药理实验方法
丁苯酞又名芹菜甲素,最初发现于芹菜籽中,其药效学特点涵盖了很多方面作用:1、能改善缺血脑能量代谢;2、明显缩小大鼠局部脑缺血脑梗塞面积,改善神经功能缺失;3、改善局部脑缺血引起的脑水肿;4、对缺血区局部脑血流和软脑膜微循环有明显改善作用;5、能显著改善局部脑缺血引起的记忆障碍。在中国专利93117148.2中,公开了芹菜甲素在制备预防和治疗哺乳动物或人类脑缺血引起的疾病的药物中的应用。另外在中国专利03137457.3中,公开了L-丁苯酞在制备预防和治疗痴呆,尤其是阿尔茨海默病、血管性痴呆的药物中的应用。
目前市场上已经有丁苯酞软胶囊、丁苯酞氯化钠注射液等产品上市。
丁苯酞的化学结构式如式(1):
其光学活性化合物L-丁苯酞结构式如式(2):
2-莰醇是中国传统中药(龙脑) 中的主要成分,2-莰醇分为消旋体、右旋异构体、左旋异构体。其中,(+)-2-莰醇为天然冰片(右旋龙脑)主要成分,根据药典(中华人民共和国《药典》2010年版一部)规定,在天然冰片(右旋龙脑)中(+)-2-莰醇含量不少于96.0%;(-)-2-莰醇为艾片(左旋龙脑)主要成分,根据药典(中华人民共和国《药典》2010年版一部)规定,在艾片(左旋龙脑)中(-)-2-莰醇含量不少于85.0%;(±)-2-莰醇为冰片(合成龙脑)主要成分,根据药典(中华人民共和国《药典》2010年版一部)规定,在冰片(合成龙脑)中2-莰醇含量不少于55.0%。作为传统常用中药,冰片具有开窍醒神,清热止痛的功效,在中药中常作为“引药”
应用。
以下是丁苯酞或其光学活性化合物左旋丁基苯酞与2-莰醇或其光学活性化合物以及与天然冰片(右旋龙脑)、艾片(左旋龙脑)、冰片(合成龙脑)、分别组合的药用效果试验。
试验1:对局灶性脑缺血再灌损伤的保护作用
1.1材料与方法
1.1.1实验动物
Sprague-Dawley(SD)大鼠,雄性,清洁级,体重260-290g。
1.1.2方法
1.1.2.1脑缺血模型的制备
采用颈内动脉线栓法制备大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)脑缺血再灌注模型。动物用7%水合三氯乙醛(6ml/kg)麻醉后,俯卧位固定于手术台上,消毒皮肤,颈部正中切开,分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉,轻轻剥离迷走神经,结扎并剪断颈外动脉,循颈内动脉向前,结扎翼腭动脉。夹闭颈总动脉近心端,从颈外动脉的结扎线的远端作一切口,插入外径为0.285mm的尼龙线,进过颈总动脉分叉进入颈内动脉,然后徐徐插入至有轻微阻力为止(自分叉处约20mm),阻断大脑中动脉的所有血供,右侧脑缺血2h后,轻轻拔出尼龙线,恢复血供进行再灌注,缝合皮肤,消毒。
1.1.2.2给药
制备脑缺血模型后,将动物机率均等单盲分配至各组。动物于再灌注后立即静脉给药1次,模型组动物给予等体积的生理盐水。脑缺血后24小时评价神经缺陷症状,而后处死动物,取脑,染色,拍照测定脑梗死面积。
1.1.2.3动物分组与给药剂量
DL-丁苯酞组80mg/kg、L-丁苯酞40mg/kg、DL-丁苯酞/天然冰片(右旋龙脑)80mg/kg+8mg/kg、DL-丁苯酞艾片(左旋龙脑)80mg/kg+8mg/kg、DL-丁苯酞/冰片(合成龙脑)80mg/kg+8mg/kg、L-丁苯酞/天然冰片(右旋龙脑)80mg/kg+8mg/kg、L-丁苯酞艾片(左旋龙脑)80mg/kg+8mg/kg、L-丁苯酞/
冰片(合成龙脑)80mg/kg+8mg/kg、DL-丁苯酞/(±)-2-莰醇组
80g/kg+8mg/kg、DL-丁苯酞/(+)-2-莰醇组80mg/kg+8mg/kg、DL-丁苯酞/(-)-2-莰醇组80mg/kg+8mg/kg、L-丁苯酞/(±)-2-莰醇组
40mg/kg+8mg/kg、L-丁苯酞/(+)-2-莰醇组40mg/kg+8mg/kg、L-丁苯酞/(-)-2-莰醇组40mg/kg+8mg/kg。
1.1.2.4神经缺陷症状评分及脑梗死面积的测定
采用改良Bederson 5分制法进行神经缺陷症状评价。采用单盲法评价脑缺血后大鼠的神经缺陷症状,即由试验设计者将动物按组标记,对神经缺陷症状进行评分的试验者不知道动物的分组情况,评分结束后,评分者将各种标记的评分结果呈交设计者,由设计者揭盲,获得各试验组每只动物的评分。
神经缺陷症状评分Bederson 5分制法
0:提尾悬空时,动物的两前肢均伸向地板方向,且无其他行为缺陷。
1:提尾悬空时,动物的手术对(左)侧前肢表现为腕肘屈曲、肩内旋、肘外展、紧贴胸壁。
2:将动物置于光滑平板上,推手术侧肩向对侧移动时阻力降低。
3:动物自由行走时,向手术对侧环行或转圈。
4:肢体软瘫,肢体无自发活动。
脑梗死程度的测定,动物处死后,断头取脑,去除嗅球、小脑和低位脑干,用生理盐水冲洗大脑表面血迹,吸去表面残留水迹,于-20℃放置20min,取出后立即于视线交叉平面垂直向下作冠状切面,并向后每隔2mm切一片,将脑片置于2%TTC染液中孵育(37℃90min),正常脑组织染成深红色,缺血脑组织则呈苍白色,用生理盐水冲洗后,迅速将脑片从前向后按顺序排成一排,吸干表面残留水迹,拍照。
照片用图像分析软件处理,根据公式计算左脑相应的体积以及梗死灶体积,求出梗死灶百分比。
梗死体积计算法:
V=t(A1+A2+A3+ ........ +An)
t为切片厚度,A为梗死面积。
%I=100%×(VC-VL)/VC
%I为梗死体积百分比,VC为对照侧(左脑半球)脑体积,VL为梗死侧(右脑半球)非梗死区域体积。
1.1.2.5统计学分析
定量资料表示为均值±标准差。脑梗死面积和神经缺陷症状评分采用单因素方差分析,Scheffe's检验测定两组间的差异显著性。将差异P
1.2实验结果
1.2.1对神经缺陷症状的影响
神经缺陷症状的程度:与模型组(神经缺陷症状评分:2.58±1.01)相比,各复方组均能显著改善神经缺陷症状,其中DL-丁苯酞/(-)-2-莰醇组、DL-丁苯酞/(+)-2-莰醇组效果最好,分别为(0.58±0.61*)、(0.61±0.71*);L-丁苯酞/冰片(合成龙脑)组、DL-丁苯酞/冰片(合成龙脑)组在复方组中表现较差:(0.82±0.58*)、(0.83±0.42)。DL-丁苯酞组、L-丁苯酞与模型组比较,虽有改善神经缺陷症状的趋势,但未达到显著水平:(1.47±0.39*)、(1.42±0.55)。
1.2.2对脑梗塞面积的影响
对脑梗塞面积的影响:与模型组相比(脑梗面积(%):36.9±14.8),各复方组组均能显著减小动物缺血再灌后脑梗塞面积,其中DL-丁苯酞/(-)-2-莰醇组、DL-丁苯酞/(+)-2-莰醇组效果最好,分别为(8.5±8.2*)、(8.9±7.2*);L-丁苯酞/冰片(合成龙脑)组、DL-丁苯酞/冰片(合成龙脑)组在复方组中表现较差:(14.5±9.5*)、(1.53±6.4)。DL-丁苯酞组、L-丁苯酞与模型组比较,虽有减小脑梗面积的趋势,但未达到显著水平(24.1±12.3*)、(23.5±16.4)。
实施例2: 对东莨菪碱所致痴呆小鼠学习能力的影响
2.1材料:
药物:
哈伯因(石杉碱甲片)。
氢溴酸东莨菪碱注射液。
健康清洁级ICR小鼠,5-6周龄,18~22g,雌雄各半。
仪器:成都泰盟DT200小鼠跳台仪。
2.2实验方法:
动物分组与给药剂量
哈伯因组66.67ug/kg、DL-丁苯酞组30mg/kg、L-丁苯酞15mg/kg、DL-丁苯酞/天然冰片(右旋龙脑)30mg/kg+3mg/kg、DL-丁苯酞艾片(左旋龙脑)30mg/kg+3mg/kg、DL-丁苯酞/冰片(合成龙脑)30mg/kg+3mg/kg、L-丁苯酞/天然冰片(右旋龙脑)15mg/kg+3mg/kg、L-丁苯酞艾片(左旋龙脑)15mg/kg+3mg/kg、L-丁苯酞/冰片(合成龙脑)15mg/kg+3mg/kg、DL-丁苯酞/(±)-2-莰醇组30mg/kg+3mg/kg、DL-丁苯酞/(+)-2-莰醇组30mg/kg+3mg/kg、DL-丁苯酞/(-)-2-莰醇组30mg/kg+3mg/kg、L-丁苯酞/(±)-2-莰醇组15mg/kg+3mg/kg、L-丁苯酞/(+)-2-莰醇组15mg/kg+3mg/kg、L-丁苯酞/(-)-2-莰醇组15mg/kg+3mg/kg
给药
灌胃给药,每日一次,连续10天,对照组给予相同体积溶剂对照。
观测的指标
小鼠跳台装置为六个长方形反射箱,大小为10cm*10cm*30cm,用黑色塑料板分隔成为6间。底面为不锈钢网栅,网栅间距为0.5cm。每间左后角放置一高和直径4.5cm的橡胶站台。将小鼠面向墙角轻轻放置与站台上,适应环境3min,然后通以32V电流。若动物跳下站台则受电击,其正常反应应该是跳回站台以躲避伤害性刺激,多数动物可能会再次或多次跳至网栅上,受到电击后又迅速跳回站台。本实验末次给药后1小时进行跳台训练,24小时后测试记忆成绩。模型组及各给药组于测试前30分钟腹腔注射东莨菪碱2mg/kg,对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水。将小鼠面向墙角放置于站台上,观察并记录5分钟内小鼠跳下站台而遭受电击的次数和潜伏期。5min内未跳下的小鼠其跳台潜伏期按300s计算。
统计方法 所有数据用均数±标准差(±s)表示。采用SPSS软件,对符合正态分布的数据,均数比较用单因素方差分析,若方差齐,两两比较采用最小显著差法,若方差不齐则采用Dunnett’s T3检验行两两比较;如不符合正态分布,则用非参数检
验Kruskal—Wallis进行统计分析。
2.3结果
与空白对照组(潜伏期(s):255.0±89.7、错误次数(次):0.8±1.3)对比,模型组潜伏期明显缩短(50.6±43.1),错误次数明显增加(9.2±6.3)。哈伯因组与模型组比小鼠潜伏期明显延长(123.1±113.2),错误次数明显减少(3.2±2.2)。
各复方组潜伏期均有不同程度的延长,错误次数也明显减少,均具有统计学差异,其中DL-丁苯酞/(-)-2-莰醇组(潜伏期(s):203.5±192.6、错误次数(次):1.0±2.2);、DL-丁苯酞/(+)-2-莰醇组(潜伏期(s):204.2±175.6、错误次数(次):1.1±2.0)效果最好;L-丁苯酞/冰片(合成龙脑)组、DL-丁苯酞/冰片(合成龙脑)组在复方组中表现较差:(潜伏期(s):160.0±158.6、错误次数(次):1.4±1.6)、(潜伏期(s):158.0±167.6、错误次数(次):1.5±1.4)。DL-丁苯酞组、L-丁苯酞与模型组比较,虽有减小脑梗面积的趋势,但未达到显著水平(潜伏期(s):124.0±131.6、错误次数(次):2.1±1.3)、(潜伏期(s):123.5±162.6、错误次数(次):1.4±1.5)。 小结:丁苯酞与左旋丁苯酞均有明显的缺血性脑卒中及脑痴呆的药理作用。丁苯酞、左旋丁苯酞与冰片、天然冰片、艾片、2-莰醇、(+)-2-莰醇、(-)-2-莰醇分别组合,无论是脑卒中或脑痴呆,疗效均获得明显增加。通过对不同含量冰片进行试验,选取天然冰片(2-莰醇含量:96%、99%)、冰片(2-莰醇含量:55%、75%、99%)、艾片(2-莰醇含量:(85%、92%、99%),根据试验数据显示冰片中莰醇含量不同,脑卒中及脑痴呆药理效果均有一定的不同,冰片中莰醇含量越低,杂质越多,药理效果相对也越差。