第15章 细胞毒免疫学试验技术
第15章 细胞毒免疫学试验技术
免疫应答进行中,既有非特异杀伤细胞和特异性杀伤细胞,同时既有非特异细胞毒分子(因子),和特异性细胞毒因子,它们的免疫反应结果会导致靶细胞裂解死亡。
一、癌细胞的杀伤研究:
随着免疫学技术的发展,近年来对癌细胞杀伤的免疫效应报告甚多。大体为: 1、非特异杀伤肿瘤细胞:如自然杀伤细胞(NK 细胞)、K 细胞,是体内抗肿瘤的第一道防线,NK 可自发杀肿瘤细胞,K 细胞依赖于抗肿瘤细胞的抗体存在而发生杀肿瘤效应。体外可用细胞毒试验方法来进行研究。通常采用Cr 释放试验来观察其杀伤效应。
2、特异杀伤肿瘤细胞:人体内特异杀肿瘤细胞为TC (或TK )杀伤效应,该细胞的特异杀伤需要特异抗原预先致敏TC (或TK )细胞,以区别于非特异杀伤。
3、某些淋巴因子的调节作用:近年来人们用IFN (特别是IFN-r )、IL-2等细胞因子来处理淋巴细胞均可大大增强NK 、K 、TC 细胞等杀伤效应,特别是用IL-2培养癌症患者淋巴细胞可诱发和激活LAK 等杀伤细胞,经体外增殖达一定量时再输回患者体内,可治疗晚期癌症。有关LAK 细胞的制备和测定杀伤效应的方法见第三篇第四章。
4、中草药对杀伤细胞的调节作用。中草药是祖国医药宝库。有许多补气类中草药及其提取物(如多糖或皂甙成分等)已在临床用于治疗肿瘤,体外细胞培养技术证明中草药中的人参、黄芪、刺五加、茯苓等均可促进细胞产生干扰素(IFN-r 、β、α)、白细胞介素-2(IL-2)和增强NK 、K 、TC 的杀伤效应。
5、单克隆抗体的生物导弹作用:近年来已有许多癌细胞的单克隆抗体出现,若将杀肿瘤的毒性药物挂在抗体上,再将此抗体作为导弹输入患者体内,该抗体一旦与体内肿瘤细胞特异结合可发挥杀肿瘤效应。目前已在体外细胞培养中获得了许多证据,不久将指导用于临床。若与上述淋巴因子制成联合剂型可能效果更好。
6、药物的毒性作用:为了筛选理想的癌细胞毒性物质或抑制物质如化疗药物,通常采用相应的癌细胞进行体外试验,以寻找最佳化疗药物和适宜的药物浓度,为临床用药提供依据。
二、细胞毒试验:
细胞毒试验是在组织培养中研究淋巴细胞、抗体或抗体依赖性淋巴细胞杀伤靶细胞的一种技术,也是在体外研究特异性细胞免疫比较可靠和灵敏的方法,目前微量细胞毒试验是应用最广的一种方法。
(一) 淋巴细胞对瘤细胞的细胞毒试验:
(1)瘤细胞培养物制成悬液,并稀释至需要的细胞浓度。
(2)于微量试验板的小孔内分别接种0.2ml 瘤细胞(内含5×10个细胞) ,37℃培育24小时。
(3)细胞贴壁后,轻轻倾去培养液,加1mlPBS 洗涤,倾去洗涤液及未贴壁细胞。 (4)向小孔分别加入0.2ml 淋巴细胞(分别含有5×10×10,5×10个细胞) ,使淋巴细胞与瘤细胞之比依次为1000:1、100:1、10:1。
(5)45分钟后加0.1ml 5%胎牛血清,37℃继续培养2~3天。
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(6)2%台盼兰染色,翻转微量试验板,计数活存的瘤细胞,并设有正常人淋巴细胞代替肿瘤患者淋巴细胞作对照,每份需同时作三个复孔,分别检查各孔中活存细胞数,按下列公式计算细胞毒%,并作t 检验。
对照组小孔活存细胞数—试验孔活存细胞数 细胞毒%= 对照组小孔成活细胞数 - 试验孔成活细胞数 ×100%
对照组小孔活存细胞数
细胞毒(%)= ——————————————————————— ×100% 对照组小孔成活细胞数
(二) 抗体加补体的细胞毒试验:
此法是组织相容性(抗原HLA )检查技术中最常用的一种方法。也称微量淋巴细胞毒试验。
人体的组织相容性抗原存在于淋巴细胞膜的表面,从供者与受者的血液分离淋巴细胞作为靶细胞,以各种定型单价抗血清与家兔血清补体作为效应系统。如果淋巴细胞表面具有与抗血清相对应的抗原,则淋巴细胞就会受损伤或致死而被台盼兰着色,方法如下:
材料:
淋巴细胞分离方法见前:
血清:小牛血清(56℃30分钟灭活)
待测血清:收集多产妇分娩时的胎盘剥离后的血,分出血清,叠氮钠防腐,4℃保存。 已知阳性对照血清:用上海市中心血站制备的马抗人淋巴细胞血清(ALS),同时作1:3稀释。
补体:新鲜家兔混合血清,分装小试管,保存于-20℃。 步骤:
(1)在塑料试验盒(市售) 内加入医用液体石蜡油20ml ,放进一块52孔微量玻璃试验板,使板沉至盒底。
(2)用0.25毫升的微量定量加液器分别加入待测血清和阳性对照血清2-3微升/孔,阴性对照用Hanks 液代之。加样针尖应磨平。
(3)用同法每孔内加入待测的淋巴细胞2~3微升,应先加阴性对照和补体对照孔,然后加待测孔,最后加阳性血清对照孔,加后轻摇使其混匀,置室温作用1小时。
(4)每孔加入兔补体5-7微升(按加淋巴细胞顺序加入) ,置37℃培育45分钟(或室温作用1小时) 。
(5)每孔加入2%台盼兰等渗液3-5微升静置室温中20分钟,吸去兰色上清液。 (6)普通显微镜检查,记录每孔中死细胞(着色细胞) 数。 死细胞:体积稍大,着兰色,无折光性。 活细胞:大小正常,未着色,较透亮。 判断标准:(每次实验,需做3-6个复本)。 其中着色细胞:≤20% 阴性 20%—50% 弱阳性
50%—70% 阳性 ≥70% 强阳性 (三)ADCC 试验:
抗体依赖细胞介导细胞毒用来检查K 细胞的FC 受体,该细胞结合抗体杀伤靶细胞的作用是无特异性的,故称为抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。操作方法参照下表2-11。
说明:
①1、2、3号为试验管;
②4、5、6号为对照管(抗体靶细胞); ③7号管为对照管(淋巴细胞,靶细胞); ④8号为靶细胞对照(自然释放率);
⑤9号管用NP40溶解靶细胞,为100%释放率;
⑥为精确计算,每一份应作2~3套复管,取平均值,计算方法与NK 细胞Cr 释放法类同。
(四)NK 细胞毒试验之一 ——Cr 释放法:
效应细胞的制备:用常规的Ficoll 分离法分离外周血中的单核细胞,经玻瓶37℃贴壁2小时,以除去单核——巨噬细胞,计数活细胞数,使细胞浓度为5×10/ml,细胞存活率为95%以上(小鼠可用鼠脾细胞)。
靶细胞制备:取培养24—48小时的K562细胞(小鼠可用Yac-1细胞),1640培养液洗一次,用营养液配成4×10/0.5ml,加100uci Cr,37℃水浴90分钟,隔15分钟摇匀一次,然后洗涤三次,除去游离的Cr ,计数活细胞,稀释细胞数达1×10/ml。
NK 活性测定用4小时短程释放法,自然杀伤组效靶细胞(50:1)各0.2ml ,自然释放组以营养液代效应细胞,最大释放组以2%SDS液代效应细胞,分别置37℃接触4小时,然后各管加冷Hanks 液0.6ml 终止反应,离心(1000r/min)10分钟,吸上清0.5ml ,用γ计数器测放射性(cpm )按下式计算:
对照组小孔活存细胞数—试验孔活存细胞数
细胞毒%= 自然释放组 cpm ×100%
对照组小孔活存细胞数 自然释放率(%)= ———————— ×100%
最大释放组cpm
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对照组小孔活存细胞数—试验孔活存细胞数 细胞毒%= 试验组释放 cpm- 自然释放组 cpm ×100%
对照组小孔活存细胞数 自然杀伤率(%)= ———————————————— ×100%
最大释放组cpm-自然释放组cpm
自然释放组cpm
自然释放率(%)= ×100
最大释放组cpm 对照组小孔活存细胞数—试验孔活存细胞数
细胞毒%= 标记细胞 cpm ×100%
对照组小孔活存细胞数 靶细胞标记率(%)= ————————=cpm/ 细胞
被标记细胞数 (五)NK 细胞毒试验之二——H-TdR 法。
取培养24-48小时的K562靶细胞,稀释至5×10/ml,效应细胞为人外周血单个核细胞,制成5×10/ml,细胞悬液,加入微板中,每孔加入靶细胞与效应细胞各0.1ml(效靶比例为100:1),靶细胞自然掺入对照组仅加入靶细胞悬液0.1ml ,用RPMI1640培养液0.1ml 代替效应细胞,每组均设三复孔,加入细胞悬液后,每孔立即加入H-TdRl μci ,然后置37℃ 5% CO 2中培养20小时,收集细胞于纤维滤纸上,用γ计数器测定cpm ,用特异抑制百分率(Pi )表示NK 活化,按下式计算:
cpm 实验组 实验组cpm
Pi=(1— ————————— ) ×100% Pi=( 1- ————————————)×100% 靶细胞自然掺入cpm
靶细胞自然掺入率cpm
(六)NKCF 检测(MTT 法):
培养三天的K562细胞经完全培养基洗涤一次后配成2.5×10/ml细胞悬液,在微孔培养板上加入50μl/孔,再加入含NKCF 标本50μl/孔,标本不同稀释度为1:2、1:4、1:8、1:16……,阴性对照为无NKCF 的培养基,阳性对照为蒸馏水,每份标本设三个复孔取其平均值,另设一个无细胞空白对照孔。置37℃ 5% CO2培养箱中培养24小时,加MTT 后的过程与活细胞检测基本相同,按下式计算各稀释度的NKCF 值(见第一篇第九章) 。
标本(或阳性对照) 阴性OD —标本(阳性)OD
对K562细胞杀伤率(%)= ———————————————— ×100% 阴性OD
标本杀伤率
标本中NKCF 杀伤活性= —————————×100% 阳性对照杀伤率
此外还有台盼兰排除法,通过计算细胞死亡率(或存活率)来表示NK 细胞的杀伤活性方法简便易行,但有客观因素,对NK 细胞的杀伤效应也可采用MTT 法。
(七)LAK 细胞毒试验
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I 释放法
LAK 细胞的制备:经乙醚麻醉后,无菌取鼠脾脏,淋巴细胞经挤压后,用四层纱布过滤,
经三次离心洗涤,制成细胞悬液,将浓度调整至10/ml,加IL-2制品1ml ,置5%CO2 37℃孵育5天,存活的淋巴细胞可作为LAK 细胞使用。
LAK 细胞体外细胞毒活性测定:用10个细胞加
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I 脱氧尿嘧啶核苷标记WBT-2M 纤维肉瘤靶细胞,每
I 尿嘧啶核苷4uci ,37℃条件下静置培养14小时,接着用Hanks 液三次离心,
充分洗涤,然后分别与效应细胞(新鲜脾细胞,经5天培养的脾细胞,LAK 细胞),置微量培养板中共同孵育6小时,吸取上清液:用γ计数器测定同位素的释放量,并依下列公式计算其细胞毒性的百分率(此法也可用H-TdR 掺入法和MTT 法):
实验组释放量—自然释放量
LAK细胞毒(%)= ——————————————— ×100% 最大释放量—自然释放量
注:每组三个复管,各管均需减去本底cpm 。 (八)CTL 的细胞毒试验:
取淋巴细胞1×10/ml,经ConA 3μg/ml刺激培养5日获效应CTL ,靶细胞用70μl 含1×10的
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I-UdR
标记的肥大细胞瘤P815细胞(DBA/2小鼠)或者为K562细胞,其方法为每孔加入50μl CTL ,
I-UdR 标记的P815细胞及30μl 的1/25稀释的PHA (或12μg/孔以利
诱导全部CTL 起杀伤作用,微板经1200r/min 5分钟后,37℃培养3.5小时后取出,再加入0.5%trypsin 50μl 再培养30分钟后以1200 r/min离心,取每孔中上清100μ加入小玻璃管中,将每孔中的细胞收获于玻璃纤维纸上,用γ计数器分别测上清及细胞中的cpm 值,按下式计算杀伤效应。
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全部上清cpm-(SRcpm-BGcpm )
特异杀伤%=—————————————————×100 全部上清cpm+ 细胞cpm-BGcpm
* SR为不加CTL 的自然释放对照组。 ** BG为仪器本底数
MR 为以每孔中加入0.1ml 2%SDS,为细胞完全溶解的最大释放量。