5种蛋白质分析方法

蛋白质分析方法

1、 微量凯氏（Kjeldahl ）定氮法

样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：

NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1)

2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2)

(NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3)

反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。

计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。

评价：

总氮-非蛋白氮=蛋白质氮——>蛋白质含量

灵敏度低，误差大，耗时长。

2、 双缩脲法（Biuret 法）

（一）实验原理

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

（二）试剂与器材

1. 试剂：

（ 1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA ）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA 浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。

（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4•5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH 溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

2. 器材：

可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

（三）操作方法

1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分钟，于540nm 处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。

2、样品的测定：取2～3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。

评价：采用540nm 分光光度法测定。测定快速，但是灵敏度差，不精确。

3、 Folin —酚试剂法（Lowry 法）

（一）实验原理

这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin —酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin —酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

Folin —酚试剂法最早由Lowry 确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry 反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。

进行测定时，加Folin —酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH 条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin 一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

此法可检测的最低蛋白质量达5mg 。通常测定范围是20~250mg。 （二）试剂与器材

1. 试剂

（1）试剂甲：

（A ）10克 Na2CO3，2克 NaOH 和0.25克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6•4H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。

（B ）0.5克硫酸铜（CuSO4•5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A ）与1份（B ）混合，即为试剂甲。

（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4•2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4•2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH 滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N 左右。

（3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或 g —球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。

2. 器材

（1）可见光分光光度计

（2）旋涡混合器

（3）秒表

（4）试管16支

（三）操作方法

1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin —酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm 处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。

注意：因Lowry 反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。

进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。

2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。

根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

评价：

显色后在700nm 处采用分光光度法测试。测试灵敏度高，是较为常用的方法。

4、 改良的简易Folin —酚试剂法

（一）试剂

1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。2. 试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。

3. 标准蛋白质溶液：同基本法。

（二）操作步骤

测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm 下测定其吸光度值。

改良的快速简易法，可获得与 Folin —酚试剂法（即Lowry 基本法）相接近的结果。

评价：

原理与方法三Folin —酚试剂法基本相同，，采用化学反应显色后，在660nm 处用分光光度法分析。但更为快速简易。

5、 考马斯亮兰法（Bradford 法）

（一）实验原理

双缩脲法（Biuret 法）和Folin —酚试剂法（Lowry 法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976年由Bradford 建立的考马斯亮兰法（Bradford 法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax ），由465nm 变为595nm ，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

在595nm 下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

Bradford 法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比Lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg 。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry 法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry 法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰Lowry 法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford 法用于不

同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g —球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS ）和0.1N 的NaOH 。（如同0.1N 的酸干扰Lowary 法一样）。

（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer 定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 （二）试剂与器材

1. 试剂：

（1）标准蛋白质溶液，用 g —球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

（2）考马斯亮兰G —250染料试剂：称100mg 考马斯亮兰G —250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。

2. 器材：

（1）可见光分光光度计

（2）旋涡混合器

（3）试管16支

（三）操作方法

1. 标准方法

（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0. 02、0.04、0.06、0.08、0.1ml ，然后用无离子水补充到0.1ml 。最后各试管中分别加入5. 0ml 考马斯亮兰G —250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。

（2）加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm 处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O 加5.0mlG —250试剂。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

评价：

化学反应显色后，在595nm 处用分光光度法测试。

目前灵敏度最高的蛋白质测定法。干扰物质少。用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，这是任何一种方法都无法避免的问题。