玉米2C型丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶活性与耐旱性的关系1
四川农业大学
硕士学位论文
玉米2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶活性与耐旱性的关系
姓名:何亮
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:李晚忱
20080501
摘要
干旱是玉米生产中最重要的非生物胁迫之一。研究表明,玉米不同自交系在耐旱性上存在显著差异。但是,耐旱性是众多形态、生理和生化特性协同作用的结果,而且不同的基因型可能涉及不同的胁迫应答方式,加之环境因素的干扰,耐旱性的鉴定在通常条件下比较困难。因此,耐旱候选基因的鉴定将有助于提高耐旱分子标记辅助选择育种的效率。同时,对于改良玉米品种的耐旱性有重要的指导意义。
在前期研究中,本实验室结合干旱地区品种推广实践,在严格控制土壤水分的干旱条件下,从57个常用玉米自交系中筛选出3个耐旱自交系“81565”、“N87-1"、“R09’’和3个不耐旱自交系“200B”、“ES40”、“丹340"。并利用改进的DDRT—PCR技术分析玉米强耐旱自交系“81565”在干旱处理和正常浇水对照差异表达的基因,发现IdDl、MD2和MD3三个在干旱胁迫下差异表达的基因片段,其中MD2为下调表达。序列分析和同源性比较表明,MD2与极端耐早的鼠尾栗属Sporobolusstapfianus丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C(PP2C)基因有88%相似性。采用电子克隆和RT-PCR技术相结合的方法克隆MD2基因片段的cDNA全序列,克隆的全长cDNA序列ZmPP2Ca为玉米仟凇基因家族的新成员,开放阅读框长1164bp,编码388个氨基酸残基。
本研究采用盆栽实验在模拟干旱胁迫和正常浇水条件下,选用三个耐旱自交系“81565”、‘'N87.1”和“R09”及三个不耐旱自交性“200B"、“ES40"和“丹340”,应用实时荧光定量PCR技术,对干旱胁迫下ZmPP2Ca基因在不同玉米自交系中的表达量进行检测。结果表明,在干旱胁迫下,ZmPP2Ca基因在3个耐旱自交系“81565’’、“R.09”和‘'N87.1”中的表达量呈现下调表达的模式,在胁迫处理6h时,表达量降到最低水平;在3个不耐旱自交系‘'200B”、“ES40”和“丹340"中的表达量呈现上调表达的模式。参考催化其逆反应的蛋白磷酸激酶在植物耐旱性中的重要作用,可以认为玉米丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C基因ZmPP2Ca,与玉米对干旱胁迫的应答有关。在同样的干旱胁迫条件下,叶片中丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C(PP2C)的活性变化检测结果表明,“81565"、“N87—1”和“R09"三个耐旱自交系随干旱处理时间的延长,叶片中的PP2C酶活性降低;不耐旱自交系“200B”和“ES40”随干旱处理时间的延长,叶片中的PP2C酶活性呈现先降低后回升的趋势;不耐旱自交系“丹340”在干旱胁迫下,叶片中的PP2C酶活性总体略有升高。
综上所述,ZmPP2Ca基因的差异表达以及由此引起的PP2C酶活性差异,可能与干旱胁迫条件下玉米细胞的信号传导有关,进一步深入研究有可能开发为基因内选择标记,为耐旱性分子标记辅助选择提供有用信息。关键词:玉米;丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶;PP2C;耐旱
ABSTRACT
Droughtisoneofthemostwidespreadabioticconstraintstomaizeproductionindevelopingcountries.Significantdifferenceofdroughttolerancehasbeenfoundamongmaizeinbredlines.HoweveLDroughttoleranceisbelievedtobetheresultofcooperativeinteractionsamongmultiplemorphological,physiologicalandbiochemicalcharacters.Moreover,differentgenotypesmayhavedifferentresponsestodroughtstress.Alongwitllinterferenceofenvironment,itisusuallydifficult
ordinaryconditions.Theidentification
ofbreedingforincreasedtoevaluatedroughttoleranceundertoofcandidategenesishelpfulimprovetheefficiencydroughttolerancebymarker-assistedselectionandto
improvedroughttoleranceofmaizevarieties.
Inpreviousstudy,weidentified3tolerant(81565、N87-1andR09)and2sensitive(200BandES40)inbredlinefrom57parentlinesofcommercialmaizehybrids
onunderstrictdroughtstress.Basedtheresults,themethodofmRNAdifferentialdisplayWas
ausedtoisolatedifferentialexpressiongenesfromdroughttolerantmaizeinbredline
‘81565’underdroughtstressandwell-wateredcontr01.Twodown—regulatedexpressiongenefragments(MD1andMD2)andoneup-regulatedexpressiongenefragmentwereobtainedunderdroughtstress.SequenceanalysisandhomologyalignmentshowedthatMD2had88%similarity嫡m
extremelygenePP2c,encodingserine|threoninephosphorylase2CindroughttolerantSporobolusstapfianus.ThefulllengtheDNAsequenceofgenefragmentMD2wascloned、航tllthemethodofinsiliconcloningandreversetranscription
aPCR(RT-PCR).The
aminoacidresidues.resultindicatedthatthefulllengthcDNAsequenceclonedisnewmemberofPP2Cgenefamilyinmaize,anditsopenreadingframeof1164bpencodes388
ApotexperimentWasconductedundersimulateddroughtstressandnormal・wateredconditionswiththreedroughttolerantinbredsline”81565”,’2q87-1”,”R09”andthreedroughtintolerantline”200B”,”ES40”,’’Dan340”to
fluorescencequantitativePCRtechnology
thedifferentmaizeinhredsundertostudy.Adoptingthereal-timedetecttheexpressionofZmPP2Cageneindrought
ofstress,theresultshowedthatdown-regulatedexpressionWasconfirmedinthe3decreasedtothelowestat6hdrought-tolerantlines(81565,N87-1andR09)anddroughttreatment.Ontheotherhand,the3
drought・sensitivelines(200B,ES40andDan340)displayedup—regulatedexpressionunderdroughtstress.Referringtotheimportantroleofproteinphosphokinase,geneZmPP2Ca,
reverseencodingproteinphosphatasecatalyzingthereactionthatphosphokinasecatalyzes,
WasbelievedtoberelatedwiththerespnoseofmaizetOdrought
2stress.Ontheotheractivityside,underthesameconditionaldroughtstress,thedetectresultsofthechangesofserine/threonineproteinphosphataseC(PP2C)inleavesshowedH
thatthePP2Cactivitydecreasedintheleavesofthreedroughttolerantlineswiththedroughttreatmenttime;thePP2Cactivityintheleavesofdroughtintolerantlines“200B”、‘‘ES40’’roseafterthefirstlowertrendwiththedroughttreatmenttime;thePP2Cactivityintheleavesofdroughtintolerantline”Dan340”increasedsli曲tlyoverallunderdroughtstress.
TheseexperimentssuggestthatthedifferentialexpressionofgeneZmPP2CaanddifferenceofPP2Cactivityarespeculatedtobeimplicatedinsignaltransductioninmaizecellsunderdroughtstress.Morndetailresearchesshouldbeconductedontherelationshipsbetweensequenceofthisgeneanditsinfluencetoitsdifferentialexpressionandenzymeactivityunderdroughtstress,toprovideinformationfordevelopmentofintragenicmolecularselectionmarkersrelatedtodroughttolerance.
Keywords:Maize;Serinelthreonineproteinphosphatase;PP2C;Droughttolerance
缩写词及中英文对照
论文独创性声明
本人郑重声明:所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名:钾劾
J勋瞻占月7日
关于论文使用授权的声明
本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定,ep:学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。
研究生签名:/5玎勃
亿国年厶V月z7日导师签名:丽年()月乙7日
一文献综述
在众多的作物种类中,玉米在种植业中占有特殊的地位,它不仅可作为口粮消费,而且是饲料业和畜牧业发展的基础,同时也是食品业、医药业和化学工业的重要原料。当今世界许多学者都把人均占有玉米数量作为衡量一个国家畜牧业发达水平和生活水平高低的重要标志之一。我国玉米的种植面积和总产量居世界第二位,在我国其总产有70%被作为饲料,可见玉米对发展我国经济和提高人民生活水平具有重要的地位和不可替代的作用。玉米(ZeamaysL.)是我国第二大粮食作物,也是“粮—饲一经’’多功能作物,并以其高产、营养丰富,可作为工业、医药原料等而居重要地位。
植物在生长发育过程中经常受到高温、干旱、冷害、盐害、氧胁迫、低光照等各种不良非生物因子的影响。其中干旱造成的农业损失是其他逆境的总和,成为阻碍农业可持续发展的严峻问题【l】。研究表明,玉米是需水较多、对干旱敏感的作物,干旱是影响玉米产量的重要限制因素,我国有60%的玉米面积受到干旱胁迫,每年因早灾而减产15%.20%。在玉米可利用水资源不断匮乏的情况下,克服干旱最经济和有效的方法就是选育耐旱品种,提高玉米自身的耐旱能力。耐旱性的遗传与耐旱品种选育已成为玉米遗传育种研究的重要课题之一。随着人口的持续增长和作物生产可利用水资源的减少,该项研究的重要性显得更为突出。
当植物蒸腾速率超过水分吸收速率,或者土壤缺乏植物可利用的水分时,植物便处于水分胁迫状态。干旱是影响玉米产量的最重要的非生物胁迫郾】。耐早性是众多形态、生理和生化特性协同作用的结果141。近半个世纪来,各国玉米育种家和植物生理学家们为了探索提高玉米抗旱性的途径,从形态、生理生化等方面对玉米抗旱性能做了许多详尽的研究,并取得了较大进展。研究内容涉及水分胁迫对玉米光合作用和呼吸作用的影响;水分胁迫下玉米形态解剖特征及细胞超微结构的变化,还包括干旱胁迫下玉米植株体内水分状况和生长抑制的关系;干旱胁迫对玉米叶片细胞膜透性及膜脂的影响;以及水分胁迫对玉米内源激素代谢的影响。近年来由于分子生物学的广泛应用,这些研究也从个体、器官、组织、深入到细胞及基因水平。人们尝试利用现代分子生物学技术和手段从各种水平上了解作物的抗旱机制,克隆和分离抗旱相关基因,在作物抗旱节水性状的分子标记、基因克隆及转基因等方面开展了全方位的研究,为人们深入认识作物抗旱机理提供了机遇,促进了分子生物学技术与常规育种技术的结合。
1高等植物的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C
1.1蛋白可逆磷酸化在生物信号传递中的作用生命活动的多样性是由基因及其表达蛋白的多样性决定的。无论是单细胞生物,
还是多细胞高等生物,它们在不同的发育时期以及在适应多变的外界环境中,都需要对自身基因的表达方式作出及时而准确的调整。生物在生长发育过程中以及在外界刺激下的信号传导途径是当今生命科学的研究热点之一。
蛋白的可逆磷酸化是生物体内普遍存在的信号转导调节方式,几乎参与所有的生理和病理过程,如糖代谢、细胞生长、细胞周期、基因表达和神经递质的合成与释放,甚至癌变等等【s,6l。作为广泛参与生物细胞内信号传递的一类分子事件,蛋白磷酸化既存在于低等的原核生物中,也存在于高等生物体内。蛋白的可逆磷酸化通过对底物分子的修饰和去修饰,实现信号的级联传递。这种修饰是由蛋白激酶(protein1(inaSe)和蛋白磷酸酶(proteinphosphatase)这一对酶的酶促作用完成的。蛋白激酶接受上游信号分子的指令使底物分子磷酸化,一个蛋白激酶分子可以使许多靶标蛋白磷酸化,因而使微弱的信号得以放大;而磷酸化的底物分子则可以激发下游信号分子,使信号得以传递;蛋白磷酸酶的作用与其相反,它是解除某种受到激发的信号途径使之还原到初始状态,或者是保持某个信号途径的开或关时起调控作用,主要是通过对氨基酸残基脱磷酸化实现对信号的调控的。以往的研究主要侧重于蛋白激酶在信号传递途径中的作用,现在也逐渐认识到蛋白质去磷酸化对生物信号传递得精细调控作用。正如Hunter[rl以中国古代哲学的阴阳平衡来类比一样,蛋白激酶和蛋白磷酸酶彼此互为对立,但又相辅相成。美国科学家Fischer和Krebs因为发现了蛋白磷酸化/脱磷酸化在生物自身调节中的普遍意义而获得1992年诺贝尔医学和生理学奖。Greengard发现蛋白磷酸化在神经细胞传递中的重要作用而获得2000年诺贝尔医学和生理学奖。1.2蛋白磷酸酶的分类.
蛋白磷酸酶和蛋白激酶一样,在低等生物与高等生物中均有分布,且具有明显的进化特征。由于生物的信号网络十分庞大,因而这两类酶为数众多。据统计,人体中仅编码蛋白激酶的基因就有2000多个【.7,8】。高等植物蛋白磷酸酶的基因也很多,但是相对于蛋白激酶数量少一些,拟南芥中的蛋白磷酸酶就有112个例。蛋白激酶催化的磷酸化反应把来自ATP的丫.磷酸基团转移到靶标蛋白的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸侧链,这种磷酸化改变了靶标蛋白的活性。二个蛋白激酶分子可以使许多靶标蛋白磷酸化,因而使得微弱的信号得以放大;而蛋白磷酸酶催化底物蛋白的氨基酸残基脱磷酸化从而实现对信号的调控。
蛋白磷酸酶根据底物蛋白分子上磷酸化残基的种类不同,分为两大类,即蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(protein
酶(proteinSer/Thrphosphatases,PSPs;EC3.1-3.16)矛I蛋白酪氨酸磷酸Tyrphosphatases,PTPs;EC3.1.3.48),PSPs专一去除底物蛋白上丝氨酸或苏氨酸残基的磷酸基团,而PTPs则专一去除底物蛋白上酪氨酸残基的磷酸基团。此外,还有一类对丝氨酸/苏氨酸以及酪氨酸都能起作用的双专化磷酸酶(dual
2specificity
phosphatases,DSPs)。
PSPs又可以根据催化亚基的不同分为PPl、PP2。而PP2根据其对金属离子的不同要求进一步分为PP2A、PP2B、PP2C等亚类。由于PPl、PP2A、PP2B有较高的序列同源性,又可归为蛋白磷酸酶P(proteinphosphatesP,PPP)家族;PP2C则与需要:M92+的丙酮酸脱氢酶磷酸酶和另外一些丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(Ser/Thrphosphatases,STS)归为蛋白磷酸酶M(protein
类见图1。
厂蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)phosphataseM,PPM)Bo]。蛋白磷酸酶分
I双转化磷酸酶(DSPs)
I
蛋白磷酸酶Ir蛋白磷酸酶1(PPl)-1I蛋白磷酸酶2A(PP2A)
气
l
l
I蛋白丝氨酸/苏氨弋蛋白磷酸酶2B倒P2B)酸磷酸酶fPses)}蛋白磷酸酶P(PPP)-J’、Jl蛋白磷酸酶2C(PP20\丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(STs)孓蛋白磷酸酶M(PPIV0丙酮酸脱氢酶磷酸酶
图1蛋白磷酸酶的分类
Fig.1Classificationofproteinphosphata∞
目前在植物中已经发现了PPl、PP2A、PP2B、PP2C类蛋白磷酸酶,其中PPl和PP2A可以被磷酸酶抑制剂冈田酸(Okadaieacid)和环孢菌素A(cyclosporineA)抑制。从各种磷酸酶发挥生物活性对金属离子的依赖性而言,PP2A维持其生物活性时不需要金属离子参与,PP2B需要Ca2+参与,而PP2C则需要M矿参与。以下对本文涉及的PP2C研究进展作一概述。
1.3PP2C的理化性质
PP2C物理化学性质十分特殊。在所有PSPs亚类中,只有PP2C没有调控亚基,是一种单体的蛋白磷酸酶。PP2C酶活性严格依赖M孑+或Mn2+离子。这两种离子对PP2C的激活活性也不同,据报道,激活哺乳动物PP2C相同活性,Mn2+的浓度仅需Mg+的五分之一,而其他金属离子如Ca2+、Zn2+、Ni2+可以通过竞争Mn2十或M92+而使PP2C酶丧失活性【11,12】。一旦加入这两种离子的鳌合剂EDTA后,PP2C也不再具有生物活性【13】。但是它对于天然的抑制子和毒素不敏感,如对PPl和PP2A有显著抑制作用的冈田酸和环孢菌素对PP2C活性没有影响;而且PP2C活性也不受PTPs抑制剂钒酸盐的抑制【7J。
1.4脚扩基因及其蛋白质结构特征自1994年发现两个植物PP2C基因以来,目前已经克隆的植物PP2C基因不下
几十个,如在拟南芥中就鉴定了76个PP2C基因。他们与动物的PP2C基因一样,其蛋白C端有一个催化结构域,这是其核心结构域,催化底物分子的去磷酸化,该催化域具有11个保守亚区。植物PP2C蛋白还有一个特点,其N端还有一个不同长度的延伸区,此区域可能对PP2C的活性有调控作用,能赋予基因不同的功能,人们推测其N端的延伸区可能是特异底物的结合位点或者是为信号复合物提供结合位点。如PP2C成员之一&廿P(kinase.associatedproteinphosphatase,与蛋白激酶关联的蛋白磷酸酶)的N端携有与Ser/Thr蛋白激酶直接相互作用的激酶作用(Ⅺ)结构域【14】。烟草的一个PP2C蛋白DBPl(DNA—bmdmgproteinphosphatase1,DNA结合的蛋白磷酸酶1)的N端具有转录因子的序列特征,能够与防卫相关基因启动子区域结合【15】。拟南芥中参与ABA信号途径的PP2C蛋白ABll的N端还对C端催化结构域所决定的酶活性起一定的调控作用【16】。与PTPs分子的多样性和作用的多样性相比,PP2C缺少调控亚基,其N端结构域的多样性可能在其蛋白活性以及底物专化性识别中起重要作用。
PP2C催化结构域十分独特。Das等【12】首次利用X一晶体衍射观察人PP2Ca的晶体结构(图2)。其催化结构域的主要特征为两反向平行p.折叠当中包含2个金属离子形成的三明治结构。两个p.折叠来两侧各有几个反向平行的a-螺旋。另有4个水分子与2个金属离子结合,调节底物的磷酸基团,为去磷酸化反应提供亲水核。这个三维结构解释了PP2C对Mn2+或M92+的严格依赖性。
PP2C基因的分布十分广泛,除病毒外,几乎所有生物均存在该基因。在高等生物中,同一生物体内PP2C往往有一个小的基因家族。尽管不同生物体内的PP2C种类繁多,功能多样,但是仍然具有一定的保守性。根据人PP2Ca的晶体结构发现,PP2C大多数保守残基都是位于PP2C本身功能的核心区域,如与二价离子结合的序列MED、DGH、DG在几乎所有的PP2C中都是保守的【12】。另外一些保守序列对于PP2C的重要性,在突变体中得到验证,多数ABll、ABl2突变体以及回复突变体都位于保守序列或其附近[16,17】。对保守序列的点突变分析也证明了这些序列对于PP2C活性的重要性。如今保守序列已经成为筛选PP2C候选基因的重要依据,依据对保守催化结构域的分析,在拟南芥中发现了76个PP2C基卧9】。到目前为止,在玉米中克隆到了2个PP2C基因,其中之一就是依据PP2C的保守结构域设计简并引物而获得的全长基因;另外一个PP2C的鉴定也依据其保守结构域【l引。4
ThepictureofhumanPP2C.旺3Dtnueture
(Accession
.ndicatcdnoIA(,QmProteinDataBm'k)拓showedbyCn3Dfflogue,199"0.Beltasheetininyellow,and
greenTwobyln2+ionsarereprintedbyAlphahelixingrey
bells,4hydrogenmdec谢esbyredballs
图2人PP2c吨蛋白三维结构
Fig.23DstructureofhurmmPP2C吨
1.5PP2C在高等植物中的功能与作用
15.1PP2C参与脱落酸(ABA)信号途径
ABA(ab鞯isicacid】是一种重要的植物激素,在植物生长发育诸如气孔关闭、种
子萌发,休眠、叶片水分控制等都有显著的调控作用。同时对干旱、低温、冷害及盐渍等环境胁迫也能有一定的适应调节反应”9.701。随着分子生物学和现代遗传学的飞速发展,人们对ABA的作用机理与信号调节机制有了更深刻的了解。
人们研究发现.PP2C在ABA信号途径中扮演重要角色。以外源ABA处理拟
南芥,从表形筛选ABA缺陷和不敏搏突变/v奉(abacisicacid-insensifive。ABI),结果获得abil-abi5等5个突变体叫-24],并且已经克隆了这些基因。其中,abil和abi2均编码PP2C蛋白瞄到。
1.5.1.1PP20参与ABA调控的种子休艉/荫发信号途径
ABA是许多植物种子萌发的有效抑制剂。除经干燥贮存外,拟南芥新收获的种子不能立即萌发,主要是ABA的作用。Lorcazo等[27,281从山毛榉种子中克隆到两个受ABA诱导的PP2C基因:FsPP2CI、FsPP2C2。这两个基因是ABA信号转导的负调控因子。ABA处理后FsPP2CI在种子中表达量上升,且表达量与种子萌发率成反比。在正常情况下,FsPP2CI仅仅在叶片中少量表达,而受ABA诱导后子叶和胚轴中表达量明显上升鲫。Gonzalez-Garcia等1291将FsPP2CI基因转入拟南芥中,其转基因植株种子萌发不受.ABA抑制,表现出ABA不敏感性.同时种子对盐及渗透压的抗性显著提高,这表明FsPP2C1是ABA信号途径的负调控基因,井在种子休眠,萌发生理活动中起很大作用。FsPP2C2与FsPP2CI不同,外源CaCk对其受ABA的诱导有协同增效效应,c扩如何参与调控FsPP2C2的表达还需进一步研究。同样。拟南芥ABll和ABl2也是ABA信号的负调控因子【11。
1.5.1.2PP2C参与ABA调控的气孑L关闭信号转导途径
ABA参与调节植物气孔关闭已为人熟知。植物气孔的开张主要由保卫细胞的行
为引起,其中最关键的是保卫细胞慢速阴离子通道(即S型阴离子通道)的激活。受到激活的S型阴离子通道使阴离子从保卫细胞持续流,造成保卫细胞长时间的去极化。去极化又激发K+离子流外渗,导致离子从保卫细胞泄漏,膨压下降,体积减少,从而引起气孔关闭。
通过对abil和abi2突变体的研究,人们发现了蛋白质磷酸化过程在上述离子
通道与保卫细胞中起调节作用。Pei等【30】发现保卫细胞ees.型阴离子能被ABA激发,但是在突变体ABll和ABl2中受到强烈抑制。其次,野生型拟南芥在Ser/Thr磷酸酶抑制剂冈田酸处理后,可以抑制ABA作用下S.型阴离子通道调控的气孔关闭,表明磷酸化过程参与调控气孔关闭。AKT2是K+流通道的一个蛋白,其功能主要与木质部K+运输有关。研究发现,AtPP2C与AKT2相互作用,融印朋C基因也在拟南芥保卫细胞中表达,因此AtPP2C参与的通道可能也与气孔关闭有关【3¨。1.5.1.3PP2C参与ABA调控的抗逆信号转导途径
作为ABA信号途径的上游分子,ABll和ABl2与ABA调控的多样性一致,
在逆境适应性中也起作用。ABll和ABl2基因在冷害处理后的早期表达上调,后下降。ABll基因突变体在冷害、脱水及盐处理中均有抑制作用‘25’321。但是对于不同环境胁迫,ABll和ABl2作用既有重叠,也存在分歧。
拟南芥AtPP2CA基因是冷害及ABA诱导的负调控基因【16皿】。AtPP2CA表达
模式与ABI1和ABI2不同,它在正常情况下只有较弱的本底水平,受冷害处理后40sec开始积累,12h达到高峰,并能持续4 ̄5d【32】。反抑抑制AtPP2C基因表达的植株提高了对ABA敏感性,表现得更抗冻害。
ABI2还参与盐逆境信号转导。Zhu等【33】从拟南芥中筛选出一系列盐过度敏感
(saltoverlysensitive,SOS)突变体。其中,SOS2编码蛋白激酶p4】。采用酵母双杂交技术筛选到与SOS2转化作用蛋白为ABl2,同时与SOS2互作的还有还有一个SOS3。这3个蛋白的相互作用依赖于激酶的两个相邻的保守的蛋白激酶互作的花边序列。尽管SOS2与SOS3之间的互作并不直接依靠磷酸化/去磷酸化作用,但其复合体可调节Ca2+信号【351。因此这种作用可能发生在盐逆境信号传递的早期。
1.5.2PP2C参与植物创伤信号途径
生物体往往存在多个MAPK级联系统,当受到外界不同刺激时,启动相应的
MAPK系统,而当逆境信号解除时,则又需要抑制相应的MAPK级联。MAPK的抑制主要通过去磷酸化作用。Meskiene等从苜蓿中筛选到一个抑制MAPK级联系统分支SAMK(stress.activatedMAPK)途径的蛋白磷酸酶2C基因MP2C。受到创伤的苜6
蓿,其SAMK途径瞬时被激发,随后MP2C基因开始表达,抑制SAMK信号传递途径。随后证实MP2C是作为一个负调控因子起作用的【36】。创伤反应中MP2C直接抑制的是SIMK(stress.inducibleMAPK),MAPK级联系统的另一分支。至于MP2C基因如何抑制SAMK途径以及SIMK、SAMK两个途径在创伤反应中信号如何交流目前还不清楚。
1.5.3PP20参与植物的发育
成的蛋白质相互作用。C姗AI(CLVl)是维持拟南芥细胞增值与分化平衡的一个基因,C£刃突变体导致器官在错误部位形成、花与茎秆粗大等畸形【了71。KAPP能与CLVl专一性结合,而且这种结合必须依赖于KAPP的Ⅺ结构域的存在。将KAPP导入突变表型不同的CLVl的株系中强表达,发现KAPP表达量与CLvl的抑制率呈反比,表明KAPP为CLVI的负调控因子【381。拟南芥POLTERGEIST(POL)也是参与调控植物茎分生组织发育的一个PP2C基因。遗传分析表明在调控中柱发育信号中POL位于CLVl下游元件【39】。POL在植物的多个器官表达,并且在相当一些植物中保守,代表一类新的PP2C基因。
1.5.4
1.5.4.1PP2C也参与植物器官的发育。属于PP2C的KAPP直接与多个控制器官形PP2C参与植物的抗病信号途径PP2C作为转录因子作用
最近研究表明,PP2C参与植物的抗病反应。CEVI-1是番茄受柑桔裂皮类病毒(citrusexocortisviroid,CE功侵染诱导表达的一个基因,编码木质素超氧化物酶。CEVI-1与一般防卫相关基因表达模式不同,它不受SA(水杨酸),ET(乙烯)或JA(茉莉酸)的诱导,但是在离体而非创伤条件下诱导表达。CEVI-I的5’上游启动子含两个生长素(L蛆)反应元件,该基因也的确受L认诱导表达【4们。但随后研究表明真正结合CEVI-1启动子区域的是一个DNA结合的蛋白磷酸酶(DNA-binding
phosphataseprotein1,DBPl)051。DBPl含有典型的PP2C的催化结构与和催化活性,在其相对非保守的N端也具有转录因子的序列特征。DBPl是人们首次发现蛋白磷酸酶作为转录因子的列子。
1.5.4.2PP2C在植物细胞壁修饰中的作用
植物抗病机制中涉及一些与细胞壁结构修饰相关的防卫基因表达,增强细胞壁厚度和致密性。拟南芥中KAPP能与两个细胞壁修饰相关基因~细胞壁相关受体激酶1(wall—associated
extracellularreceptorkinase1,W削)和一个富含甘氨酸的胞外蛋(glycine.richprotein)AtGRP.3相结合,形成一个三聚单体14¨。Wakl和AtGRP.3的表达都受SA诱导,并且依赖SA下游的NPRI/NIMI途径【421。在三聚物中,AtGRP.3与Wakl的胞外结构域相结合,而KAPP贝JJ可能在细胞内与Wakl的胞内部分结构域结合【411。7
这种结合使得信号在细胞内外得到传递。
2实时荧光定量PCR
聚合酶链式反应g'cg)是一种体外扩增DNA片段的技术,根据扩增策略和检测手段的不同,可分为定性PCR和定量PCR。实时荧光定量PCR技术(real.timefluorescentquantitativePCRFQ—PCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一项新技术,它是指在PCR反应体系中加入荧光基团,随着PCR反应地进行,PCR反应产物不断积累,荧光信号强度也等LloYd的增加。每经过一个循环,收集一个荧光信号,就这样利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。即在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的量,并据此推断目的基因的初始量。该技术不仅实现了对DNA或者RNA模板的定量,而且具有灵敏度高、特异性强和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具有实时性和准确性等特点,目前已广泛应用于分子生物学和医学研究等领域。
2.1实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR在常规PCR基础上添加了荧光染料或荧光探针。荧光染料能特异性掺入DNA双链,发出荧光信号,而不掺入双链中的荧光染料分子不发出荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。荧光探针是将荧光共振能量传递(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRED技术应用于常规PCR中,在探针的5’端标记一个荧光报告基团(I唧oner,R),3’端标记一个淬灭基N(Quencher,Q),两者可构成能量传递结构,即5’端荧光报告基团所发出的荧光可被3’端的淬灭基团所吸或抑制;当两者距离较远时,抑制作用消失,报告基团荧光信号增强,荧光监测系统可接收到荧光信号。当荧光信号增强到某一阈值(PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本低信号,阈值的缺省设置为3.15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍)时,Ct值被记录下来(C代表cycle,t代表threshold),Ct的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经过的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct越小。利用已知起始拷贝数的标准品可以制作出标准曲线,其中横坐标代表Ct值,纵坐标代表起始拷贝数的对数(如图3所示)。这样,只要获得未知样品的Ct值,即可以从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数(图4)
・l”习--一
博q一
图3Real.timePCR的扩增曲线
Fig.3Amplificationcurveofreal-timePCR
Rn:一个反应管经过n次热循环后,测得的荧光强度。
ml+:反应管含有模板DNA
Rn-:反应管不含有模板DNA
无模板对照:Notemplatecontrol,Rn-,理想情况下,是一条平线,只具有荧光背景数值
Threshold:荧光(Rn)超过本低值一达到可检测水平时的临界数值
Ct-(thresholdcycle),临界循环数,threshold横线与扩增曲线相交,所得到的交点所对应的循环数。基线:baselines。是背景曲线的一段。
图4荧光定量标准曲线
Fig.4StardardCurve
2.2定量理论
2.2.1理论模式
PCR循环在达到Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),
此时微小的误差尚未放大,因此Ct的重现性比较好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。我们如果能建立起Ct值与起始模板数9
量关系的数学模型,就可以利用其来进行定量。
PCR扩增通式:Tn=R(1+E)n[O<E<l】。其中E表示扩增效率,n为循环数,Tn表示在n个循环后PCR产物的数量,To为起始模板数量。设定PCR到达指数扩增时期,产生一定的荧光(荧光依赖于某一循环扩增产物的总量,即特定的拷贝数K为常数,大约在1010左右)高于背景值为仪器所识别,此时的循环数为Ct,也就是K_To(I+E)a,取对数即:lgK=lgTo+Ct×lg(1+E)
lgTo=--lg(1+E)×Ct+lgK
由于对于一特定的PCR而言,E与K均为常数,故上为原始模板拷贝数的对数(19To)对循环数(Ct)的一次方程,其标准形式为),=l。【+b,该直线的斜率为一lg(1+E),在横坐标上的截距为lgKAg(1+E),也是荧光定量PCR所谓的标准曲线。
2.2.2绝对定量和相对定量
绝对定量的目的是测定未知样品中目标基因的拷贝数量,需要标准曲线。标准品可以使用已知拷贝数的质粒DNA模板作梯度稀释来制备。通常需要使用标准品建立标准曲线,建立Ct值与样品起始模板的拷贝数的对数之间的线性关系,从而通过实验后样品的Ct值计算出起始模板量。
相对定量的目的是计算目标基因相对于另外一个基因(内参基因)量的高低,通常是确定经过不同处理的样本目的基因转录本之间的表达差异(不同时相)。将两个基因在同一样本中的含量相比较,一般是求出一种基因相对于另一种基因的百分比。内参基因一般选用在细胞内拷贝数固定、表达恒定的管家基因,如13-actin、GAPDH、tublin、rRNA基因等。方法有2-aaa和双标准曲线法。
双标准曲线法就是采用含目的基因和内参基因质粒DNA分别制作目的基因和内标基因的标准曲线,然后采用每ng总RNA中目标基因的拷贝数比上每ng总RNA中内参基因的拷贝数对每个样品中目的基因的拷贝数进行校正来进行相对定量。2.3实时荧光定量PCR常见方法
2.3.1荧光嵌合法(SYBR
SYBRGreenGreenI法)I是一种扁平状的分子,它处于游离状态时具有很低的荧光本底,当反应体系中存在双链DNA时,它能特异性的结合在双链DNA的小沟部位,与双链DNA结合后,其荧光信号大大增强。在PCR反应体系中,加入过量的SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性的掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR荧光染料分子则不会发射任何荧光,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
SYBRGreenI在核酸的实时检测方面有很多的优点,由于它与所有的双链DNA10
相结合,不必因为模板的不同而特别定制,因此设计的程序通用性好,且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质,通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体,因而可以区分非特异性扩增。此外,由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合,因此,SYBRGreenI的灵敏度很高。但是,由于SYBRGreenI与所有的双链DNA都可以结合,因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的准确性。
2.3.2荧光探针法
①Taqman探针法
Taqman技术是由罗德公司发明并注册专利。该技术的工作原理是:在所设计的寡核苷酸探针的5’端标记一个荧光报告基团(reporter,R),靠近3’端标记一个荧光淬灭基团(quencher,Q)。当探针保持完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收。但在进行延伸反应时,Taq聚合酶的5’ ̄3’外切酶活性将探针水解为单核苷酸,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,淬灭荧光基团的抑制作用消失而产生荧光,从而荧光监测系统可接收到荧光信号。即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号与PCR产物形成完全同步,通过对荧光的实时动态检测可对PCR产物进行定性和定量,荧光信号的强弱与PCR产物的数量呈正比。
Taqman探针因为具有特异性好、设计相对简单(与MolecularBeacons相比而言)等优点在PCR产物的定性鉴定、定量起始模板浓度和单核苷酸多态性(SNP)检测等方面得到广泛的应用,但是该方法也存在一定缺点,主要有价格较高;一个探针只能检测一个特定的目标;背景比分子信标探针高。。
②分子信标技术
分子信标(MolecularBeacons)采用的探针在游离状态下呈茎.环结构(stem.100pstructure)。环部的核苷酸序列与靶基因碱基序列互补,环两侧的茎部核苷酸序列互补而与靶基因序列无同源性。其中环部通常含15.35个碱基,而茎部长度为8个碱基左右。探针的5’端和3’端分别标以荧光报告基团和淬灭基团,当探针游离时由于茎.环结构的形成,两基团非常接近而形成FRET关系,报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收。在PCR变性阶段该探针的茎部打开形成一条单链,当溶液中存在特异性模板时,在复性阶段该探针即可与模板杂交,使得5’端和3’端分离以至淬灭基团对报告基团失去抑制作用,后者的荧光信号得以释放,其荧光强度也与被扩增。
分子信标具有很高的特异性,可以用于SNP检测,但是它的设计困难,它的序列必需保正在复性温度下,模板不存在时形成茎.环结构,模板存在时则与模板配对。它同样也存在价格较贵;一个探针只能检测一个特定的目标等缺点。
③Lightcycler技术.
Lightcycler技术是Roche公司新近开发的一种PCR定量技术。荧光报告基团标于探针的5’端,荧光淬灭基团标于探针的3’端,两探针能分别与模板同一条链中相邻的核苷酸序列进行杂交。当探针游离时能检测到报告基团的荧光信号;如果反应体系中存在特异性模板,PCR复性阶段两探针即会与之杂交,此时两探针上的荧光报告基团和淬灭基团相距很近,形成FRET关系,前者的荧光信号被后者吸收,即发生荧光淬灭。由于荧光淬灭的程度与被扩增的模板量相对应,因此可达到定量的目的。Bennink等【43】和Mishaeli掣删报道Lightcycler技术在对病毒DNA进行定量方面有特殊的优势。2.4实时荧光定量PCR在植物研究中的应用
(1)转基因产品的检测和定量
转基因产品的检测分为3个层次:①检测是否含有转入的外源基因,判断是否为转基因产品,即定性检测;②确定是哪一种转基因产品,是否为已批准的转基因产品,即进行转基因产品品系的检测鉴定;③检测出转基因产品的含量,以明确是否达到需标识的含量(阈值),即定量检测。实时定量PCR较好地解决了转基因产品上述3个层次的检测需要。目前利用实时定量PCR技术检测转基因产品主要运用在转基因玉米【45问、大豆【471。近来也有人利用实时荧光定量PCR方法分析转基因水稻外源基因拷贝数【48J。
(2)与植物有关的病菌或微生物的定量
2000年该方法首次应用于植物病理真菌的检测。程颖慧等【49】报道了小麦印度腥黑穗病菌的实时荧光PCR检测方法。现在,该技术已被广泛应用于田间病害诊断,如马铃薯青枯病【50】。
(3)单核苷酸多态性(SNP)及突变分析
实时定量PCR技术还可用于检测基因突变和基因组的不稳定性。基因突变的检测基于两条探针,一条探针横跨突变位点,另一条探针为锚定探针,与无突变位点的靶序列杂交。两条探针用两种不同的发光基团标记。如靶序列中无突变,探针杂交便完全配对,如有突变,则探针与靶序列不完全配对,会降低杂交体的稳定性,从而降低其熔解温度(Tm),这样便可对突变和多态性进行分析(http://www.apppliedsystems.corn)。(4)基因转录水平定量表达
为了测定拟南芥Aux/IAA基因的转录水平,Liu等【5l】采用了SYBRGreen定量PCR技术对5基因的转录产物进行了定量研究,结果表明,实时定量PCR技术是对mRNA的精确拷贝数进行定量的最好方法,具有快速、准确性高和重复性好等特点。这是实时定量PCR技术用于植物基因定量的首次报道。之后,实时定量PCR技术在基因定量方面得到广泛的应用。Silke等【52】人利用实时定量PCR技术对玉米C3和C4组织中与光合相关基因进行了定量,其结果对于研究玉米中C3和C4碳的固定途径12
的调控有很大指导意义。
3.蛋白磷酸酶活性测定原理
在许多细胞调节活动中,比如分化、细胞分裂、新陈代谢、伸缩性及受精等,蛋白磷酸酶起着十分重要的作用。这些反应都由蛋白激酶和蛋白磷酸酶平衡地在调节着。研究蛋白激酶相对于蛋白磷酸酶相对比较容易,蛋白激酶将放射性磷酸盐与蛋白质或多肽结合后,只需通过测量放射性物质的量就可得知蛋白激酶的活性;但对蛋白磷酸酶性质的测定却困难得多。曾有一种方法用到对蛋白磷酸酶用放射性标记,然而这种方法有几大缺点:一是作预处理时,在蛋白质上用放射性磷酸盐标记很费时费力;二是这种标记的蛋白质只能用一次,必须不断重复地制作,并且最后得到的物质也很难确定最佳检测浓度。
蛋白磷酸酶主要可以分成两大类:第一种是蛋白酪氨酸磷酸酶,它可以将磷酸盐从包含有磷酸酪氨酸的蛋白质上去除掉;第二种是蛋白丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,它可以将磷酸盐从包含有磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸上去除掉。这两种蛋白磷酸酶作用方式上的不同,形成了两种截然不同的测定方法。
目前的磷酸酶检测系统监测分析过程中释放的磷酸盐的有效范围是100—4,000pmol磷酸盐,过低检测将不敏感,而过高也会由于产物的影响使酶不是处在正常况态下的活性,这样也会影响检测的精确性。
蛋白磷酸酶的检测不可能单独将之分离纯化出来进行,因此必须在原细胞组织液中进行检测。由此,细胞组织液中的其它的高浓度的游离磷酸盐必须在进行检测前去除掉。交联葡聚糖G二25可有效快速地去除样品中的游离磷酸盐和其它小分子抑制剂。
合理的反应buffer的制备对检测的效果起着十分重要的作用。由于是检测游离磷酸盐,反应buffer中就不能有大量的磷酸盐的存在,否则将会影响检测,因此一些含磷酸盐的成份,其在酸性环境条件下的稳定性、浓度和纯度,直接影响着检测的精确性。另外,浓度过高的还原剂随着反应时间的延长会一定程度漂白钼酸盐染料的颜色,最终导致检测灵敏度的降低。许多净化剂的浓度应控制在0.1%或以下,浓度过高会产生高的背景值,但如果高浓度的净化剂在反应中是必需的,则背景值可与相应浓度的净化剂在标准磷溶液中的背景值作比对调节。因此实验之前,必须对反应buffer中的各组分的相适宜性作一检测。
在酸性环境条件下,一种溶解在钼酸盐染料溶液中的特别的钼酸盐染料,可与游离磷酸盐结合形成具有一定吸光度的孔雀绿化合物(单独的酸性的钼酸盐染料可能会造成蛋白沉淀),通过分光光度法测定该化合物的生成量,可推知反应体系中游离磷酸盐的生成量,也即是产物的生成量,由此可根据在这单位时间内产物的生成量计算出酶促反应速度,也即是酶活力。酶活的测定就是测定酶促反应开始后一段时间内底
厂组织细胞裂解液
样品制备弋‘
【取上清液过SephadexG-25柱除去酶液中的无机磷,得酶蛋白粗提液。
准备好MolybdateDye/Additive采料馄台掖
土
制备不同无机磷浓度的标准曲线
上
在96一孔盒板中预备反应体系一加入反应buffer和底物
上
加酶样开始反应.
土
加同体积的MolybdateDye/Additive染料混合液终止反应
上
染料与产物结合.约15分钟趋于稳定
上
图5丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶酶活测定步骤
Fig.5Thestepsofmeasuringserine/threoninephosphateaseactivity
4.本研究的目的及意义
本实验室沙莉娜研究生采用改进的DDRT-PCR技术分析了玉米干旱自交系在干旱与正常浇水条件下mRNA的表达差异,得到了3个差异表达的eDNA片段,其中一个是在干旱条件下减量表达的cDNA片段,BLASTN同源性分析表明该片段与Sporobolusstapfianus促一种比较耐寒的复苏草)丝氨酸/苏氨酸2C型蛋白磷酸酶基因伴纪的同源性达88%【53】,因此推断片段MD2可能是编码玉米蛋白磷酸酶2C的基因。李富华【54】采用电子克隆和RT-PCR技术相结合的方法克隆MD2基因片段的eDNA全序列,克隆的全长cDNA序列ZmPP2Ca为玉米PP2C基因家族的新成员,开放阅读框14
长1164bp,编码388个氨基酸残基。本研究的目的就是分析干旱胁迫下,它在不同耐旱玉米自交系中的表达特性及其酶活性的变化。通过本研究,使我们认识到蛋白磷酸酶同样也参与玉米对干旱胁迫的响应。
本论文拟研究的主要内容如下:
①干旱胁迫下,该基因在不同耐旱玉米自交系中的表达特性
(SYBRGreen用实时荧光定量PCRI嵌合荧光法)技术,检测该基因在3个耐旱玉米自交系“81565"、“N87.1’’、“R09’’和3个不耐旱自交系“ES40"、“200B"、“丹340’’中的表达差异,分析该基因对玉米水分胁迫的响应。
②干旱胁迫下,该基因表达的酶在不同耐旱玉米自交系中的活性变化用分光光度法对不同胁迫和诱导条件下ZmPP2CQ酶活性的差异,以及随时间的变化,做精确的分析。
二材料与方法1历觥口基因mRNA表达量测定
1.1材料
1.1.1植物材料
付风玲,周树峰等【55,56j结合干旱地区品种推广实践,在严格控制土壤水分的干旱条件下,从57个常用玉米自交系中筛选出3个耐旱自交系“81565”、“N87.1”、“R09”和3个不耐旱自交系“200B”、“ES40”、“丹340”。本研究以这六个玉米自交系为试验材料。
1.1.2载体与菌株
(1)受体菌E.coliDH5a由四川农业大学小麦研究所惠赠:
(2)克隆载体pMD.18TVector购于大连宝生物公司;
1.1.3主要试剂和试剂盒
iQlMSYBRGreenSupermix试剂盒购自Bio.Rad公司。引物由上海Invitrogen公司合成。质粒DNA提取试剂盒E.Z.N.APlasmidMiniprepKit(OmegaBio—Tek),100bpmaker,TaqDNAPolymerase,PrimeSTAR刑HSDNAPolymerase,连接试剂盒,Trypton,YeastExtract,X-gal,IPTG,DL2000marker,RTreagent试剂盒,DNAA-TailingKit,pMDl8.T载体均购自大连宝生物公司(Takara);Trizol购于Invitrogen公司,DEPC和DEPC处理水购于上海生物工程公司,琼脂糖凝胶回收试剂盒,购于北京天根生化科技有限公司。PEG6000、氯仿、异丙醇、无水乙醇和无水氯化钙均购自雅安试剂公司。
1.1.4主要仪器与耗材
定量PCR微孔加样板(MJResearch,HSP・9601)、透光光盖(MJResearch,TCS.0803)、DNAEngineOpticon2荧光定量PCR仪和8连管离心机均购自东胜创新公司,5804R高速冷冻离心机(德国Eppendorf),5415R高速冷冻离心机(德国Eppendorf),MiniSpin离心机(德国Eppendor0,DK・8A型电热恒温水水槽(上海精宏实验设备有限公司),调速多用振荡器(美国生产),凝胶成像系统(Bio—Rad),Form.86CULT超低温冰箱(美国ThermoElectionCorporation),MilliporeMilli—Q⑧超纯水(法国Milli-Q公司),EPC3000三恒电泳仪(北京六一仪器厂),DHP.9052型电热恒温培养箱(20.60。C,上海一恒科技有限公司),电热谷风干燥箱(成都天宇试验设备有限责任公司),实验室专用超纯水(艾柯),DU800紫外分光光度计(BECKMANCOULTER),PCR仪(德国Eppendorf),电子天平(瑞士普列塞斯XS系列),Eppendorf移液枪(德国16
Eppendorf),微波炉(Galanz),HIRAYAMAHVE一50高压湿热灭菌锅(日本生产),QL.901旋涡混合器(江苏),F100Icematic制冰机(意大利)。
1.1.5所用溶液及其配制
1.1.5.1RNA提取试剂的配制
0.I%DEPC处理水:DEPC与去离子水按0.1%(V/V)的比例混合,37℃放置2h或常温下过夜,轻摇后,121℃高温湿热灭菌3075%7,醇m:取75mL无水乙醇加O.I%DEPC处理水定容至100mL,4"C贮
lmin。存备用。1.1.5.2基因组DNA提取试剂的配制M"Iris-Hcl0H8.0):称取121.1g"Iris置于lL烧杯中,加入约800mL的去离子水,充分搅拌溶解,加入约42mL的HCI调节pH到8.0,将溶液定容至1L,高温高压灭菌后室温保存。
0.5MEDTAQH8.0):称取186.1gNa2EDTA・2H20,置于lL烧杯中,加入约
gNaOH调节pH到8.0,将溶液定容至1L,800mL的去离子水,充分搅拌,加入约20
高温高压灭菌后室温保存。
TE(Tfis/EDTA缓冲液):1mol/L"Iris.HCl(pH8.0)1mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)200皿,加水至100mL。
10xTBEBuffer(pH8.O):称取108gTris、7.44gNa2EDTA・2H20和硼酸55g置于lL烧杯中,加入约800mL的去离子水,充分搅拌溶解,再加入去离子水将溶液定容至1L,室温保存。工作液的浓度为0.5xTBEBuffer。
CTAB提取缓冲液(100Ⅱ曲:称取2.0
浴下搅拌溶解,加入7.5
NaCI6.2mLlMgCTAB,置于100mL烧杯中,在65。C水mL0.5Tds-Hcl(pH8.0),3.0MEDTA(pH8.0),g,充分搅拌溶解,最后将溶液定容至100mL。在提取基因组DNA前再加入O.2mL的B.巯基乙醇。
氯仿/异戊醇(24:1,V/V):将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀,置棕色瓶中,40C保存。
75%乙醇:75mL无水乙醇加入25mL去离子水。
1.1.5.3克隆试剂的配制
LB液体培养基:先将所用三角瓶、玻棒、烧杯等用具洗净并用去离子水冲洗几次、烘干后备用。10
900gNaCI,10g蛋白胨(Trptone),5g酵母提取物(YeastExtrac0用mol/LmL的去离子水溶解,充分溶解后,用5
L,NaOH调节pH到7.0,之后再将其定容到1分装后高压湿热灭菌20min。
LB固体培养基:在配置好的大约每100mLLB液体培养基中加入1.5g琼脂粉,
高压湿热灭菌20min。
氨苄青霉素贮存液(Amp):将1g氨苄青霉素溶于10mL去离子水中,终浓度100mg/mL,用O.22岫已灭菌滤膜过滤灭菌,分装成lmL小份贮存于.20"C。
IPTG(24mg/mL):在8mL蒸馏水中溶解O.24gIPTG后,用蒸馏水定容至10mL,用0.22lxm已灭菌滤膜过滤灭菌,分装成1mL小份贮存于.20。C。
X.gal:用二甲基甲酰胺(DMF)溶解X-gal配置成20mg/n9.,的贮存液。装有X—gal溶液的试管须用铝箔封裹以防止因受光照而被破坏,并应贮存于.20。C,X—gal溶液无须过虑除菌。
LB/Amp/X.gal/IPTG平板培养基:首先配制好1L的LB固体培养基,高温高压灭菌后,冷却至60"(2左右,加入1mLAmpicillin(100mg/mL)、1mLIPTG(24mg/mL)、2mLX—gal(20mg/mL)后均云混合,之后以30-35mL培养基/88111111培养皿的量铺制平板,4℃避光保存。
0.05%mol/LCaCl2溶液:称取0.56gCaCl2(无水,分析纯),溶于50mL重蒸水中,定容至100mL,高压湿热灭菌20mill。
含15%甘油的0.05%mol/LCaCl2溶液:称取O.56gCaCl2(无水,分析纯),溶于50mL重蒸水中,加入15mL甘油,定容至100mL,高压湿热灭菌20min。
1.2实验方法
1.2.1ZmPP20a基因在干旱胁迫下的表达特性
1.2.1.1材料培养与干旱处理
各材料选大小均匀的种子,将种子分别装进三角瓶中,先用70%的乙醇漂洗(约1min):再用5%的次氯酸钠溶液浸泡20min;倒掉次氯酸钠溶液,用无菌水淋洗种子以除去次氯酸钠;最后在三角瓶中加入无菌水(水量以没过种子为宜);浸泡12h,在25。C催芽,待刚刚露白时进行播种。每个品种播种6盆,(容积为O.1n13),3叶期时每盆定苗5株,常规管理,在正常条件下生长至9叶期开始干旱处理。在3个花盆中各缓慢加入16%聚Z,--.-醇(polyethyleneglycol6000,PEG)溶液1L,模拟强度一0.5MPa的干旱胁迫。另外3盆加等体积清水作为对照。分别于处理后0、3、6、12、24、48h取第9片叶,用去离子水冲洗干净,滤纸吸干,剪成1-5cm左右的小段,立即用液氮速冻,保存在-70。C冰箱中备用。
1.2.1.2玉米叶片总RNA的提取
RNA操作中的器皿用O.1%DEPC溶液浸泡过夜,高温高压灭菌后烘干使用。所有溶液均采用0.1%DEPC处理水配制。玉米叶片总RNA提取参照Trizol试剂盒(Invitrogen公司)说明书进行(见附录1)。用紫外分光光度计测定RNA样品的纯度和浓度。用1%t乍-变性琼脂糖凝胶电泳,120V,快速检测RNA的完整性。最后将RNA18
用于cDNA第一链合成或者置于.70"(2冰箱中保存备用。
1.2.1.3引物设计
本实验选择玉米的看家基因GAPDH为内参照基因。看家基因GAPDH用作内参基因来调整不同样品最初的模板量以及RIgA反转录的不同效率。依据实时定量PCR引物设计原则,根据ZmPP2Ca基因的eDNA序列和玉米GAPDH基因的rnRNA序列(GENEBANKACCESSIONX07156),用PrimerPremier5.0设计目标基因和内参基因的特异性引物,用Oligo6.0检验其特异性。引物由上海Invitrogen公司合成,序列见表1。
表lZmPP2Ca和GAPDH基因实时荧光定量PCR引物
TablelSpecificpfimemtoamplifyZmPP2CaandGAPDHgenesforFQ・PCR
1.2.1.4cDNA第一链合成
(1)按照Takara公司的RTreagent试剂盒说明书进行eDNA第一链合成,反应体系总体积为10此。为了保证eDNA产物不是由于污染或由RNA自身降解引导所致,在逆转录反应过程中,设置了3个阴性对照管。
(2)PCR反应条件为:
42℃反应12rain:
95℃2min灭活反转录酶。
1.2.1.5实时荧光定量PCR引物的特异性检测
在进行实时荧光定量PCR之前,先用【表l】中的引物进行常规PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳和序列测定来检测引物的特异性。19
将【1.2.1.41中的逆转录反应产物用TEBuffer稀释5倍后用作常规PCR扩增的模板,反应体系(25pL)为:
5×PCRbuffer2.0此
dNllPMixture(各2.5mmol/L)1.8IlL
M92+(25mmol/L)1.5止
上游引物(5p.moFL)2.0IlL
下游引物(5lmlol/L)2.0“L
稀释后的eDNA1.0p.L
TaqDNAPolymerase(513/此)0.3灿
ddH20upto25。0此
PCR的反应条件:
94℃预变性2min;
94℃变性1min、
56℃退火45s}-35循环
72℃延伸48sJ
72℃再延伸5111iIl;
4℃llold
将ZmPP2Ca和GAPDH基因的PCR扩增产物经过1%非变性琼脂糖凝胶电泳分离,在紫外光下回收目的条带、并与载体连接,通过克隆测序检验引物的特异性。1.2.1.6定量标准品的制备
分别吸取2止含目的基因和看家基因的重组克隆的菌落悬浮液于10mL含有Amp的LB液体培养基中,37。C振荡培养过夜,采用E.Z.N.APlasmidMiniprepKit(OmegaBio.Tek)试剂盒提取重组质粒DNA(见附录1)。用分光光度计检测质粒DNA的浓度和纯度。根据插入片段与载体大小分别计算出重组质粒的分子量,将其浓度单位换算成copies/IxL,即每l此重组质粒溶液所含的拷贝数的多少(换算公式见下面)。然后用TEBuffer对重组质粒的原液做梯度稀释,依次稀释成以下7个浓度梯度(copieS/止):lxlOs、lxl07、lxl06’、lxl05、’lxl04、’lxl03、’lxl02,制备成定量标准品。用已知拷贝数的标准品来制作目的基因和内参基因的标准曲线。
1014
重组质粒的浓度(copies/此)=重组质粒的原浓度(ng/肛)×6.02X
重组质粒的分子量
1.2.1.7FQ-PCR反应及分析
实时荧光定量PCR在DNAEngineOpticon2荧光定量PCR仪(MJRsearch)I-进行,用Bio.rad公司的i∥SYBRGreenSupermix试剂盒进行分析。iQTMSYBRGreenSupermix试剂盒含有Buffer,dNTPs,iTaqTMDNAPolymerase,M92+和SYBRGreenI20
染料)。SYBRGreenI(SGI)是一种与双链DNA特异结合的荧光染料,能显示PCR反应中扩增的DNA。
将【1.2.1.41中的逆转录反应产物用TEBuffer稀释15倍后用作FQ-PCR扩增的模板,反应组分加在白色定量PCR8连管中,用透光光盖封口。各组分的体积和浓度如下(25uL):
实验组
SYBRGreenSupermix12.5pL阴性对照12.5pL
上游引物(2.5I.tmol/L)
下游引物(2.5I-tmol/L)
稀释的cDNA
ddH203.0此3.0lxL3.0laL3.0)xL3.0laL….6.59L3.5pL
PCR反应程序为95*(2预变性3min;然后按94"(2变性40s,56℃退火40
延伸40S,80℃1s,72"(2s收集荧光,读板(Plateread)的程序进行40个循环,之后72℃延伸5rain。最后从49。C开始,以每步0.2。C的速度升高至95℃,每个温度保持1s,来绘制熔点曲线。
由于SY'BRGreenI染料可以与所有的双链DNA特异性结合,所以目的基因和内参基因的FQ.PCR反应是在不同的PCR管中进行,每个样品均重复3管。FQ.PCR反应结束后,与定量PCR仪相连的计算机会自动收集每个样品孔的荧光信号,并根据我们人为设定荧光域值计算出的每个样品孔的G值。然后根据目的基因和内参基因标准品的拷贝数与其相对应的cT值来分别绘制目的基因ZmPP2Ca和内参基因GAPDH的标准曲线,并考察标准曲线的线性关系和斜率。对于每一个待测样品,根据其CT值我们可以分别从目的基因或内参基因的标准曲线上确定每个反应管中mRNA的拷贝数。本实验采用双标准曲线法对ZmPP2Ca基因的表达水平进行相对定量,计算公式如下:
目的基因表达量(copies仙)×内参基因正常浇水’
目的基因的相对表达量(copies/阻沪对照的表达量(0la)(copies/此)
内参基因表达量(copies/0L)
1.2.1.8统计分析
正常浇水对照与干旱处理之间的表达差异以及不同耐旱自交系之间的表达差异用SPSS(version
著。10.0Inc.Chicago,IL)统计分析软件进行分析,P<0.05时,被认为差异显
2l
2.ZmPP2CQ酶活性测定
2.1材料
同【1.2.1.1】
2.1.2主要试剂,试剂盒及仪器
Serine/ThreoninePhosphataseAssaySystem购自Promega公司;其他化学药品均为国产分析纯试剂。ELx800UV型酶标仪;5804R高速冷冻离心机(德国Eppendorf)。2.1.3所用溶液及其配制
2.1.3.1PP2C酶抽提buffer的配制
20mmol/LTris-HCI(pH7.5)
20rnmol/LKCl
1mmol/LEDTA
1mmol/LEGTA
10mmol/LDTT
O.5%TritonX.100
50%Glycero
1Opgm/L
1mmol/Lleupeptin和pepsmtmPMSF
2.1.3.2反应buffer的配制
250mmol/Limidiazole
1mmol/LEGTA
25mmol/LMgCh
0.1%13-mercaptoethanol
O.5g/LBSA
2.2实验方法
2.2.1反应缓冲液各组分兼容性测定
将各组分浓度混溶:10肛L反应buffer,5此无磷水,35pL抽提buffer,总体积为50此,再加入钼酸盐染料混合溶液50皿,在室温下静置15min。另准备一对照,50“L无磷水中加入50此钼酸盐染料混合溶液。如果溶液仍为黄色,且无沉淀产生,说明各反应成份之间相容性好。
2.2.2酶液提取
(1)每处理取上述处理叶片样品0.5g,在研钵中加液氮快速研磨成粉,然后加抽提buffer3mL,再次快速研磨后装入10mL离心管中。
(2)于4"C,70,000xg冷冻离心3h,去除微粒杂质。
(3)把10mLSephadexG.25加入柱中,让其液体自由排尽。然后加入去离子水25mL过SephadexG.25柱,自由排尽。
(4)加入10mL冷的抽提Buffer10mL过SephadexG.25柱,任其液体自由排尽。(5)于4"C,600xg冷冻离心5min,去尽SephadexG-25念珠上的多余Buffer溶液。(6)吸取离心后的样品的上清液250此过SephadexG.25柱,以去除酶样中的自由,
磷。
(7)于4"C,600xg冷冻离心5
的酶液。rain,50mL管收集;离心后过滤出来的液体即为所需
2.2.3酶活标准曲线制作
将标准磷稀释成50pmol/L,每uL含50pmol磷酸盐,在六个酶标孔中依次加入该稀释液0、2、4、10、20和40止,即六个酶标孔中依次含有0、100、200、500、1000、2000pmol游离磷酸盐。每孔再加入反应buffer牢b足至总量50此。在ELx800UV型酶标仪上630nln读板,得到各自相应吸光值。根据每孔磷量和吸光值绘制标准曲线。
2.2.4酶活测定
(1)配制钼酸盐染料溶液:10此钼酸盐染料添加剂对1mL钼酸盐染料溶液。因其相对不稳定,故只可在当天按使用量的多少,适量配制,不能保留至下次使用。
(2)在96孔酶标板中加入5皿底物磷肽Ser/ThrPhosphopeptide和10皿反应buffer,混匀,不能产生气泡,有气泡需去除掉。
(3)将96孔酶标板在室温下(25—30℃)静置3rain。
min。(4)加酶样35此开始反应,将盒板置于25"C水浴中15
(6)在酶标仪上以630IIITI读板,得到吸光值。(5)加染料钼酸盐溶液50此终止反应,室温下放置20rain。
(7)每样品重复3次。根据标准曲线和吸光值,采用国际单位形为酶活性单位(1内能转化llxrnol底物的酶量),计算得到酶活性值。min
三结果与分析
1ZmPP2Ca基因在干旱胁迫条件下的差异表达
1%非变性琼脂糖凝胶电泳分离普通PCR扩增产物,分别得到一条长366和358bp的特异带,克隆测序结果分别与目的基因ZmPP2Ca和内参基因GAPD/t序列相同,证明为所设计的两对引物特异性高,可用于FQ_PcR检测(图6)。
图6ZmPP2Ca和GAPDH的扩增产物的琼脂糖凝腔电泳图
ZraPP2Cat1泳道为]00bpMsrker:2泳道l3泳道lGAPDH
Fig6AmplifiedproductsbyspecificprimersfromgenesZmPPgCaandGAPDH
Lanel:100bpmaker,lane2:ZmPP2Ca]ane3:GAPDH
在模板浓度较高的情况下,ZmPP2Ca和甜删基因的熔点曲线都只有一个峰,也表明阶PCR过程无非特异性扩增(图7)。
re)GAPDH
图7
Fig7TheZmPP2Ca和GAPDH基因荧光定量分析的熔点曲线cgrvcsMeltingofFQ—PCRforgenesPP2CandGAPDH
(a)ZmPP2Ca(b)GAPDH
elcyc袖
对标准曲线的相关回归分析表明,相关系数r>O.99(R2>0.99),斜率在一O.28至一O.33之间,说明对ZM:'P2Ca和GAPDH基因所作的标准曲线可信度高,可满足基因表达定量检测的要求(图8)。
I
蚤7
专
一‘吾警蚤堇∞一
加255●I2如n
”C一20T15一cWrCYCle23l25
(a)ZmPP2CaCo)GAPDH
图8ZmPP2Ca和GAPDH基因荧光定量分析的标准曲线
Fig.8StandardcurvesofgenesZmPP2CaandGAPDHforFQ・PCR
干旱胁迫条件下ZnzPP2Ca基因在不同自交系中的相对表达量见表2。方差分析表明,Znzt:'P2Ca基因在不同自交系之间的表达量存在极显著差异(F=142.8”)。多重比较结果,强耐旱自交系“81565’’在干旱处理所有时间段,PP2C的相对表达量均显著低于正常浇水对照(P<0.05)。耐旱自交系“R09”和“N87—1刀在干旱处理3、6、24和48h中,PP2C的表达量显著低于对照(P<O.05),尽管在干旱处理12h的表达量略高,但是与对照的差异不显著。不耐旱自交系“200B"在干旱处理所有时间段中,PP2C表达量均高于对照,除6h以外,其他各时间段与对照的差异均达显著(P<0.05)。不耐旱自交系“ES40",除干旱处理12h外,其他时间段的表达量均高于对照,在3、6和24h达到显著差异(P<0.05)。不耐旱自交系“Dan340”.,除3h以外其他时间段的表达量均高于对照,在6、24和48h达到显著差异(P<O.05)。再从PP2C基因相对表达量在干旱胁迫条件下的变异极差看,3个耐旱自交系的变异幅度不大,极差小于l,其中强耐旱自交系“81565"只有0.35,而3个不耐旱自交系变异幅度较大,极差超过1,其中“200B”达到6.13。
上述分析表明,在干旱胁迫条件下,ZmPP2Ca基因在“81565”、“R09"和“N87—1”三个耐旱自交系中呈下调表达,且变异幅度较小;而在“200B"、“ES40”和“丹340”三个不耐旱自交系中呈上调表达,且变异幅度较大。再从不同胁迫时间段来看,仔笏基因在耐旱自交系中的表达6h时降到最低水平,12h时后恢复,在
25
不耐旱自交系表达持续较高。由此说明,PP2C基因的差异表达处于玉米干旱胁迫应答的上游,是一个较为关键的基因。
表2干旱胁下ZmPP2Ca基因在不同白交系中的相对表达量(copies/皿)
Table2ComparativeexpressionamountofgeneZmPP2Caamong
stress(copies/皿)differentinbredlinesunderdrought
Inbredli幡
81565
R09
N87.1
200B自交系!呈竺里堕塑里竺!竺!!竺!塑!竺竺竺竺!(对煮n删1士0.243h6h12h0.51士0.111.1舶=o.021.24士-0.157.26.4-0.05
0.88-士0.18
1.05m0.0324h48h0.50士0.270.67士0.060.36i-0.102.58._4-0.361.25士o.481.64士o.5I蕊0・35u・O,0.41士0.150.68士0.14O.71:1:0.132.22士0.142.06士0.500.61士0.110.16士0.360.45m0.030.32-40.261.13士0.211.59:1:0.381.77士0.350.33士0.120.76士0.120.50-士0.243.06士O.221.64士O.15I士0.171士0.04l士O.19l士1.231士0.180.92O・12;ES401.18I・Ib丹3401.2710.24
2酶活测定结果
干旱胁迫条件下PP2C酶在不同自交系中的活性例于表3。方差分析表明,PP2C酶活性在不同自交系间的差异达极显著水平(F=209.1”)。多重比较结果,强耐旱自交系“81565”的PP2C酶活性,在干旱处理6h时略高但与对照无显著差异外,其余各时间段均显著低于对照(P<O.05)。耐旱自交系“R09"的PP2C酶活性,在干旱处理6h时显著高于对照,其余各时间段均显著低于对照(P<0.05)。耐旱自交系“N87-1”的PP2C酶活性变化较复杂,随干旱处理时间呈“高一低一高一低”的波动,差异均达显著水平(P<0.05),但总体呈下降趋势。不耐旱自交系“200B”和“ES40”的PP2C酶活性,在干旱处理初期显著低于对照,先后于24和48h显著升高(P<O.05)。不耐旱自交系“丹340”的PP2C酶活性,在干旱处理的所有时间段均显著高于对照(P<O.05)。
在干旱胁迫条件下,不同自交系PP2C酶活性与PP2C基因的相对表达量呈大致相同的变化趋势,只是酶活性的变化时间段较晚,与基因转录和翻译的先后顺序是一致的。酶活性变化的波动较大,不如基因相对表达量的变化趋势规律,可能是PP2C家族其他同源基因的表达产物对活性检测有干扰。
表3干旱胁迫下不同自交系PP2C酶活性(10巧u)
Table3PP2Cactivityamongdifferentinbredlinesunderdroughtstress(1o‘5忉
自交系
Inbredlin懿(对照Och。ntr0I)
R097.58士O.15王呈竺里堕塑!!里!!!璺竺竖坠皇望塑竺L———一一一一一6h12h24h48h8.90士O.18
9.22士O.24
5.29士O.37
4.66士0.07
8.78士0.076.46士0.284.50士0.195.694-0.256.364-0.076.79-1-0.304.50士O.359.8li-O.3l10.50士0.3l2.27士0.194.00士o.08N87.1200B7.384-0.066.86士O.206.764-0.106.244-0.207.91士O.2l8.78士0.447.92--+0.30E¥40Dan3405.784-0.156.82士O.26
27
四讨论
1材料的干旱处理
本实验研究干旱胁迫下玉米特定基因的表达特性,那么在对玉米幼苗进行干旱处理时必须考虑两个因素:①干旱处理时土壤含水量(水I%)。在四川雅安的土壤条件下,12%的土壤含水量是影响玉米水分生理和生长量的临界点,因此本研究用酒精燃烧法测量土壤的含水量,当达到12%左右时进行干旱处理;②材料生育期的选择。玉米不同生育期对水分的要求不同。从玉米拔节到抽雄,抽雄到至籽粒形成期,也就是抽雄前后对水分反应敏感,这个时期如果缺水,幼穗发育不好,果穗小,严重的,穗抽不出来,称为“卡脖旱",所以抽雄前后是玉米的“水分临界期"。因此,本研究选择玉米生长至9叶期进行干旱处理。
2RNA的制备与检测
RNA的质量是实时定量PCR分析的关键,高质量RNA必须满足完整性好和纯度高这两个条件。RNA酶几乎无处不在,而且特别稳定,耐酸碱、高温加热也不能使其失活,所以,提取RNA时,最关键的因素是最大程度地避免外源RNA酶的污染和抑制内源RNA酶的活力。本实验采用以下方法保证总RNA质量以满足FQ.PCR的需要:①整个操作最好在无菌工作台中进行,以减少外源RNA酶的污染。②实验中所用的玻璃和金属器皿能用0.1%DEPC溶液处理的尽量处理,不能的可180℃烘烤至少5h;对于塑料器皿须用0.1%DEPC溶液浸泡过夜,121℃高温高压灭菌30mill后烘干备用。③试验中所用溶液均用0.I%DEPC处理水配制。④用于总RNA提取的材料不能反复冻融,可以在.70℃冰箱中短期保存。在液氮中研磨叶片时,勿使材料呈湿润状。而且加入样品量不能太多,一般每lmL的Trizol可以充分裂解100mg材料。⑤可以从两个方面来减少总RNA中基因组DNA和蛋白质的污染。一是必须选取质量好的Trizol试剂(如Sigma和Invitrogen公司);二是在吸取上清液时,切勿吸到中间层,以免RNA被DNA和蛋白质污染。⑥为了减少总RNA中混杂的基因组DNA对RNA定量和逆转录反应的影响,对最后提取的RNA最好用无RNase的DNase处理。
RNA的定量对于FQ.PCR来说是很重要的,因为基因表达量的差异是一个相对值,是以每单位总RNA中目的基因mRNA的拷贝数来比较的,如果总RNA定量都不准确,那么经FQ.PCR定量的基因的表达水平也就不真实。在多数情况下可采用分光光度法对鼢执进行精确定量。但是紫外定量同时也存在一些局限性,本实验通过以下措施进行弥补:①用无RNase的DNase处理样品中混杂的DNA。②酚和蛋白质会干扰吸收峰,需去除干净,本实验均对样品进行了2次氯仿抽提,另外,比色杯28
应在1:l盐酸:甲醇(VⅣ)溶液中浸泡至少30min,并用去离子水洗净。③A260/A280值与pH和离子强度有关,当pH升高时,A280降低,但是对A260无影响,从而使得A260/A280升高。水是弱酸性,能降低A260/A280的比值,如我们从上海生工购买的DEPC处理水,其pH在5.0.6.0之间,用其对质量较好的RNA进行紫外分光光度计检测时A260/A280的比值为1.60左右,但这并不表示RNA不纯。在本研究中,我们采用弱碱性的缓冲液(如pH8.0的TE,A260/A280=2.14)作空白对照和稀释溶液,以确保浓度的准确性和重复性。④样品的稀释倍数应该在分光光度计的线性范围之内,A260值最好在0.1.1.0之间,在此范围之外就不能准确定量。RNA的完整性可用非变性琼脂糖凝胶电泳来检测。本研究发现玉米叶片总RNA经1%非变性琼脂糖凝胶电泳分离后,除了28SrRNA,18SrRNA,5SrRNA这3条带外,还有2条带(见图2.1,图2.2),这是由于植物叶片中含有大量的叶绿体,可见4条或更多条rRNA。所以,植物叶片的RNA经电泳短时间分离后,次大的rRNA亮度为最大rRNA亮度的1.5.2.0倍。
3内参基因的选择
FQ.PCR主要存在3个变量:①样品处理时不同的纯化得率;②RT-PCR过程中不同的逆转录效率;③FQ.PCR反应体系中不同的eDNA加入量。由于上述3个变量在样品间都很难控制在相同的水平上,因此需要引入内参基因来校正上述变量进行归一化处理,使得所有样品目的基因表达水平的比较是在相同水平上进行的,这样得出的结果才具有可信性和良好的重复性。内参基因的选择必须满足以下3个条件:①在不同的细胞、组织中具有恒定的表达;②在不同的细胞周期和发育周期中具有恒定的表达;⑨在不同的实验状态下具有恒定的表达。一般采用的内参基因都是一些看家基因,使用最多的是:GAPDH,actin、18SrRNA等中。本实验采用玉米GAPDH基因为内参基因,在同一个材料的不同处理样本之间,该基因表达量的最大差异为2.5倍左右。因此,认为在干旱胁迫下,玉米GAPDH基因表达相对稳定,可以作为内参基因。
4定量PCR实验中应该注意的几个问题
在定量PCR实验中,首先要最大程度的减小实验误差对结果的影响。本实验主要从以下几个方面进行:①在正式进行实时定量PCR之前,要先练习移液枪的使用。②最好用好质量的枪头,以保证加样的一致性。③在配制反应体系时,最好先配成母液,再分装。④无论是梯度稀释、配制反应体系还是加样采用的最小体积量最好大于3uL,并使用定期进行校正的移液枪。荧光域值是定量PCR中一个很重要的参数。荧光域值的缺省设置是3~15个循
环的荧光信号的标准偏差的10倍。也可以进行手动设置。本实验采用手动设置,其原则是:荧光域值要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值,同时要尽量选择进入指数期的最初阶段,并且保证标准曲线回归系数大于0.99。
有时候PCR的扩增效率不理想不是由于方法(如引物的设计、体系的优化等)的问题,而是由于在进行梯度稀释时操作上的误差引起的。因为PCR的扩增效率是根据标准曲线的斜率计算而来的,如果梯度稀释不准确,那么相应的标准曲线的斜率和扩增效率均不符合要求。所以,对标准曲线的考察除了要求相关系数大于O.99外,还要求标准曲线的斜率在.O.25~O.33,这表明标准品是按照10倍梯度进行稀释的。5而烨珊口基因在干旱胁迫下的表达模式
蛋白质的可逆磷酸化是生物体内普遍存在的信号转导调节方式,几乎参与所有的生理和病理过程,如糖代谢、细胞生长、细胞周期、基因表达和神经递质的合成与释放等【5,6】。蛋白磷酸酶和蛋白激酶是蛋白质可逆磷酸化的两类关键酶。有关蛋白激酶在植物逆境胁迫信号传导中的作用,已有较多的研究,而蛋白磷酸酶的研究却刚刚起步[32,57,58,59,60]。PP2C作为一种调控蛋白,己被证明直接或者间接参与逆境胁迫的信号转导等调控过程。ShengLt61】报道PP2C可以与跨膜蛋白激酶RLK5相互作用,而RLK5是植物受体类激酶(receptor-likekinase,RLKs)家族成员之一,被认为参与转导胞外信号至胞内。研究表明PP2C基因在转录水平上受ABA诱导,它通过逆转蛋白的磷酸化作用在ABA和MaVK(mitrogen.activatedproteinkinase)等信号转导途径中充当负调控因子【26,62】。Yupsanis等【631发现盐胁迫对苜蓿幼苗的蛋白激酶和蛋白磷酸酶活性有很大影响,在盐胁迫下蛋白激酶的活性提高而蛋白磷酸酶的活性被抑制。杨洪强等睁】研究表明干旱胁迫时蛋白激酶活性的提高使磷酸化蛋白水平也提高,然而随着蛋白磷酸酶活性的增加,磷酸化蛋白水平在蛋白磷酸酶的作用下从高峰又恢复到原有水平。
有关干旱胁迫对PP2C基因转录水平的影响的研究报道不是很多。Neale[65】等人发现,在干旱胁迫下,Sporobolusstapfianus的PP2C基因的转录本在耐旱材料中呈现急剧下降的表达模式,徐云峰等【66】的研究也表明,干旱胁迫下玉米ZmPP2C基因的转录受到明显抑制,但是也有研究报道干旱对PP2C基因的转录和表达没有影响【2引。本实验结果表明:在干旱胁迫条件下,ZmPP2Ca基因在3个耐旱自交系中呈现下调表达的模式;在3个不耐旱自交系中呈现上调表达特性。这表明ZmPP2Ca基因与玉米对干旱胁迫的响应有关。这一结果与沙莉娜mRNA差异显示的结果基本一致。
本研究结果还发现,干旱胁迫下耐旱自交系的下调表达和不耐旱自交系的上调表达在于旱胁迫处理12h时出现了波动,我们推测可能旱处理12d,时为蛋白磷酸酶与蛋白激酶相互作用的一个敏感临界点。因此,我们应该对这个时间点上基因表达特性进30
行进一步研究。而且,随着胁迫时间延长,ZmPP2Ca基因的表达呈现波动变化,这与蛋白磷酸化水平是由蛋白磷酸酶和蛋白激酶这一对酶相互协调作用的结果相一致。
ZmPP2Ca基因的鉴定将有助于提高耐旱分子标记辅助选择育种的效率。根据本研究结果,可通过比较玉米自交系在干旱胁迫处理6小时内与正常浇水对照ZmPP2Ca基因的表达差异,来鉴定玉米自交系的耐旱程度。但是这还需要进一步检测更多基因型的表达序列标签和单核苷酸多态性,来开发基因内选择标记,用于玉米品种耐旱性的改良。
6PP2C酶活性与耐旱性的关系
在干旱胁迫下,玉米叶片中的PP2C酶活性在耐旱自交系“81565"、“R09"和“N87-1"总体呈现下降趋势(这一点与定量PCR的结论基本一致),只有在个别时间有微小波动,且在48h达到最低值,这可能与蛋白质翻译的滞后性有关。而在不耐旱自交系“200B"和“ES40’’中,在干旱胁迫下,PP2C酶活性于前期均比较低,到后期开始上升并高于正常浇水对照。推测在干旱胁迫初期,不耐旱自交系“200B"和“ES40’’同样受到水份胁迫信号刺激,通过信号传导启动了抗旱机制,后由于蛋白磷酸酶活性提高而迅速恢复到原来水平,这可能与其抗旱机制持久性不强有关。不耐旱自交系“丹340’’在干旱胁迫下,其PP2C酶活性总体比正常浇水对照要高,说明有可能未响应干旱胁迫,也可能未通过与PP2C相关的信号通路去启动相关抗旱机制。酶活性变化的波动较大,不如基因相对表达量的变化趋势规律,可能是序犹家族其他同源基因的表达产物对活性检测仍然有干扰。
综上所述,由蛋白质激酶和蛋白质磷酸酶协同催化的蛋白质可逆磷酸化可能参与植物在干旱胁迫条件下的信号传导,但蛋白质激酶和蛋白质磷酸酶从不同方向催化同一可逆反应,各自又包括较多的同功酶,涉及胁迫信号传导的复杂体系,而且不同的基因型可能还有不同的应答机制,所以基因的差异表达和酶活性变化不尽相同。值得注意的是,汤厕叼蚀基因在3个耐旱自交系中的下调表达和在3个不耐旱自交系中的上调表达,都出现在干旱胁迫12h。由此推测,这可能是蛋白质激酶与蛋白质磷酸酶相互作用的临界点。疡怦燃因的差异表达以及由此引起的PP2C酶活性差异,可能与择标记,为耐旱性分子标记辅助选择提供有用信息。干旱胁迫条件下玉米细胞的信号传导有关,进一步深入研究有可能为开发为基因内选
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致谢
硕士论文研究是在导师李晚忱教授的悉心指导下完成的,在论文完成之际,我首先要衷心感谢他。从试验的设计、实施到论文的写作,无不浸透着导师的心血.导师严谨的治学态度,高风亮节的师德风范,渊博的知识和高瞻远瞩的敏锐洞察力都使我终身受益.还要特别感谢付凤玲教授在试验实施过程中,给我的指导、支持和鼓励。她的敬业精神,求真务实的科学态度和灵活多变的思维方式永远值得我学习.
这三年我生活在玉米研究所这个大家庭中,深刻的感受了它求实、向上的精神面貌和严谨的科学氛围.这个环境的创造,与所长荣廷昭院士严谨的治学态度、忘我的敬业精神是紧密相关的.同时,潘光堂教授、杨克诚教授、黄玉碧教授、曹墨菊教授、唐祈林副教授的严谨、体贴、细致的品德,也给我留下了深刻的印象,成为我学习的楷模.
衷心感谢李富华师姐、蒋伟师兄、胡铁师兄、牟禹师兄、李冠军师姐、倪娜师姐、何晶师姐、张志勇、徐宇强、阎雨、郑旭、陈梅、陶丹,以及各位师弟师妹等,他们在实验过程中,都给予我诸多帮助.感谢我的亲人这么多年来对我的关心和他们无私的奉献!
再次对在学习和生活中帮助过我的所有老师、同学和朋友表示最诚挚的谢意!
附录1分子生物学常用方法
1玉米叶片总RNA提取和检测
总RNA提取采用Trizol试剂盒(Invitrogen公司)并按照说明书进行,具体操作如下:
(1)取新鲜叶片或.70"C保存的玉米叶片放入液氮预冷过的研钵,立即加入液氮,尽可能的研磨碎样品,趁液氮尚未挥发将样品按每管100mg分装入用液氮预冷过的1.5mL离心管中,立即向每管加入lmLTrizol,剧烈振荡后,室温放置5min(此混合液在.70℃至少可以保存1个月)。
(2)向每管加入1mL氯仿(用量为Trizol的1/5),剧烈振荡15∞c后,室温放置3rain,4"C,12,000xg离心15rain,在尽可能不吸入中间层的情况下,吸出上清液转入另一干净的1.5mL离心管中,宁缺勿滥。
(3)向每管加入0.5mL异丙醇(用量为Trizol的1/2),轻轻混匀后,室温放置10min,4"C,12,000xg离,DIOrain,小心倒掉管中液体,保留沉淀,加入5mL75%乙醇洗涤沉淀。
(4)4"C,7500xg离心5mill,小心倒掉管中液体,保留沉淀,再加入5mL75%Z,醇洗涤沉淀,4℃,7500xg离心5rain,.20℃保存沉淀。
(5)去除总RNA中混杂的DNA,操作如下:
在一个干净的1.5mL的离心管中,依次加入以下成分:
以上混合液在37℃放置30min降解DNA。
(6)分别用等体积的苯酚、苯酚/氯仿(1:1)、氯仿抽提,以除去DNase和蛋白质。抽提后的溶液中加入1/10体积的3mol/LNaAC和两倍体积的无水乙醇,在.70℃放置。2h沉淀RNA。4"C离心10min,沉淀经75%乙醇洗涤后吹干。
(7)用适量的DEPC处理水溶解总RNA,用核酸蛋白仪(SMARTSPECrM300型,Bio-Rad公司)测定样品的OD260、OD260/280(1.80<A260/280<2.1)和浓度,计算出样品的纯度。
(8)取2此总RNA经1%的非变性琼脂糖凝胶电泳检测,剩余的总RNA置于37
.80℃超低温冰箱保存或者直接进行及转录反应。
2玉米叶片基因组DNA的提取
本研究采用CTAB法提取玉米叶片基因组DNA,具体操作如下:
(1)称取2.5g新鲜玉米叶片,去掉叶脉等,剪成1cm的小段,,放在预冷的研钵中,用液氮迅速研成均匀的粉末,在组织没有溶解之前,将粉末全部装入5mL的离心管中,一般装2/5管。
(2)迅速向离心管中加入2mL,65"C温育的CTAB提取缓冲液,轻轻摇晃混匀后65℃水浴1h。
(3)加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),混匀,轻微震荡15min。
(4)室温下,10,000r/min离一b8min。吸取上清到一个干净的5mL的离心管中。(5)重复步骤3,4一次。
(6)吸取上清到一个干净的5mL的离心管中,加入等体积预冷的异丙醇(4℃),轻轻混匀后冰上静置30min。
(7)室温下,4000r/min离,b5min,
(8)弃上清,用75%7,醇清洗两次,再用无水乙醇清洗一次,
(9)在真空干燥器中干燥10min,如果短期内不用,可以将干粉保存在.20*C。
(10)用适量的TEBufer溶解DNA,4"C过夜,,.
(11)在每管中加入3“L
染。10mg/mLRNaseA降解基因组DNAdP残余的RNA污
(12)用核酸蛋白仪测定样品的OD260、OD260/280(1.80<A260/2so<2.O)和浓度,估算样品的纯度和浓度。
(13)取2此基因组DNA经O.7%的非变性琼脂糖凝胶电泳检测,剩余的DNA.20℃保存。
3PCR产物的回收与纯化
采用北京天根生化科技有限公司的凝胶回收试剂盒纯化PCR产物。具体操作如下:
(1)将75此RT-PCR产物于1%的非变性琼脂糖凝胶中电泳;
(2)用干净的手术刀,将单一的目的条带快速从琼脂糖中切下(尽可能的切除多余凝胶)放入干净的1.5mLEppendorf管中,称其重量;
(3)向凝胶中加入3倍体积的溶胶液PN(即每100mg凝胶加入300止溶胶液PN),混均后置于50"C水浴锅内水浴10min,使胶彻底融化。加热溶胶时每2min混均一次。
(4)将吸附柱放入2mL收集管中,将融化的凝胶液(冷却至室温)转移到吸附柱38
中,13,000r/min室温离心30see;
(5)取下吸附柱,倒掉收集管中废液,将吸附柱放入原收集管中,加入700漂洗液PW,13.000laLr/min室温离心30see;
(6)重复步骤5
(7)倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入原收集管中,空转,13,000r/min室温离心2min,尽量出去残余液体;
(8)将吸附柱放入一个干净的1.5mLEppendorf管中,在吸附膜中间位置悬空加
min,13,000入至少30此65~70"C水浴预热的洗脱缓冲液EB,室温放置2r/min室温
离心1min,离心管中的液体即含有回收的DNA片段,可立即使用或.20℃保存备用。4末端平滑DNA片段的3’末端加“A”反应
采用Takara公司的DNA
下:A-TailingKit试剂盒,并参照说明书进行,具体操作如(1)在O.5mL的离心管中配制下列加“A”反应液,总体积为50此:
Mixture(各2.5mmol/L)4.0止dNTP
A-Tailingenzyme(5U/IxL)0.5皿
upt025.0止末端平滑DNA片段0.5-5昭ddH20
(2)72℃反应20min;
(3)加入50皿的ddH20,补充体积至100皿;
(4)加入10}tL(1/10量)的3mol/LCHaCOONa(pH5.2);
(5)加入250皿(2.5倍体积)的.20"C预冷的无水乙醇,充分混均;
(6)12,000xg,4"C离心10min回收沉淀,用70%的冷乙醇清洗沉淀后室温干燥。(7)溶解于适量的灭菌水中。
5感受态细胞的制备(CaCl:法)
(1)从LB平板上挑取新活化的EcoliDH5a单菌落,接种于3.5mLLB液体培养基中,37。C下振荡(225r/min)培养12h左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100.1:50的比例接种于100
O.35~0.5左右。mLLB液体培养基中,37℃振荡培养2.3h至OD600--
(2)将培养液转入离心管中,冰上放置10rain,然后于4"C下3000xg离心10min。(3)弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10mL轻轻悬浮细胞,冰上放置15—30min后,4"C下3000xg离心10rnin。
(4)弃去上清,加入4mL预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。39
(5)感受态细胞分装成200lal的小份,贮存于-70。C可保存半年。
6连接反应
采用Takara公司的连接试剂盒进行连接反应,反应体系总体积10此:
将以上各种反应试剂加入一个干净的O.2mLPCR管中,混匀后,用封口膜封好,放入16℃的低温水浴箱中连接6h,若暂时不做转化,可将连接产物保存于.20"C约一个月。
7质粒DNA提取
采用E.Z.N.APlasmidMiniprepKit(OmegaBio-Tek)提取质粒DNA。
(1)挑取KcoliDH5a单菌落于10mL含有Amp的LB液体培养基中,37"C振荡培养过夜(225r/min);
(2)室温下,12,000xg离心1min以收集菌体;
(3)尽量吸弃培养基,往沉淀中加入250此的SolutionI/R_NaseA混和液,涡漩重悬细胞,转移入1.5mL离心管中;
(4)往重悬混和液中加入250儿SolutionII,轻轻颠倒和旋转混匀试管4-6次混和溶液,以获得一澄清的裂解液;
(5)加入350止SolutionIII,并温和地上下颠倒离心管数次,直至形成白色絮状沉淀止,于室温下10,000×g离心10min|
(6)将HiBind小量柱子(I型)套在2mL的收集管中,小心将上清液转移到柱子上,室温下,10,000Xg离心1mini
(7)弃去滤出液,柱子重新套回收集管中,加入500此BufferHB,室温下,10,000×g离心1min|
lxLWashBuffer(已用无水乙醇稀
释),10,000Xg离心1min,弃去滤出液;
mL离心管中,加入50.100止灭菌水去离子水或TE缓
冲(加入的量取决于所需的浓度)至柱子基质。室温下,10,000×g离心1min以洗脱DNA。(8)弃去滤出液,柱子重新套回收集管中,加入750(9)室温下,10,000×g离心空柱lmin以干燥柱子;(10)将柱子套在一干净的1.5
(11)将产物稀释一定倍数后,用分光光度计测定质粒DNA的浓度和纯度。
附录2攻读硕士学位期间发表的学术论文
1何亮,李富华,沙莉娜,付凤玲,李晚忱.玉米2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)活性与耐旱性的关系.作物学报,2008,34(5):899-_903