免疫组化详细步骤
免疫组化步骤
取组织、固定、制片（脱水、透明、浸蜡、包埋）、切片、烤片、抗原修复、滴加抗体
一、取组织
二、固定
三、制片
1、脱水透明的酒精梯度和时间
70%酒精 20min 80%酒精 1h
90%酒精 1h 95%酒精Ⅰ 2h
95%酒精Ⅱ 2h 无水乙醇Ⅰ 15min
无水乙醇Ⅱ 15min 无水乙醇Ⅲ 15min
二甲苯酒精1:1 15min 二甲苯Ⅰ 25min
二甲苯Ⅱ 25min 二甲苯Ⅲ 15min
2、浸蜡：石蜡融化后，在石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各浸蜡1h
3、包埋
四、切片烤片
用切片机切片，取完整组织切片放于37℃温水中展片，取完整组织于载玻片上，并放入到60℃的烤箱中烤6个小时
五、脱蜡至水
六、抗原修复
配置柠檬酸抗原修复液于微波中煮沸，在高压锅内放入自来水煮沸（不盖锅盖），将装有煮沸的抗原修复液的烧杯置于高压锅内，将水化后的玻片放入煮沸的抗原修复液中，盖上锅盖，待其压力达到最大时维持三分钟
七、取出玻片，水浴逐渐降温直至完全冷却
八、将玻片放置于塑料板上，滴加3%的过氧化氢室温孵育10min ，以阻断内源性过氧化氢酶，10min 过后PBS 冲洗2次×3分钟
九、除去PBS （甩干或者吸水纸吸干），每张切片滴加第一抗体（稀释相应倍数），4℃过夜
十、PBS 冲洗3次×2分钟，除去PBS 液，每张切片滴加聚合物增强剂，室温孵育10min
十一、PBS 冲洗2分钟×3次，除去PBS ，每张切片滴加酶标抗兔聚合物，室温孵育10min
十二、PBS 冲洗2分钟×3次，除去PBS ，每张切片滴加新配制的DAB （二氨基联苯胺），室温孵育2~10分钟，显微镜观察
十三、苏木精复染：苏木精复染5min ，水洗3min ，0.1%HCl浸提两次，水洗3min ，反蓝液数秒，水洗
十四、脱水透明：70%酒精3min 、80%酒精3min 、90%酒精3min 、无水乙醇3min 、二甲苯Ⅰ3min 、二甲苯Ⅱ3min
十五、封片