细菌试验方法

细菌体外实验所需要的仪器设备：

1． 37℃恒温箱：容积可容50个培养皿

2． 无菌操作台

3． VORTEX 振荡器

4． 高温高压消毒锅

5． 微波炉及手套

6． 冰箱

7． 玻璃器皿：细菌培养皿100个及消毒筒6个，10ml 试管及盖100个及试管架2个，锥形

瓶及盖（20个），酒精灯1个，玻璃涂布棒3个。

8． 其它耗材：微量移液器枪头及盒，细菌培养液配制原料，Ep 管及架。

细菌体内实验所需要的仪器设备：

1． 动物饲养房：动物饲养笼，通风设备

2． 组织切片：切片机、烘片机、滩片机、电炉、恒温箱、

细菌的简单染色和革兰氏染色

（一）实验目的：学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。

（二）实验原理：用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH 下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。

简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram 所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G ）和革兰氏阴性菌（G ）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 +—

该染色法所以能将细菌分为G 菌和G 菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G +——菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G 菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

（三）实验器材

1、活材料：培养12-16h 的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus +subtilis ），培养24小时的大肠杆菌（Escherichia coli）

2、染色液和试剂：结晶紫（附二、（一）、3）、卢哥氏碘液（附二、（一）、4）、95%酒精、蕃红（附二、（一）、5）、复红（附二（一）、2）、二甲苯、香柏油

3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜

（四）实验方法：

1、简单染色：

（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌

浓菌液挑2-3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。

（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。

（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）

（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min 。

（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液

（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。

（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。

2、革兰氏染色：

（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。

（2）晾干：与简单染色法相同。

（3）固定，与简单染色法相同

（4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。

（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。

（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min 。

（7）水洗：用水洗去碘液。

（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s 至流出液无色，立即水洗。

（9）复染：滴加蕃红复染5min 。

（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。

（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。

（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。

（13）实验完毕后的处理：

①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a. 先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b. 用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c. 再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。

（五）实验作业

给出Bacillus thuringiensis 和Escherichia coli 的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。

（六）注意事项

1. 革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。

2. 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。

3. 选用幼龄的细菌。G 菌培养12h-16h ，E.coli 培养24h 。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

1. 结晶紫染液

甲液：结晶紫2克 乙醇（95％） 20毫升

乙液：草酸铵0.8克 蒸馏水 80毫升

混合甲液乙液，静置48小时后使用。

2. 藏花红染液

藏花红 2.5克 乙醇（95％）100毫升 +

取上述配好的藏花红酒精溶液10毫升与80毫升蒸馏水混匀即成

3. 碘液

碘 1克 碘化钾 2克 蒸馏水 300毫升

配制时，先将碘化钾溶于5－10毫升蒸馏水中，再加入碘1克，使其溶解后，加蒸馏水至300毫升。

细菌荚膜染色与观察 （金葡萄菌和链球菌有没有必要）

一、目的掌握细菌荚膜染色方法。

二、原理荚膜是包围在某些细菌菌体表面的一层粘性多糖类物质，很难着色，具有荚膜的致病菌可抵御宿主吞噬，因而致病性较强。故医学上常用荚膜染色法来鉴定致病菌的致病能力。荚膜染色有多种方法，可分为两大类。一类是负染色法，使菌体和背景着色，而荚膜不着色（图 14-1）；另一类称正染色法，直接使荚膜着色。图 14-1 印度墨水负染肺炎链菌（注意细胞外围有一个很大的荚膜）

三、材料、试剂与器具（1）材料。圆褐固氮菌斜面菌种。（2）试剂。石炭酸复红染液，绘图墨水（用滤纸过滤后备用）。（3）器具。显微镜，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，吸水纸等。

四、操作步骤

1. 石炭酸复红—墨汁法（1）取培养了 72h 的圆褐固氮菌制成涂片，自然干燥（不能用火焰烘干）。（2）滴入 1耀 2滴 95% 乙醇固定（不可加热固定）。（3）加石炭酸复红染液染色 1耀 2min ，水洗，自然干燥。（4）在左手拿载玻片一端加 1滴墨汁，右手另取一块边缘光滑的载玻片与墨汁接触，再以 30°角将墨水匀速慢慢地推向另一端，涂成均匀的一薄层（图14-2），自然干燥。（5）干燥后用油镜观察。菌体红色，荚膜无色，背景黑色。

2. 背景染色（1）先加 1滴墨水于洁净的玻片上，并挑取少量圆褐固氮菌与之充分混合匀。

（2）放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻，吸收多余的菌液。

（3）干燥后用油镜观察。背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透圈即荚膜。五、注意事项1. 荚膜染色涂片不要加热固定，以免荚膜皱缩变形。2. 石炭酸复红—墨汁法染色时，墨汁不宜过多，否则遮住菌体和荚膜，能起到衬托作用。

微生物数量的测定

细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法（ directmicroscopic count）、平板菌落计数法（ platecount ）、光 电 比 浊 法（ turbidity estimation by spectrophotometer ）、最 大 或 然 数 法（mostprobablenumber ，MPN ）以及膜过滤法（membranefiltration ）等。测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、RNA 和 DNA 的含量测定，代谢产物的测定等。总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，实际工作中应根据具体要求加以选择。本实验主要介绍显微镜直接计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。

1显微镜直接计数法

一、目的复习血细胞计数板计数的原理；掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

二、原理显微镜直接计数法是将少量待测样品的菌悬液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff- Hauser计菌器以及 Hawksley 计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等菌悬液的计数，基本原理相同。除了这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单，但此法的缺点是所测得的结果是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如 AF-100细菌计数仪（ATP 测试仪），又如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验以血细胞计数板为例进行显微镜直接计数。另外两种计菌器的使用方法可参看各厂家的说明书。用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。

计数板是一块特制的载玻片，其上由 4条槽构成 3个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为 9个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图 19- 1。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成 25个中方格，而每个中方格又分成 16个小方格（图 19- 2）；另一种是一个大方格分成 16 个中方格，而每个中方格又分成 25个小方格，但无论是哪一种规格的血

细胞计数板，每一个大方格中的小方格都是 400个。计数室的大方格边长为 1mm ，则面积为1mm2；盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为 0.1mm ，计数室大方格的容积为 0.1mm3（10-4mL ）。

计数时，通常数 5个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上 25或 16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成 1mL 菌液中的总菌数。

设 5个中方格中的总菌数为 A ，菌液稀释倍数为 B ，如果是 25个中方格的计数板，则1mL 菌液中的总菌数 = A /5×25×104× B =50 000A·B （个）同理，如果是 16个中方格的计数板，则1mL 菌液中的总菌数 = A /5×16×104× B =32 000A·B （个）

三、材料、试剂与器具（1）材料。酿酒酵母斜面菌种。（2）试剂。菌悬液。（3）器具。血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管等。

四、操作步骤（1）菌悬液制备。以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。（2）寻找计数室。在加样前，在显微镜下先在低倍镜找到计数室。（3）加样品。将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管把摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动渗入计数室，计数室就充满菌液。（4）计数。加样后静止 5min ，在低倍镜下找到计数室所在位置进行计数，也可换成高倍镜下进行计数。调节显微镜光暗度。对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易看清楚计数室中的方格线。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有 5-10个菌体为宜。每个计数室选 5个中格（可选 4个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。位于边格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。如图 19-3中所示，每个中方格中有 12个细胞，计算出每毫升菌液为 3×106个细胞。再乘以稀释倍数 B 则为每毫升原始菌液中的细胞数。（5）清洗血细胞计数板。使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头下用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。五、注意事项（1）取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。（2）最好用 20mm ×20mm 的盖玻片。六、实验报告将结果记录于表 19-1中。A 表示五个中方格中的总菌数；B 表示菌液稀释倍数。 2平板菌落计数法

一、目的学习平板菌落计数的基本原理和方法。

二、原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以长成的一个单菌落可能不是一个细胞长成的。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地表明平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（colony- forming units，cfu ）而不以绝对菌数来表示样品的活菌含量。平板菌落计数法虽然操作较繁，需要培养一段时间才能获得结果，而且易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的数据，更加确切表明样品的实际含菌量，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。

三、材料、试剂与器具

（1）材料。苏云金芽孢杆菌菌悬液。

（2）试剂。牛肉膏蛋白胨培养基，盛有 4.5mL 无菌水的试管。

（3）器具。无菌平皿，1mL 无菌吸管，玻璃刮，试管架，生化培养箱，超净工作台等。

四、操作步骤

（1）编号。取无菌平皿 9套，分别用记号笔标明 10-2、10-3、10-4稀释度各 3套。另取 4 支盛有 4.5mL 无菌水的试管，依次标明 10-1、10-2、10-3、10-4。

（2）稀释。用 1mL 无菌吸管吸取 0.5mL 已充分混匀的苏云金芽孢杆菌菌悬液（待测样品），放至 10-1的试管中，此即为 10倍稀释，将多余的菌液放回原菌液中。将 10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支 1mL 吸管伸入 10-1试管中来回吹吸菌悬液 3 次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢，用此吸管吸取 10-1菌液 1mL ，放至 10-2试管中，此即为 100倍稀释……其余依次类推。

（3）取样。用 3支 1mL 无菌吸管分别吸取 10-4、10-5和 10-6的稀释菌悬液各 1mL ，对号放入编好的无菌平皿中，每个平皿放 0.2mL 。

（4）倒平板。尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃ 左右的牛肉膏蛋白胨培养基约 15mL/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上（图 19-4）。 由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，因此菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并已冷却至 菌落连在一起，影响计数。待培养基凝固后，将平板倒置于 30℃ 恒温培养箱中培养。也可取 0.1mL 稀释液滴在平板上，然后用玻璃刮涂布均匀，倒置培养（图 19-4）。

（5）计数。培养 48h 后，取出培养平板，算出同一个稀释度 3个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算每毫升菌液中菌落形成单位（cfu ） = 同一稀释度 3次重复的平均菌落数 × 稀释倍数 ×5（10）

五、注意事项（1）放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。（2）不要用 1mL 吸管每次只靠吸管尖部吸 0.2mL 稀释菌液放入平皿内，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。（3）一般选择每个平板上长有 30－300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的 3个重复的菌落数不应相差太大，否则表示实验不精确。实际工作中同一稀度重复平板不能少于 3个，这样便于数据统计，减少误差。由 10-2、10-3、10-43个稀释度分别计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。（4）平板菌落计数法中，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以 3个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在 50 个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。

六、实验报告将培养后菌落计数结果填入表中，分析结果，

3分光光度计计数法

一、目的了解分光光度计法的原理和操作方法。

二、基本原理当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度—菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数。分光光度法简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。但是，光密度值或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波波长等因素的影响。因此，对于不同微生物的菌悬液应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。光波的选择通常在 400－700nm 之间，具体到某种微生物采用多少还需要经过最大吸收波长以及稳定性实验来确定。另外，对于颜色太深的样品或在样品中还含有其他干扰物质的悬液不适合用此法进行测定。

三、材料、试剂与器具（1）材料。酿酒酵母斜面菌种。（2）试剂。麦氏（Meclary ）液体培养基。无菌生理盐水。（3）器具。721型分光光度计，血细胞计数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，全温振荡器等。

四、操作步骤（1）酵母菌液培养。在超净台内将斜面菌种接入麦氏液体培养基中，置于28℃ 、180r/min培养 48h 备用。（2）标准曲线制作1）编号。取无菌试管 7支，分别标明试管编号为 1、2、3、4、5、6、7。将上述酵母培养液以 4 000r/min离心 15min 后，弃去上清液，沉淀物加无菌生理盐水离心洗涤两次，沉淀物用生理盐水配成菌液。2）配制菌液浓度。用血细胞计数板计数，并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升 1× 106、2× 106、4× 106、6× 106、8× 106、10× 106、12× 106含菌数的细胞悬液。再分别装入已编好号的 1至 7号无菌试管中。3）测光密度值（OD ）。将 1－7号不同浓度的菌悬液摇均匀后，置于 1cm 比色杯中测定 560nm 的 OD 值。用无菌生理盐水作空白对照，并将 OD 值填入表 19-3表 19- 3 实验结果记录试管号12345678细胞数（106/mL）OD 值4）以光密度（OD ）值为纵坐标，每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。（3）样品测定。将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇均匀后，于 560nm 波长、1cm 比色杯测定光密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。（4）根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数。五、注意事项（1）每管菌悬液在测定 OD 值时均必须先摇匀后再倒入比色杯中测定。（2）各种操作条件必须与制作标准曲线时相同；否则，测得值所换算的含菌数就不准确。六、实验报告

（1）列出记录数据表。

（2）计算出测定样品含菌数的结果：每毫升测定样品原液菌数 = 从标准曲线查得每毫升的菌数 × 稀释倍数七、思考题（1）分光光度计法的原理是什么？这种计数法有何优缺点？

（2）本实验为什么采用 560nm 波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在验中需要测定大肠杆菌生长的 OD 值，你将如何选择波长？

实验 25 不同 NaCl 浓度对微生物生长的影响

一、目的了解不同的 NaCl 浓度对微生物生长的影响。

二、原理不同种类的微生物对 NaCl 适应能力不尽相同。大多数微生物在 0.5%－3% 的 NaCl 浓度范围内可正常生长。10%－15% 的 Nacl 浓度能抑制大部分微生物的生长，但对嗜盐细菌而言，在低于 15% 的 NaCl 浓度环境中不能生长，而某些极端嗜盐菌可在 NaCl 浓度高达 30% 的条件下生长良好（图 25- 1），对海洋微生物而言，最适 NaCl 浓度约 3% ，对极端嗜盐菌，最适 NaCl 浓度在 15%－30% 之间。

三、材料、试剂与器具（1）材料。苏云金芽孢杆菌，大肠杆菌，盐沼盐杆菌。（2）试剂。分别含 0% 、0.85% 、5% 、10% 、15% 及 30% NaCl浓度的每支为 5mL 牛肉膏蛋白胨水培养基试管。（3）器具。接种工具，超净工作台，722型分光光度计。

四、操作步骤（1）将培养基试管贴好标签，注明菌种名。（2）在超净工作台中，以无菌操作，每支试管分别接入 0.1mL 液体菌种每个菌种接种 1套培养基，混匀后，置于 28℃ 培养 24耀 48h 。3、取出试管后，用分光光度计测定 OD600，记录结果。五、注意事项接种后和测定 OD 值时，培养基和菌液都要混匀；测 OD 值时，要有对照液测零。六、实验报告（1）把测定的 OD 值记录于表 25-1。表 25-1 实验结果记录表NaCl 浓度菌名0%0. 85%5%10%15%30%苏云金芽孢杆菌大肠杆菌盐沼盐杆菌（2）分别画出 3种菌对不同 NaCl 浓度的生长曲线，并进行比较分析。

实验 26 pH 影响微生物生长

一、目的了解微生物在不同 pH 条件下生长的情况，确定微生物生长所需的最适pH 值。

二、原理不同微生物对 pH 条件的要求各不相同，它们只能在一定的 pH 范围内生长，可分为生长最低 pH ，生长最适 pH ，生长最高 pH 。细菌一般在 pH 4－9范围内生长，生长最适 pH 一般为 6.5－7.5；真菌一般在偏酸环境中生长，生长最适 pH 一般为 4－6。有些微生物能在极端条件下生长，即在极酸或极碱条件下生长。在实验条件下，人们常将培养基 pH 调至接近于中性，而微生物在生长过程中常由于糖的降解产酸或蛋白质降解产碱而使环境的 pH 发生变化，从而会影响微生物生长。因此，人们常在培养基中加入缓冲系统，如 K2HPO4/KH2PO4系统，大多数培养基富含氨基酸、肽及蛋白质，这些物质可作为天然缓冲系统。

在实验室，常常根据不同类型微生物对 pH 要求的差异来选择性地分离某种微生物，例如在 pH 10－ 12的高盐培养基上可分离到嗜盐嗜碱细菌，分离真菌则一般用酸性培养基等。

三、材料、试剂与器具（1）材料。粪产碱杆菌，大肠杆菌。（2）试剂。酿酒酵母，用 1mol/L NaOH 或 1mol/L HCI调至 pH 分别为 3、5、7、9牛肉膏蛋白胨液体培养基，无菌生理盐水。（3）器具。无菌吸管，150mL 三角瓶，分光光度计，精密 pH 试纸，恒温摇床。

四、操作步骤

（1）在超净工作台内，无菌操作吸取适量无菌生理盐水加入到粪产碱杆菌、大肠杆菌及酿酒酵母斜面试管中，制成菌悬液，使其 OD600值均为 0.05。

（2）无菌操作分别吸取 1mL 上述 3种菌悬液，分别接种于装有 50mL 不同pH 的牛肉膏

蛋白胨液体培养基的三角瓶中。

（3）将接种大肠杆菌和粪产碱杆菌的 8瓶三角瓶置于 37℃ 、200r/min振荡培养 24耀 48h ；将接种有酿酒酵母的 4瓶三角瓶置于 28℃ 、150r/min振荡培养48耀 72h 。

（4）将上述三角瓶取出，在 722型分光光度计上分别（细菌 600nm ，酵母菌 560nm ）测定培养物的 OD 值，记录好结果。

五、注意事项注意吸取菌液时要将菌液摇均匀，保证各管中接入的菌液浓度一致。

六、实验报告（1）将测定结果填入表 26- 1，说明 3 种微生物各自的生长 pH 范围及生长最适 pH 。（2）绘出 3种菌对不同 pH 的生长曲线，并分析其差异性。七、思考题（1）若大肠杆菌在以葡萄糖和 NH4Cl 作为碳、氮源的合成培养基及牛肉膏蛋白胨培养基中生长，两种培养基的 pH 值均为 7，在培养过程中每隔 6h 测定一次 600nm 的 OD 值。

实验 27 不同碳源物质对微生物生长的影响

一、目的了解不同的碳源物质对微生物生长的影响和测定方法。

二、原理微生物生长繁殖所需的营养物质主要有碳源、氮源、矿质元素、生长素和水。不同的碳源、氮源、矿质元素和生长素对微生物的生长繁殖都有不同程度的影响，即使同一种碳源或氮源的不同浓度对微生物生长繁殖也有很大的影响。本实验只从不同碳源物质来了解营养物质对微生物生长繁殖的影响。

三、材料、试剂与器具（1）材料。苏云金芽孢杆菌斜面菌种。（2）试剂。木糖，葡萄糖，半乳糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖，阿拉伯糖，无菌生理盐水等。（3）器具。50mL 三角瓶，接种工具，超净工作台，恒温摇床，分光光度计。

四、操作步骤（1）根据葡萄糖蛋白胨水培养基配方，分别配制木糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖蛋白胨水培养基，分装入 50mL 三角瓶中 20mL 培养基，每种糖分装 4瓶，115℃ 下高压蒸汽灭菌后备用。（2）用无菌生理盐水洗出苏云金芽孢杆菌斜面菌种，配制成一定浓度的菌悬液，作为液体菌种。（3）在超净工作台中，以无菌操作技术每个三角瓶接入 0.5mL 菌悬液。每种糖接种 3瓶，留 1瓶作对照。置于恒温摇床 30℃ 、180r/min下培养 24h 。（4）取出三角瓶菌液，用分光光度计下测定 OD600，以不接种的同种糖培养液作对照调零。记录结果。

五、注意事项（1）接种时，菌悬液要混匀，每瓶接种量要等量；（2）测定 OD 值时，菌液要混匀后测定方能准确。

六、实验报告记录结果，并分析苏云金芽孢杆菌利用何种碳源生长最好。

pathogenic bacteria

vascular endothelial growth factor (VEGF)

optimal quantity 理想

tissue infiltration 组织浸润

granulation tissue 肉芽组织

Treatment with 6.4 mM delmopinol for 1 min resulted in marked ultrastructural changes of cell wall components and the outer cell membrane of the 3 gram-negative species compared with control cells, whereas the gram-positive streptococci treated with delmopinol showed little or no morphologic alteration as compared with untreated cells.

主要影响：引起膜电荷变化，从而影响营养吸收；影响酶活性；改变营养物状态和有害物毒性。有最适pH ，此时酶活性最高，其他条件适合，生长速率最高，但不是生产的最适pH 。微生物细胞内的pH 多接近于中性