肝脏细胞悬液制备-110621
10-27
2011-6-20
1. 麻醉
2. 消毒，大面积开腹
3. 分离门静脉，带两根线，一短（脾V 上方），一长（后面要绑定固定留置针的），肝下
下腔分离，带一根线
4. 门静脉剪孔，插留置针，结扎（可用5-0线）固定，进行肝素化，1ml 注射器（
5. 先将肝下下腔静脉在靠下的位置剪断，然后换预灌注液（D-hanks ）在门静脉进行预灌
注，约10ml
6. 用血管钳将肝上下腔钳紧，将肝下下腔结扎，确定阻断上下出口之后，用0.05%的Ⅳ型
胶原酶冲入门静脉进行消化，约10ml ，原位消化15分钟，可以看到组织变软变细腻。
7. 分离取下肝组织，放到平皿中，可用手术镊子钝性粉碎肝组织，制备细胞悬液，去除结
缔组织
8. 过80目钢网一遍（可省略）
9. 再过200目钢网一遍（即70umBD 筛网-白色）
10. 收集滤下来的液体，加1640混匀重悬(约50ml) ，54g （500rpm ），离心3min
11. 上清收集到另一管，将沉淀用1640重悬后，再次54g ，离心3min ，得到的即为肝细胞
（一只C57小鼠约1.1*107个细胞）
12. 上清1350g （2800rpm ），离心10min ，即为非实质细胞
准备试剂及材料
留置针，手术线，10ml 、1ml 注射器，购置已配好的D-hanks 液体，0.05%的Ⅳ型胶原酶（50*的-去离子水配制，即2.5%的，用PBS 稀释成1*的，-200ul50*，4800ulPBS, 共10ml ） 注意
离心力RCF=1.118*10-5 *N2*R,单位为g （N 为转速，单位是rpm ；R 表示离心半径，单位是cm ）