不同浓度酒精对小鼠学习记忆影响及海马

西北大学学报(自然科学网络版) 2008年3月，第6卷，第2期

Science Journal of Northwest University Online Mar. 2008，V ol.6，No.2

不同浓度酒精对小鼠学习记忆影响及海马

神经元FOS 蛋白表达的比较

翟培源，邰发道，薛 慧

（陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安 710062 ）

摘 要：不同浓度酒精对小鼠灌胃后，用Y 型迷宫、免疫组化方法检测酒精对小鼠学习记忆行为

影响的差异及海马FOS 蛋白的表达状况。结果显示：与灌胃前相比，灌胃后50%浓度组学习、记

忆能力显著降低(P 0.05)。50%

浓度组小鼠学习的损伤较25%浓度组差别显著(P

为显著(P 0.05)，表明不同浓度酒精对小鼠

学习记忆影响有较大差异，酒精损伤学习记忆可能存在一个浓度阈值。酒精损伤小鼠的学习和记

忆能力，尤其对记忆损伤较严重。免疫组化实验则显示酒精刺激引起小鼠海马FOS 蛋白表达增强，

表明酒精引起该部位神经元活性变化。

关 键 词：酒精；小鼠；学习记忆；Y 迷宫；免疫组化；FOS

中图分类号：Q427 文献标识码：A 文章编号：1000-274X(2007)0333-09

随着人们生活水平的不断提高，饮酒量日渐增多，由于酒精滥用、酒精中毒引发的脑血管病变、脑组织损伤也逐渐增多。有调查显示，近些年青少年饮酒人群明显增加[1]，因此酒精对人体健康的危害越来越引起人们的普遍关注。在人的大脑中，最容易受到酒精损伤的部位是与学习记忆有关的海马组织和与决策、逻辑思维有关的前额皮质[2,3]。已有实验证明酒精能损伤认知能力，但是不同浓度酒精对海马FOS 神经元活性的影响及其之间的差异则未见报道。因此本实验依据日常生活中人们普遍饮用的白酒、果酒和啤酒的浓度，选择在浓度上成倍数关系的50%，25%和12.5%的酒精连续灌胃，比较了不同浓度的酒精灌胃后，小鼠在Y 迷宫中学习、记忆行为上的差异。由于c-fos 等即刻早期基因(IEGs)的激活是学习记忆形成的必要条件[4,5]，因此进一步用免疫组化方法比较不同浓度酒精灌胃后，与小鼠学习记忆能力相关的海马神经元FOS 蛋白表达上的差异。

1 材料与方法

1.1 动物及饲养情况

健康成年ICR （Institute for cancer research）种小白鼠（动物号：陕动字第08-004号）, 体重20～30g ，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。饲养于陕西师范大学生命科学学院动物饲养室，饲喂鼠饲料，自由饮水于饲养笼（44cm×26cm×15cm）内. 光周期12D ：12L ，自由摄食条件下实验室喂养一周，其间实验室温度在24～28℃。

_______________________

1.2 分组及毒染

选用无水乙醇（分析纯，含量不低于99.99%），用蒸馏水配制成50%，25%，12.5%浓度的乙醇溶液。小鼠饲养一周后经Y 迷宫预选合格32只，随机分为4组，每组8只，其中实验组有3组，分别灌胃50%，25%，12.5%酒精14d ，对照组灌胃蒸馏水。此外，在免疫组化实验中另增两组对照，仅给酒精刺激组和既无酒精又无电击组各8只。

1.3 行为实验

1.3.1 Y迷宫的结构及原理 MG-3型Y 迷宫刺激器，是由等长的I ，II ，III 臂和三者交界区组成，箱底铺设直径0.2cm, 长14cm, 间距1cm 的电栅。臂的内臂均贴有可导电的薄层铜片，每臂长45cm ，顶端各装一盏15W 的刺激信号灯[6]。在其控制面板上有电压控制旋钮、延时控制旋钮和I ，II ，III ，0 琴键，当分别按下I ，II ，III 键时，相应的臂信号灯亮，此时该臂不通电为安全区，按下0键，则三臂均不通电，但交界处仍通电。实验开始时，让小鼠在起步区适应3~5min，然后按一定规律或随机转换琴键开关已变换电击区和安全区，观察小鼠学会逃离电击区而进入安全区的反应能力[7]。

1.3.2训练方法 预选：将小鼠放入迷宫箱中3~5min, 然后给与适当的电刺激（一般30~70V）使其对3个臂均探索进入为止，选择自发活动活跃、对电击反应较敏感者实验用。

学习测试：采用随机休息法[8]，即安全区以无规则次序变换，以训练小鼠辨别灯光刺激和安全方位的能力，较好的反映出小鼠认知功能的视觉及空间位置的判别能力。为了排除噪音、光线、时间等外界因素的干扰，要求实验过程中环境保持安静、光线较暗、一般在上午固定时间进行。实验开始时先将小鼠放入迷宫箱中适应3~5min，随机按下琴键5s （刺激延搁）后有刺激输出，然后逐渐增大刺激强度至小鼠刚好开始逃离电击区，若小鼠一次性直接由电击区进入安全区，则视为正确反应，若逃到无灯光的任何一臂则视为错误反应。小鼠由电击区第一次进入安全区所需的时间即为潜伏期。当小鼠逃到安全区后，灯光持续作用10~15s，熄灯后结束一次测试，小鼠所在的支臂就作为下一次测试的起点，休息1min 后再给第二次测试，依次重复，每天20次，测试至达连续9/10标准，即连续的10次测试中，有9次是正确反应，一般3~4d小鼠都能达到学会标准。记录下小鼠达到学习标准所需的训练次数及达标所需的天数。

记忆再现测试：学习测试达标24h [9]后，以同样的方法测试至达连续9/10标准，正确反应次数定为A ，以A /10表示记忆的保持能力。

灌胃：按20mL/kg的剂量，实验组分别灌胃50%,25%,12.5% 的酒精14d ，对照组灌胃同剂量的蒸馏水14d ，每只每天分两次灌胃，并且两次时间间隔为6h 。

灌胃后学习测试：方法同上。

灌胃后记忆再现测试 ：方法同上。

1.4免疫组织化学实验

兔抗c-Fos 购自SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY生物公司。正常山羊血清封闭液，生物素化羊抗兔LgG 和链酶亲和素－过氧化物酶复合物SABC 都购自武汉博士德生物工程有限公司。行为实验完成后，将小鼠立即称重，20%乌拉坦（1.25g/kg）麻醉，0.1mol/LPBS（PH7.4~7.6）换血，4%多聚甲醛灌流固定，

剖制标本，取小鼠脑，置于4%多聚甲醛中后固定8~10h，然后放入30%蔗糖溶液，置于冰箱中过夜24h ，至标本沉底。制作冰冻切片，切片厚度40um ，用0.01mol/LPBS（PH7.2~7.6）接片，正常山羊血清37℃水浴封闭1h ，将封闭液从反应槽中倾去或吸干，加入1：100的c-fos (用0.01mol/LpPBS稀释)4℃冰箱放置3天，之后用0.01mol/LPBS冲洗3次，每次5min ，加入生物素标记羊抗兔lgG 二抗37℃水浴孵育1.5h ，0.01mol/LPBS冲洗3次，每次5min ，然后加SABC 在37℃水浴中孵育2.5h ，之后用0.01mol/LPBS冲洗4次，每次5min 。DAB 显色10～15min ，贴片待其晾干后酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜观察。阴性对照组不加一抗，于0.01mol/LPBS 4℃冰箱放置3天。

1.5 统计学处理

所有数据以平均值±标准方差表示，参考包新民、舒斯云著的《大鼠脑立体定位图谱》，根据脑空间结构进行定位，每只小鼠选择相同脑切面的3张切片，在光镜下观察海马各区，在显微镜下用测微尺在面积为（25×25）μm 2 样方的精网格中数出海马区域的阳性细胞数目。各组样本均数采用SPSS 软件中的t 检验进行处理。

2 结 果

2.1 Y 迷宫学习记忆检测结果

与灌胃前相比，灌胃后50%浓度组小鼠Y 迷宫学习测试达标所需的次数明显增加，并且潜伏期延长，自发活动积极性和灵活程度降低，电刺激强度增大，学习、24h 记忆保持率显著降低(P 0.05)，但是24h 记忆保持率显著降低（P 0.05)，表明不同浓度酒精对小鼠学习记忆影响有较大差异，酒精损伤小鼠的学习和记忆能力，尤其对记忆损伤较严重。见图1。

2.2 小鼠海马结构中FOS 阳性神经元活动的变化

光镜下FOS 表达阳性细胞为细胞核着色，成棕黄色染色，用显微镜测微尺，取方格面积为0.0156m 2的视野作为一个单位面积，随机计数海马3~5个单位面积的细胞数，累加10张切片上不同单位面积中的阳性细胞数，求其均数，即得到上述各部位中单位面积阳性细胞数。见图2和图3。

3 讨 论

酒精是一种亲神经性毒物，可通过血脑屏障进入脑组织[10,11]，酒精对中枢神经细胞的长期毒性作用造成了中枢谷氨酸能神经元[12]和γ-氨基丁酸能神经元系统突触间隙神经递质数量和突触前后受体构型改变

[13,14]，激活了的谷氨酸受体[15]、胞浆中钙离子浓度的升高[16]以及细胞中的cAMP 的升高[17]，均可诱导

图1 灌胃前、后不同浓度酒精对小鼠学习记忆的影响比较（n =8）

Fig.1 The learning and memory behavior of each group

注：与灌胃前相比，50%浓度组学习能力降低差异显著，* P 0.05）

图2 50%,25%,12.5%,仅酒精组（25%）、仅电击组和无酒精无电击组灌胃后海马FOS 蛋白表达比较（n =5）

Fig. 2 The differences of the number of FOS expression in the hippocampus among the groups treated with different

concentration of alcohol (n =5)

注：50%浓度组与其他各组相比差异极显著， **P

图3 1～6分别是50%浓度组，25%浓度组，12.5%浓度组，仅酒精组，仅电刺激组，无酒精无电刺激组小鼠海马的FOS 免疫阳性神经元表达，4×10,标尺0.2mm

Fig.3 The picture 1 to 3 are the expression of FOS positive neurons in the hippocampus of mice treated with 50%,25%,12.5%alochol respectively, and the picture 4 is the expression of FOS positive neurons in the hippocampus of the group treated with alcohol only, and the picture 5 is the expression of FOS positive neurons in the hippocampus of the group treated with electricity only

c-fos 基因的表达，而钙离子以及作为中枢神经系统兴奋性递质的氨基酸，则与学习记忆密切相关。因此酒精通过影响神经信息的传递，最终影响小鼠的学习、记忆行为。

学习记忆是大脑最基本也是最重要的的高级神经功能之一，与学习记忆有关的结构已研究了一百多年，自从1957年Scoville 报道了一位双侧内侧颞叶切除的病人出现了严重的近期记忆丧失后，神经科学家们开始相信不同的脑部结构在学习记忆过程中扮演着不同的角色，随后内侧颞叶系统（包括海马和相邻有关皮层）、前额叶、间脑、小脑及Meynert 基底核等相继都被证实了参与学习记忆的过程[18,19]。目前，对c-fos 与学习记忆关系的研究比较深入，c-fos 等即刻早期基因（IEGs ）的激活是学习记忆形成的必要条件[20]。已知原癌基因c-fos 广泛存在于真核细胞基因中，因其可在某些刺激因素激活后数分钟即可被转录

[21,22]，故又称为即刻早期基因(IEGs)[23,24]。原癌基因c-fos 及其表达产物FOS 蛋白在神经元活动时表达活跃，被广泛用作神经元兴奋的标志[25,26]。在一系列生理或病理刺激因子作用下，通过不同的第二信使引起

神经元FOS 的表达增强，形成c-fos mRNA ， 由c-fos mRNA 翻译形成FOS 蛋白立即转位至细胞内，与另一即刻早期基因c-jun 所产生的JUN 蛋白构成二聚体，可作为转录因子促进靶基因的转录，同时参与细胞生长、繁殖、分化、信息传递、学习记忆等生理过程。在正常情况下，c-fos 基因在绝大多数细胞包括神经元中呈极低表达，不易检测到。因此，利用FOS 蛋白显示细胞激活与否及神经元活动的部位，显示酒精刺激引起学习记忆损伤的相关脑区以及不同脑区的神经联系。

本实验选择连续灌胃小鼠酒精14d ，目的在于保证酒精的摄入量，保持小鼠血液中较高的酒精浓度，符合人类的饮酒习惯，为避免一次性大量酒精灌胃引起呕吐、呛咳并导致吸入性肺炎引起动物死亡，灌胃过程中采用分次灌胃法，每天两次，每次时间间隔6h ，在保证灌胃频率的前提下，每天灌胃固定量的酒精，连续14天后，Y 迷宫对其学习记忆再检测，结果显示酒精损伤小鼠的学习记忆功能，这与灌胃过程中观察到小鼠的行为变化基本符合。与对照组相比，50%的酒精对小鼠学习记忆损伤较明显（P 0.05)，但对记忆的损伤较明显(P

免疫组化实验结果显示，与既无酒精刺激组又无电刺激组相比，各实验组酒精刺激后在小鼠海马结构出现FOS 阳性细胞，表明酒精使这些部位神经元活性发生改变，也即在小鼠脑中这些部位对学习记忆功能有重要作用，并且50%浓度组的小鼠其海马FOS 蛋白表达量最多、最明显(P

型受体并且提高它的浓度，进而作为一种调节器调节GABA A 型受体的功能。由此结合本实验的结果可以推断，酒精损伤小鼠的学习记忆能力，可能是酒精直接作用于海马的兴奋性神经元的细胞膜上，使突触间隙中神经递质数量改变，也可能使突触前后受体构型改变，影响神经递质与受体的结合，阻碍细胞信号的传递，影响机体学习记忆能力，而被激活了的受体则诱导c-fos 基因的表达，显示学习记忆损伤的相关脑区。

综上所述，酒精损伤小鼠的学习记忆行为，尤其对记忆的损伤较明显。不同浓度的酒精对小鼠学习记忆影响不同，酒精损伤小鼠学习记忆可能存在一个浓度阈值，大于、等于此浓度的酒精对小鼠学习记忆的损伤明显。对于酒精造成的脑损伤机制，有待于进一步研究。随着分子生物学的发展，酒精在体内的代谢途径及酒精中毒的机制已经进入了分子遗传学水平的研究，寻找出影响酒精中毒的确切基因不仅有助于进一步探讨酒精损伤的分子神经机制，也有助于预防酒精中毒的风险率。

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Effects of different concentration of alcohol on mice's learning

and memory, the neural activity of hippocampus

ZHAI Pei-yuan, TAI Fa-dao, XUE Hui

(College of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)

Abstract: In order to investigate the effects of different concentration of alcohol on the learning and memory, Y-maze method and the expression of FOS in the brain were used in the mice. The results show that the mice′s learning and memory behavior depressed significantly after drinking

50% alcohol, while the less depressed learning and memory behavior were induced by 25% alcohol,12.5% alcohol and water. Compared the middle concentration (25%) group, low concentration (12.5%) group and control group, the negative effects on learning and memory of the high concentration(50%) group is much significant, but there is not significant difference on the learning and memory behavior between middle concentration group and low concentration group and control group. These findings suggest that the alcohol could harm the learning and memory especially much more seriously to the memory. There are different effects among the different concentrations of alcohol, and there may exist a threshold concentration, which if exceeds the threshold may harm the learning and memory significantly. Using immunohistochemical method, it is found that there was a significant increase of the number of neurons expressing FOS in hippocampus. These results suggest that alcohol could increase the expression of FOS in hippocampus and could induce the change of neuronal activity in this area.

Key words: alcohol ，mice ，learning-memory ，Y-maze ，immunohistochemical ，FOS

作 者 简 介

翟培源，男，汉族，河南兰考人，生于1982年11月。2006年9月至今就读于陕西

师范大学生命科学学院，神经生物学专业在读研究生，理学硕士，主要研究方向是行为

神经生物学

本文引用格式为：

[ ] 翟培源，邰发道，薛慧. 不同浓度酒精对小鼠学习记忆影响及海马神经元FOS 蛋白表达的比较[J/OL].

西北大学学报：自然科学网络版, 2008，6(2)：0333[2008-03-10]. http://jonline.nwu.edu.cn/wenzhang/ .

Effects of different concentration of alcohol on mice's learning and memory the neural activity of hippocampus