13 1.98

3 sm 10.26 5.16 15.42 2.05

4 sm 9.86 5.08

14.94 1.58

5 sm 9.51

4.63 14.14 1.94

6 sm 8.63 3.78 12.41 2.24

7 sm 7.24 3.45 10.69 2.21

图2 二倍体多星韭根尖细胞有丝分裂中期照片示其染色体组成。

图3 多星韭核型

图4 多星韭模式核型，纵坐标为染色体的相对长度。

在给出上述图表的同时，也可以作一文字描述。核型公式是描述的一种很好形式。所谓核型公式采用数学运算式的形式表达核型分析结果，如多星韭可以表述为2n=2x=14=2m（SAT ）+2m+10sm。这个公式表示该植物体染色体数目为14，为二倍体，由2对中部着丝点染色体，其中1对具随体和10对近中部着丝点染色体组成。

顺便提一下，Stebbins （1971）发现在一些类群核型表现出从对称向不对称方向进化的趋势。所谓对称性一方面表现在核型中非同源染色体间长度的差异性，另一方面表现在核型中每对同源染色体着丝点位置的偏向程度。如果说核型比较对称，就表明核型中染色体长短基本相近，各染色体的着丝点基本位于中部。基于这一假说，Stebbins 经验性地对核型对称性进行了数值划分（见表8）。在国内有些关于植物染色体的论文中常常使用这一标准来简单地说明所作的核型进化或原始，是不科学的。这一标准不是不可以使用，要结合其他证据综合考虑。

介于2和4之间

≥4 1B 1C 2B 3B 2C 3C 4B 4C

到此为止，我们完成了植物染色体核型分析的基本实验工作和数据分析处理。而数据分析的结果就成为科技论文“实验结果”的内容。以此为基础，结合文献，我们就可以提出观点并加以论证，形成文稿，提交科技刊物编辑部预备发表。