从猪血中分离纯化高纯度的猪血红蛋白

2008年5月M ay 2008

色谱Vo l . 26N o. 3

C h inese J ou rna l of C h rom a tog raphy

384～387

从猪血中分离纯化高纯度的猪血红蛋白

周　勃, 　边六交

(西北大学生命科学院国家微检测系统工程技术研究中心, 陕西西安710069)

摘要:为了从猪血中分离纯化高纯度的猪血红蛋白, 建立了通过超滤、D EA E 2S ep ha rose Fas t F low 离子交换色谱和

Sep hadex G 275凝胶排阻色谱三步法制备高纯度猪血红蛋白的方法, 并通过十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SD S 2PAG E ) 、高效凝胶排阻色谱和反相高效液相色谱方法, 对纯化后的猪血红蛋白进行了鉴定。经三步分离纯化后, 猪血红蛋白的纯度大于99%,含量为11328g /L。

关键词:超滤; 阴离子交换色谱; 凝胶排阻色谱; 猪血红蛋白; 分离; 纯化中图分类号:O 658　　文献标识码:A 　　文章编号:100028713(2008) 0320384204　　栏目类别:研究论文

S ep a ra t io n a n d p u r if ica t io n o f p o rc in e

h em o g lo b in f rom p o rc in e b lo o d

ZHOU B o, B I AN L iu jiao

(College L ife Scien ce, N or thw es t U n ivers i ty, N a tion a l En gin eer in g Resea rch

Cen ter for M in ia tu r ized D etection Sys tem , X i ’a , a )

A b s t ra c t:In o rde r to p e rfo r m the iso la tion and u of o rc in from p o rc ine b lood. A th ree 2s tep m e thod, u u 2rose Fas t F low an ion 2ex 2change ch rom a tograp G l ion ch rom a tog rap hy in sequence, fo r the sep a ra o ine oglob in w as deve lop ed.

The ob ta ined hem oglob in

w as ana sod su lfa te 2p o lyac rylam ide ge l e lec trop ho res is (SD S 2PAG E ) , h igh 2p e rfo r m s 2exc lus ion ch rom a tograp hy and reve rsed 2p hase h igh p e rfo r m ance liqu id ch ro 2m a tograp hy. Th rough the th ree 2s tep p u rifica tion p rocess, the p u rity of the ob ta ined hem oglob in w as m o re than 99%w ith a concen tra tion of 11328g /L.Ke y w o rd s:u ltrafiltra tion;

an ion 2exchange ch rom a tograp hy;

ge l exc lus ion ch rom a tog rap hy;

p o rc ine hem oglob in; sep a ra tion; p u rifica tion

　　血红蛋白(hem og lob in, H b ) 是存在于动物血红细胞中具有生物传氧功能的重要蛋白质。多年来, 以血红蛋白为基础的血液代用品研究一直是国内外医学界研究的重点。该代用品较好地解决了输血血源短缺及血源污染等问题, 某些产品目前已经完成或部分完成了临床实验, 取得了突破性的进展索更为有效的血红蛋白纯化方法。

　　目前血红蛋白分离纯化的方法很多, 如离心透析吸附等。近年来, 国内亦见到少量血红蛋白分离纯化方法的报道。樊晶等

[4]

[1-3]

白; 李涛等路秀玲等

[6]

使用热敏法纯化人脐带血血红蛋白;

[7]

利用膨胀床吸附纯化牛血红蛋白。研

[8]

究表明, H b 类血液替代品的副作用, 如肾毒性及某些细胞因子的诱导产生、血栓的形成等

, 皆与H b

溶液中所含细胞膜碎片或H b 以外的杂蛋白等有关。因此, 快速、有效、大量地制备高纯度血红蛋白至关重要。

　　本实验从新鲜猪血中提取的猪血红蛋白是用于制备一种血液代用品———戊二醛聚合血红蛋白, 因而要求猪血红蛋白需具超高纯度。上述已报道的分离工艺要么纯度达不到要求, 要么活性损失比较大, 很难满足用作血液代用品基质的血红蛋白的要求。为了得到高纯度且活性损失小的猪血红蛋白, 经过

。

因此对原料血红蛋白的要求也将越来越高, 需要探

应用萃取2超滤两步法

[5]

从过期人血中提纯人血红蛋白; 李军等从新鲜猪

血中通过微滤和弱阴离子交换色谱法提纯猪血红蛋

收稿日期:2007208214第一作者:周　勃, 硕士研究生. 通讯联系人:边六交, 教授. E 2m a il:b ian liu jiao @sohu. com. 基金项目:国家“863”计划项目资助(2004AA 205030) .

　第3期周　勃, 等:从猪血中分离纯化高纯度的猪血红蛋白

・385・

比较和筛选多种分离纯化方案, 本文建立了一种采用超滤、D EA E 2Sep ha rose Fas t F low 离子交换色谱和S ep hadex G 275凝胶排阻色谱三步法从新鲜猪血中分离纯化高纯度猪血红蛋白的工艺方法。

(SD S 2PAG E ) 、高效凝胶排阻色谱和反相高效液相

色谱对分离纯化的猪血红蛋白进行纯度测定。

　　电泳分离胶的浓度(以体积分数表示) 为12%,浓缩胶的浓度(以体积分数表示) 为5%,以考马斯亮蓝R 2250染色。

　　高效凝胶排阻色谱:采用“11111”节所述TSK 2G EL G 4000SW XL 凝胶色谱柱, 流动相为20m m o l/L磷酸盐缓冲液2012m o l/LN aC l (pH 715) , 流速为110m L /min, 检测波长为280nm , 进样量20μL 。　　反相高效液相色谱:采用“11111”节所述Sh i m 2p ack VP 2OD S 反相色谱柱; 流动相A 液为含011%三氟乙酸的水溶液, B 液为含011%三氟乙酸的乙腈溶液, 梯度洗脱程序为0～30m in, 100%A液线性变化到100%B 液; 30～40m in, 100%B 液; 流动相流速为1m L /min, 紫外检测波长为280nm , 进样量为100μL 。1. 法

[91　实验部分

1. 1　材料

1. 1. 1　色谱介质和试剂

　　色谱介质D EA E 2Sep ha rose Fas t F low 和

Sep hadex G 275均购自瑞典Am e rsham Pha r m ac ia B io tech AB 公司; 高效凝胶排阻色谱柱TSK 2G EL G 4000SW XL (300m m ×718m m ) 和反相高效液相色谱柱Sh i m 2p ack VP 2OD S (150m m ×416m m ) 均购自岛津公司。低相对分子质量标准蛋白质购自上海生工生物工程公司; 猪血红蛋白对照品及猪血红蛋白粗品均由陕西北美基因股份有限公司提供; 其余试剂均为分析纯。1. 1. 2　仪器及设备　　美国B io 2R ad 公司的B io 2L og ic L P 型梯度常压液相色谱仪, 日本岛津公司的LC 210A 压液相色谱仪, UV 2型紫外2可见分光2R 的i . PRO TEAN ; V I LB ER LOU R 2

MA T 22. 1　D EA E 2S ep ha rose F a s t F low 阴离子交换色谱

　　经过超滤的猪血红蛋白在D EA E 2Sep ha rose

Fas t F low 阴离子交换色谱柱上的分离图谱见图1

。

1. 2　猪血红蛋白的分离纯化1. 2. 1　超滤

　　将样品用012μm 滤膜过滤, 滤液置于4℃冰箱内保存。

1. 2. 2　阴离子交换色谱分离

　　阴离子交换色谱所用固定相为D EA E 2S ep ha 2rose Fas t F low , 柱规格为315cm ×20cm 。洗脱液A 液为50m m o l/LT ris 2HC l 缓冲液(pH 815) , B 液为50m m o l/LT ris 2HC l 缓冲液+015m o l/LN aC l

(pH 815) ; 梯度洗脱程序为0～50m in, 100%A液;

50～240m in, 从100%A液线性变化到100%B液。240～300m in, 100%B 液; 洗脱流速为611m L /min 。

紫外检测波长为280nm 。样品为“11211”节中所得滤液。

1. 2. 3　凝胶排阻色谱分离

图1　经膜过滤的猪血红蛋白在D EA E 2S ep h a ro s e F a s t

F low 阴离子交换色谱柱上的色谱分离图

F ig. 1　C h rom a to g ram o f m em b ra n f ilt ra te d p o rc in e hem o 2

g lo b in o n a D EA E 2S ep h a ro s e F a s t F low co lum n

　　C o lum n s ize:315cm ×20cm. B uffe r A:50mm o l/LTris 2HC l (pH 815) ; buffe r B :50mm o l/LTris 2HC l +015m o l/L

() N aC l pH 815; e lu tion grad ien t p rogram :0-50m in, 100%

buffe r A; 50-240m in, buffe r B inc reased linea rly from 0to

　　凝胶排阻色谱所用的固定相为Sep hadex G 2

75, 柱规格为315cm ×150cm , 洗脱液为20m m o l/L磷酸盐缓冲液(pH 715) , 流速为214m L /min, 紫外检测波长为280nm 。样品为阴离子交换色谱分离所得的含猪血红蛋白的收集液。1. 3　猪血红蛋白纯度的检测　　应用十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳

100%; 240-300m in, 100%buffe r B; flow ra te:611mL /min.

Sam p le:abou t 6mL m em b ran filtra ted p o rc ine hem oglob in. L eft Y 2ax is:UV abso rbance a t 280nm ; righ t Y 2ax is:conduc tiv 2

ity of e lu tion so lu tion.

　　由图1可以看出, 猪血红蛋白经D EA E 2Sep ha 2

rose Fas t F low 柱分离后得到4个洗脱峰:峰Ⅰ(25

～35m in ) 、峰Ⅱ(40～52m in ) 、峰Ⅲ(120～180

・386・色谱

2. 4　猪血红蛋白的纯度分析

第26卷

m in ) 和峰Ⅳ(272～285m in ) 。收集各洗脱峰, 用紫

外2可见分光光度计在415nm 下分别对各峰进行检

测, 其中峰Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ组分在415nm 下均没有特征吸收, 为杂蛋白组峰; 峰Ⅲ为目的蛋白峰。收集图1中的峰Ⅲ流出液, 通过SD S 2PAG E 、高效凝胶排阻色谱和高效反相液相色谱方法, 鉴定其纯度分别为9914%,9913%,9815%。为了达到下一步聚合的要求, 还需要在Sep hadex G 275柱上进行进一步的分离和纯化。

2. 2　S ep h a d e x G 275凝胶排阻柱色谱　　收集D EA E 2Sep ha rose Fas t F low 柱分离得到的含有猪血红蛋白的组分(峰Ⅲ) 后, 上样至S ep ha 2dex G 275柱, 采用等度洗脱, 分离图谱见图2。由图2可见, 经D EA E 2Sep ha rose Fas t F low 柱分离后,

　　对图2中峰Ⅴ的流出液进一步进行纯度分析。

2. 4. 1　12%SD S 聚丙烯酰胺凝胶电泳

　　将经过超滤、D EA E 2Sep ha rose Fas t F low 弱阴离子交换色谱柱和Sep hadex G 275凝胶色谱柱三步分离纯化所得到的蛋白样品(即图2中的峰Ⅴ) 进行SD S 2PAG E 分析, 电泳图谱见图3。SD S 2PAG E 中H b 的迁移仅与其相对分子质量有关, 在经过三步纯化后, 电泳只显示一条蛋白质条带, 说明该血红蛋白的相对分子质量均一, 为典型的血红蛋白SD S 2PAG E 图像。经过凝胶扫描分析, 该猪血红蛋白的电泳纯度达9919%

。

含猪血红蛋白的组分(峰Ⅲ) 在Sep hadex G 275凝胶排阻柱上得到一个峰(峰Ⅴ) , 其保留时间为380～600m in

。

图3　图2中峰Ⅴ的SD S 2PA G E 分析F ig. 3　SD S 2PA G E a n a lys is o f th e f ra c t io n

o f p e a k Ⅴin F ig. 2

　　1. p ro te in m a rke rs (M r from top to bo ttom :97400,

66200, 43000, 31000, 20100, and 14400, 2, 3, 4. p eak Ⅴin F ig . 2.

resp ec tive ly ) ;

2. 4. 2　高效凝胶排阻色谱

图2　图1中峰Ⅲ组分在S ep h a d e x G 275凝胶

色谱柱上的色谱分离图

F ig. 2　C h rom a to g ram o f th e f ra c t io n o f p e a k Ⅲ

in F ig. 1o n a S ep h a d e x G 275co lum n

　　Co lum n s ize:315cm ×150cm ; e lu tion buffe r:20mm o l/Lp hosp ha te so lu tion (pH 715) ; flow ra te:214mL /min; sam p le:

abou t 65mL so lu tion frac tion co llec ted from D EA E Sep ha rose Fas t F low co lum n. Left Y 2ax is:UV abso rbance a t 280nm ; righ t Y 2ax is:conduc tivity of e lu tion so lu tion.

　　采用TSK 2G EL G 4000SW XL 凝胶柱对所分离提取的猪血红蛋白(即图2中的峰Ⅴ) 进行分析, 其分析图谱见图4, 测定其纯度约为9919%

。

2. 3　猪血红蛋白的回收率

　　表1给出了猪血红蛋白粗品在三步分离纯化的各阶段的回收率。

表1　三步分离纯化各阶段的猪血红蛋白的回收率T a b le 1　P o rc in e h em o g lo b in re co ve r ie s in u lt ra 2

f ilt ra t io n, D EA E 2S ep h a ro s e F a s t F low a n d S ep h a d e x G 275co lum n

M e thod U ltrafiltra tion D EA E 2Sep ha rose Fas t F low Sep hadex G 275

ρ(P ro te in ) /

(g /L)

m (P ro te in ) /

m g

R ecove ry /

%

1005. 8971. 328

600553. 8496. 2

90. 083. 274. 5

图4　猪血红蛋白在TS K 2G EL G 4000SW XL

凝胶柱上的分离图谱

F ig. 4　C h rom a to g ram o f th e p o rc in e h em o g lo b in

o n a TS K 2G EL G 4000SW XL co lum n

　　Co lum n s ize:300mm ×718mm ; e lu tion buffe r:20mm o l/Lp hosp ha te so lu tion (pH 715) con ta in ing 012m o l/LN aC l ; flow ra te:110mL /min; UV de tec tion a t 280nm. Sam 2p le:20μL so lu tion frac tion co llec ted from a Sep hadex G 275

co lum n.

　第3期

2. 4. 3　高效反相液相色谱

周　勃, 等:从猪血中分离纯化高纯度的猪血红蛋白

[10]

・387・

　　采用VP 2OD S 柱对所分离提取的猪血红蛋白(即图2中的峰Ⅴ) 进行分析, 其分析图谱见图5。用VP 2OD S 柱测定其纯度约为9911%

。

率高的优点。进而采用D EA E 2Sep ha rose Fas t

F low 阴离子交换柱色谱分析, 与以往采用的阳离子和强阴离子交换柱相比较, 该阴离子交换柱可以更好地保持蛋白质的活性, 同时分离速度快、吸附容量大, 也便于放大到生产规模。实验结果表明通过上述方法所得到的猪血红蛋白具有很高的纯度, 而且工艺简单, 处理量大, 是一种理想的猪血红蛋白分离和纯化的方法。目前我们正对此工艺进行工业化规模放大研究。参考文献:

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c ine. B e ijing:Ch ina Sc ience and Techno logy P ress (杨成

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图5　猪血红蛋白在VP 2OD S 反相色谱柱上的分离图谱

F ig. 5　C h rom a to g ram o f t h e p o rc in e h em o g lo b in

o n a VP 2OD S co lum n

　　Co lum n s ize:150mm ×416mm ; buffe r A:H 2O 2011%

(v /v ) trifluo roace tic ac id; buffe r B :ace ton itrile 2011%(v /v ) trifluo roace tic ac id;

e lu tion grad ien t p rogram :0-30m in,

buffe r B inc reased linea rly from 0to 100%; 30-40m in, 100%buffe r B; flow ra te:1mL /min; UV de tec tion a t 280nm. Sam 2p le:100μL so lu tion frac tion co llec ted from a Sep hadex G co lum n.

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[2]　Chang T M S. A rtif Ce lls B lood Subs tit I mm ob il B io techno l,

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3　结论

　　在采用超滤、D EA E 2Sep ha rose Fas t F low 弱阴离子交换色谱柱和Sep hadex G 275凝胶色谱柱对猪血红蛋白进行分离纯化的过程中, 膜分离是大量制备高纯度血红蛋白的重要步骤, 具有无污染、操作方便、节省原材料、条件温和、蛋白变性少且回收

等. 化工学报) , 2003, 54(9) :1257

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[9]　Fo r m an C, D rabk in D L, Eh rich W E. Am J M ed Sc i, 1949,

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[10]　W en T, L iu Y Z, Fang J H, e t a l . M em b rane Sc ience and

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