120417--淡紫拟青霉建议书

淡紫拟青霉

建议书

The Investigation and Analysis

Report of Paecilomyces lilacinus

生物化工研究院

2012年04月17日

淡紫拟青霉项目建议书

1、 线虫病

线虫，又称蠕虫，一种低等无脊椎动物。在数量和种类上居动物界第二位，仅次于昆虫。到1990年已发现植物寄生线虫207个属，4832个种。分布很广，多数腐生于水和土壤中，少数寄生于人、动物和植物。

植物线虫是农作物、蔬菜、果树、林木、花卉及药材上重要的病原生物，危害仅次于真菌，超过细菌和病毒。我国较为严重的植物线虫病有根结线虫病、大豆胞囊线虫病、小麦粒线虫病、甘薯茎线虫病、水稻干尖线虫病、粟线虫病、松材线虫病等。其除单独危害植株以外，还可以与真菌和细菌共同侵染植株形成复合病害。1994年，全球因线虫危害给粮食和纤维作物造成的损失约12％，经济损失800亿美元。我国农作物种植业因线虫病每年约损失600多亿元。

多年的实践证明植物线虫病难防难治，目前仍无特效的化学农药，故应遵循“预防为主，综合防治”的方针，主要方法有：

利用线虫病被动传播为主的特点严格执行检疫措施；

利用植物线虫在不适宜的寄主上难以繁殖的特点，选用抗病、耐病品种； 利用大多数植物线虫有在土壤中的生活史的特点，用化学药剂预处理土壤； 进行汰选和种苗的热处理；

通过秋季晒土等耕作措施破坏植物线虫存活的适宜条件，以及利用生物防治等。根据已有的报道，生防中使用较多的是生防真菌，最有效的是淡紫拟青霉。

2、淡紫拟青霉

淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）属半知菌纲、丝孢菌目、丝孢菌科、拟青霉属。已报道的有近50种，常见的有淡紫拟青霉、玫烟色拟青霉、宛氏拟青霉等。1979年首次报道淡紫拟青霉对根结线虫的寄生作用。此后，有60多个国家进行了研究。其具有功效高、寄主广、易培养等优点，在控制植物线虫病方面功效卓著。【1】

其作用机理是与线虫卵囊接触后，在粘性基质中其菌丝包围整个卵，菌丝

末端变粗，由外源性代谢物和其几丁质酶的作用使卵壳表层破裂，随后其侵入并取而代之。同时也能分泌毒素对线虫起毒杀作用。

3、应用与效果【2,3】

对线虫：淡紫拟青霉是根结线虫与胞囊线虫卵的有效寄生菌，对根结线虫的卵寄生率达60%~70%，并具有明显的增产效果。对其他多种线虫也都有防治效能。

对昆虫：淡紫拟青霉可寄生半翅目的荔枝蝽蟓、稻黑蝽；同翅目的叶蝉、褐飞虱；等翅目的白蚁；鞘翅目的甘薯象鼻虫以及鳞翅目的茶蚕、灯蛾等。

对植物病原菌：在玉米小斑病、小麦赤霉病、黄瓜炭疽病菌、棉花枯萎病和水稻恶苗病上对致病菌均有拮抗作用。

淡紫拟青霉次生代谢物也具有一定的生理功效：在培养过程中，特别是在特殊培养基与深层发酵中，能产生类似吲哚乙酸产物，它最显著的生理功效是低浓度时促进植物根系与植株的生长，同时对种子的萌发与生长也有促进作用。此外其还能产生多种功能酶并具有一定农药降解效应。

4、市场现状

4.1 生产厂家

国际上最早产品出现在1983年，菲律宾、法国等国家也都有过产品。中国最早是在1993年申请的产品“大豆保根剂”。

目前市场上该类产品众多，作为农药和微生物肥料的都有。但是在国家注册的很少，农药生产厂家有福建凯利和德强生物，微肥（临时证）生产厂家有河南无道理、黑龙江三龙、潍坊华滨、德强生物。【4】

国外在美国、欧盟均有产品，如美国产品淡紫拟青霉 菌株251（028826），但都没有出口我国。【7】

4.2 研发专家【5】

国内有多家单位进行过较大规模的中试与生产并已制成相应的菌剂，分别是： 中科院微生物所及中国农科院生防所——刘杏忠：与黑龙江三龙合作推出“利根生生物有机肥（大豆保根剂）” 厦门大学——潘沧桑：其称福建凯立和德强生物均采用其技术。

云南大学——张克勤：其针对烟草开发，经过中试和试验，最终放弃淡紫拟青霉选择了厚孢轮枝菌，形成产品“线虫必可”。

华南热带作物研究院——黄俊生：多位学生发表过关于淡紫拟青霉的研究论文，未见到过产品。

4.3 价格

由于厂家较多，价格也多样，100亿孢子/g产品（母药）约50-100元/Kg。凯立生物6.6万/吨（折合66元/Kg），德强生物10万/吨（折合100元/Kg）。也有极便宜的，约1.6万/吨，可靠性较低。【8】

5. 生产工艺与引进渠道

5.1生长条件【6】

淡紫拟青霉8-38℃可以生长，15-30℃生长良好，最佳生长和产孢温度为25-30℃。完全黑暗条件下生长最佳。生长pH为2-12，最佳生长pH为6-9，产孢最佳pH为4-6。

5.2 培养基条件

淡紫拟青霉营养要求不高，碳水化合物、有机酸及低级醇类都可以作为其培养的碳源，其中以二糖为最佳；氮源可以是有机无机氮均可。

它不仅能在多种常规培养基上生长，并能在多种自然基质如农副产品废料、废渣与植物叶片或植物浸提液中生长，而且可产生大量孢子，便于大规模工业化发酵生产。

5.3 发酵技术

真菌生物农药的生产目前主要采用液固双相发酵技术。

发酵周期液体阶段5天，固体阶段7天。其它详细发酵参数见附件【6,9】 固体发酵设备视种类、大小、材质等条件，价格从几千到几十万不等。如采用不锈钢发酵盘最便宜，约几万元；发酵池造价十几万；固态发酵罐则需要几十万。【10】

5.4 使用方法 福建凯立，蔬菜主要采用穴施，配以苗床消毒、条施；大豆采用拌种。 德强生物，蔬菜采用穴施或沟施。

5.5 产业化问题

主要问题：杀灭率较化学药剂低、起效时间较慢、药效不够稳定、制剂存放时间较短的问题。产业化中需要注意其生产培养基要求极其简单，所以生产成本是制约其工业化的一个主要因素。

5.6 产值估算及毛利率

产值估算：由于发酵工艺采用双向发酵，液态发酵仅作为种子使用，现有设备完全可以满足此步骤要求，生产规模完全取决于固态发酵设备的建设规模。按照液体发酵规模5吨，液体菌种接种比例约16.5%计算，可供约24.3吨固体发酵

使用，获得孢子粉约166Kg，得到产品约3.3吨（孢子与辅料比例1:20），实现产值约26.5万。

毛利率：由于固体发酵培养基所选的发酵原材料直接制约生产成本，而不同技术方提供的技术所选发酵原材料也差异较大，本公司能够利用的发酵原材料价格也不同，故无法直接推算毛利率。

6、引进渠道

在国内较有背景和历史的研究者有3个，厦门大学的潘沧桑，中科院的刘杏忠，云南大学的张克勤。其他还有华南热带作物研究院，黄俊生；福建农林大学，张绍升等。

其中厦门大学潘沧桑教授较权威，经前期接触，其表示：淡紫拟青霉项目技术成熟，最大做到5吨罐，生产成本很低。目前有农药号的两家公司，凯立生物私下拿的他的技术，目前做的不好；德强生物是买的他的技术，但是不遵守合同，故现在生产效果不好。

7、结论与建议

a) 市场定位：淡紫拟青霉作为治疗危害极大的植物线虫病的最有效生防产品极

具潜力：其绿色安全，获得欧美等发达国家肯定，是当前利润较高的有机农业的线虫防治的首选产品；在非有机领域，虽不如大剂量的化学农药起效快、杀灭率高，但是具有独特的持效期长等特点，也受到市场肯定。且项目销售渠道与农化产业一致，节约市场拓展成本；

b) 技术引进：由于已经开发多年，固体发酵工艺简单，技术渠道多；

c) 生产技术：主要依靠发酵技术，是本公司优势所在，消化吸收和试生产阶段

成本易控制；

d) 主要问题：生产后期需要固态发酵设备，该设备是淡紫拟青霉、白僵菌、绿

僵菌等生物防治真菌的必须设备，且设备投资低、见效快。如配套该设备，将为农化产业的产品线打开新的思路，并可充分发挥生物产业的技术和产能优势，为提高利润打开突破口。

根据2011年公司提出的“一体两翼”策略，生物产业和农化产业的一体化进程仍有待加强。淡紫拟青霉项目具有明确的作用对象、合理的市场空间、持续的发展潜力。推行此产品可以充分利用生物产业生产资源优势，结合农化产业销售渠道优势，实现两个产业的强强联合。并一举打开绿色农业、有机食品这个新兴市场，开拓一条具有竞争力的发展之路。同时可以为农化产业增加有机农业产品，实现产品线的补全，有助于树立全面、专业、绿色的农化龙头企业形象。针对唯一的固态发酵设备问题，如购置则可以以低廉的成本为农化产业开辟新的市场道路；如暂不购置，也可以作为技术储备，为今后的绿色发展奠定基础。

附录：

【1】 淡紫拟青霉对根结线虫的寄生作用是秘鲁国际马铃薯研究中心的P.Jatala首先发现的，并在1979年首次报道。此后，有60多个国家的科学工作者对此菌进行了研究。此菌广泛分布于世界各地，具有功效高、寄主广、易培养等优点，特别在控制植物病原线虫方面功效卓著。半个多世纪以来，国内外许多专家学者对此菌进行了广泛而深入的研究，在生物学、生态学、大量培养、控害效能与田间应用等方面取得了一系列研究成果。

淡紫拟青霉主要针对根结线虫。根据估计，全世界每年因线虫危害给粮食和纤维作物造成的损失大约为10%。我国农作物种植业因线虫病每年约损失600多亿元。甜菜胞囊线虫、马铃薯金线虫，温暖地区的根结线虫等是世界上引起严重植物线虫病害的主要线虫种类之一。在我国，东北和黄淮地区的大豆胞囊线虫、甘薯茎线虫、粟线虫和水稻干尖线虫一直造成生产上的严重损失。

【2】淡紫拟青霉的作用对象

对植物病原线虫

淡紫拟青霉是南方根结线虫与白色胞囊线虫卵的有效寄生菌，对南方根结线虫的卵寄生率高达60%~70%。对多种线虫都有防治效能，其寄主有根结线虫、胞囊线虫、金色线虫、异皮线虫、甚至人畜肠道蛔虫，是防治根结线虫最有前途的生防制剂。

淡紫拟青霉菌对根结线虫的抑制机理是淡紫拟青霉与线虫卵囊接触后，在粘性基质中，生防菌菌丝包围整个卵，菌丝末端变粗，由于外源性代谢物和真菌几丁质酶的活动使卵壳表层破裂，随后真菌侵入并取而代之。也能分泌毒素对线虫起毒杀作用。

对昆虫

据文献资料，淡紫拟青霉可寄生半翅目的荔枝蝽蟓、稻黑蝽；同翅目的叶蝉、褐飞虱；等翅目的白蚁；鞘翅目的甘薯象鼻虫以及鳞翅目的茶蚕、灯蛾等。

对植物病原菌

淡紫拟青霉36-1菌株对植物病原菌具有拮抗效能。在玉米小斑病、小麦赤霉病、黄瓜炭疽病菌、棉花枯萎病和水稻恶苗病上试验，淡紫拟青霉菌株活菌体液对其菌丝生长抑制率分别为80.22%、80.50%、77.71%、75.30%和61.36%；处理柑桔果面，青、绿霉扩展抑制率为65.97%。批量处理柑桔，好果率为78.44%，比对照高54.44%。

【3】淡紫拟青霉次生代谢物的生理功效

促进植物生长

在拟青霉的培养过程中，特别是在特殊培养基与深层发酵培养过程中，该菌能产生丰富的衍生物，其一是类似吲哚乙酸产物，它最显著的生理功效是低浓度时促进植物根系与植株的生长，因此在植物根系施菌不仅能明显抑制线虫侵染，而且能促进植株营养器官的生长，同时对种子的萌发与生长也有促进作用。

产生多种功能酶

此菌能产生丰富的几丁质酶，几丁质酶对几丁质有降解作用，它能促进线虫卵的孵化，提高拟青霉菌对线虫的寄生率，此外还能产生细胞裂解酶、葡聚糖酶与丝蛋白酶，Galvez-Mariscal研究表明：在高效菌株中蛋白酶和葡聚糖酶、淀粉酶活性高出1.2~4.2倍和20~120倍，这些酶促进细胞分裂。

降解效应

Somaseknar研究发现，淡紫拟青霉能促进难溶磷酸盐的溶解，实验室研究证实：拟青霉菌的增溶效果达到30%，其它线虫拮抗菌达到20%~40%。同类研究还表明，拟青霉还能促进许多化学聚合物（如农药，制革废水等）的分解，这证明淡紫拟青霉具有一定的环保效应。

防效

Lara et al.用淡紫拟青霉防治番茄根结线虫病的结果表明，淡紫拟青霉可以寄生根结线虫的卵，减少根结线虫的虫口密度和作物的根结数量，同时增加作物的产量。Benjamin Dube用淡紫拟青霉和穿刺巴氏杆菌(Pasteuria penetrans)混合施用来防治冬碗豆南方根结线虫(M. incognito)，与对照相比，产量显著增加。Zaki et al.通过盆栽试验确定田间施用淡紫拟青霉防治番茄根结线虫病害的最适剂量，结果显示，每kg土壤中混合4g菌剂较为适宜，处理的根结指数和2龄幼虫数量分别下降了69%和86%，根结线虫的卵囊有58%被侵染，66%的卵遭到破坏。

我国，吴家琴等通过盆栽和大田试验证明淡紫拟青霉对红麻根结线虫病有明显控制作用。施用淡紫拟青霉制剂后，可显著减轻红麻根结线虫病害，增产达11.9%。李芳等利用淡紫拟青霉防治烟草根结线虫病试验及结果表明：该菌能有效地抑制烟草根结线虫的发生并促进植物的生长，病情指数下降43.6%，植株鲜重增加96.3%。刘杏忠等研制的淡紫拟青霉菌剂在我国东北、黄淮等地区地进行了大面积防治大豆胞囊线虫试验，防效一般在60%以上，增产效果明显。

【4】

农业部农药注册产品 生产厂家 登记证号 总含量 剂型

母药

粉剂

母药 有效起始 有效截止 2009.09.21 2014.09.21 2009.09.21 2014.09.21 2011.09.15

2016.09.15 福建凯立生物制品有限公司 PD20096840 200亿活孢子/克 福建凯立生物制品有限公司 PD20096841 2亿活孢子/克 德强生物股份有限公司

德强生物股份有限公司 PD20110980 100亿孢子/克 PD20110951 5亿活孢子/克 颗粒剂 2011.09.08 2016.09.08

潍坊市华滨生物科技有限公司引进世界微生物尖端技术，以淡紫拟青霉为主18亿/g（菌种历史为：日本东京大学应用微生物研究所，中国科学院菌种保藏中心编号为：CGMCC3.829），枯草芽孢杆菌和侧孢芽孢杆菌2亿/g，配以中药提取物，经特殊培养基和发酵技术，于2009年底推出“克线灵淡紫拟青霉”产品。主要功效为防治线虫和促进植物生长。经过一年多的田间使用，收到了很好的效

果。

【5】专家介绍

刘杏忠

刘杏忠研制成以食线虫真菌淡紫拟青霉为主，添加有机质等多种组分的生防菌剂-大豆保根菌剂，在我国东北及黄淮海地区推广示范累积达35万亩，对大豆胞囊线虫病防效达60%-70%。

2011年9月8日，由我院农畜产品综合利用研究所三龙生物科技有限公司生产的大豆孢囊线虫生防菌剂--利根生生物有机肥（大豆保根菌剂）应用技术现场交流会在黑河市逊克县召开。会议由黑龙江省土肥站主办，黑河市逊克县农业技术推广中心和哈尔滨彤洲农资经销处协办，黑龙江省农垦科学院农畜产品综合利用研究所、植保所、黑龙江农垦三龙生物科技有限公司做为技术依托单位和生产厂家参加了会议。

潘沧桑

潘教授表示“杀线1号”技术成熟，最大做到5吨罐，生产成本很低。菌株为淡紫拟青霉。目前有药号的两家公司，凯立生物制品有限公司（福建）也通过特殊渠道拿的他的技术，目前做的不好，老板去了美国；德强生物股份有限公司（哈尔滨）是买的他的技术，但是不遵守合同，故现在生产效果不好。

2001年2月15日德强生物股份有限公司与厦门大学成立了厦强线虫生防研究中心，完成淡紫拟青霉项目的中试、年产500吨5％淡紫拟青霉颗粒剂的中试，取得了成功，很好地完成了研究内容，并在全国各地进行了药效试验，取得了良好效果。

张克勤

我国在上世纪90年代初，由云南大学微生物发酵工程重点实验室和中科院微生物所联合云南烟草科学研究院农业研究所开始了烟草根结线虫生物防治的研究工作，经过十多年的努力，从菌株筛选、剂型研制、生产技术、大田应用及土壤生态等方面进行大量研究。筛选出以厚孢轮枝菌（Pochonia chlamydospora）和淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）为生产菌株的生防菌剂两种，经过80000余亩的大田应用，最终厚孢轮枝菌效果较为突出，形成线虫必克产品，该产品的成分是厚壁轮枝菌，生产厂家是云南陆良酶制剂有限责任公司。

【6】生产技术

生长条件

温度、光照和pH是影响生长发育的重要因子。淡紫拟青霉生长温度范围很

宽，从8℃到38℃都可以生长，在15～30℃生长良好，最佳生长和产孢温度为25～30℃，6℃和40℃时停止生长，35℃时停止产孢。由于该菌是土壤习居菌，光照对其生长和产孢有一定的抑制作用，所以在完全黑暗条件下生长最佳，其次是黑暗和光亮交替，在光亮中也能生长。pH在2～12均能生长，菌丝生长最佳pH为6-9，产孢最佳pH为4-6，这样的广谱适宜温度和pH范围使其在农业土壤中成为有竞争力的生物。

培养基条件

淡紫拟青霉营养要求不高，碳水化合物、有机酸及低级醇类都可以作为其培养的碳源，其中以二糖为最佳；氮源可以是有机氮，也可以是NaNO3，NH4NO3等无机氮化合物。它不仅能在多种常规培养基上生长，并能在多种自然基质如农副产品废料、废渣与植物叶片或植物浸提液中生长，而且可以产生大量孢子，这就便于对其进行大规模工业化发酵生产，可以制成固体或液体菌剂，用于根施、拌种或喷施。

虽然淡紫拟青霉等食线虫菌物均可以在麦粒、大米、小米、马铃薯、绿豆及各种农副产品如玉米渣、鼓皮，甚至树叶等基质上培养，这方面的报道很多，但是为了能使生产出的菌剂有市场前景，各研究者都在努力尝试用价格低廉的物质来培养食线虫菌物，在选材方面都尽可能的利用当地易获得的材料，比较有代表性的如Brand et al. ( 2004 )利用当地丰富的咖啡豆壳、木薯根渣、脱脂豆、甘蔗渣作载体来培养淡紫拟青霉。

发酵技术

真菌生物农药的生产目前主要采用液固双相发酵技术。这一技术体系中，液相发酵水平相对较高，固相发酵基质包括了大米、麦粒等谷物及稻壳、谷糠、麦鼓等副产物甚至某些植物废弃物如树叶、种子及锯末、菜园土、塘泥土等。但是传统的固相发酵常存在发酵周期长、产孢率低等缺点。因此，建立新型的固相发酵技术是真菌农药孢子生产的关键技术之一。

在淡紫拟青霉的液体发酵方面，夏振远等(2002)研究了淡紫拟青霉IPC菌株的最适培养基复合配方，探明了该菌株的液体深层发酵条件。李芳等(2005)研究表明摇床转速不仅影响淡紫拟青霉菌丝生长与孢子生成，而且影响淡紫拟青霉次生代谢物的毒力。孙漫红和刘杏忠(2004)应用多级液体发酵，液生孢子含量已达5×l08mL-1以上，菌丝干重在1.8%以上。

双相发酵流程

质量标准

淡紫拟青霉PL89可湿性粉剂的质量标准

福建农林大学，张绍升的专利2010.3转让给了漳州三炬生物科技有限公司，但是没有农药登记。

① 孢子原粉及可湿性粉剂的含孢量

孢子原粉的含孢子量≥120亿个·g-1，合格

可湿性粉剂的含孢子量≥20亿个·g-1，合格

② 孢子萌发率

孢子原粉萌发率≥95.0%，合格

可湿性粉剂萌发率≥90.0%，合格

③ 干燥减量的要求

孢子原粉的干燥减量(质量分数)≤12.0%，合格

可湿性粉剂的干燥减量(质量分数) ≤5.0%，合格

④ 润湿时间

可湿性粉剂的润湿时间≤12.0 min，合格

⑤ 悬浮率

可湿性粉剂的悬浮率(质量分数) ≥70%，合格

⑥ 真菌杂菌率

孢子原粉在10-8、10-7和10-6三个稀释度内不得检出，可湿性粉剂在稀释度10-6不得检出。

⑦ 细度

通过74 μm筛质量分数≥96.0%，合格

⑧ 毒力测定

暂无

另外文献中提到淡紫拟青霉的毒性

淡紫拟青霉制剂对哺乳动物、鸟类、鱼类和家蚕低毒。雌雄大鼠经口LD50>10000 mg/kg；雌雄大鼠涂皮处理LD50>2000 mg/kg；对兔眼无刺激性；在0.2 g/只的剂量下，豚鼠局部皮肤致敏接触和激发接触均无任何异常改变；以500 mg/kg的剂量处理小鼠，未发现脏器的病变，无急性致病性；蜜蜂LD50 (48)>100.0 ug.a.i只，24h、48h观察无异常症状；5000 mg/kg.bw的剂量经口投予鹌鹑，一周后观察雌雄鹌鹑均未出现中毒症状；斑马鱼LD50 (96)>100.00 mg/L，在96h的试验期间，试验鱼接触药液后，游动减缓；24h、48h和96h家蚕的半数致死浓度LD50>5000 mg/kg。

⑨ 孢子原粉及制剂的有效期

暂无（由于作为真菌孢子制剂农药，在常温下的长期保存的问题尚未得以实际意义上的解决，因此，不作贮存时间上的标准，但是原则上以不越夏保存3个月仍具有70%的孢子萌发率作为考虑的标准。）

使用方法

福建凯立生物，蔬菜主要采用穴施，配以苗床消毒、条施；大豆采用拌种。

自己主页宣传：

德强生物，农业部登记：

【7】淡紫拟青霉 菌株251的最佳实验室生长温度21-27℃。使用场所：食品和非食品作物，包括蔬菜，水果，草皮，观赏植物，烟草。目标害虫：植物根系线虫，根结线虫和孢囊线虫。2005年3月30日，EPA注册，号码72444-2。注册公司：Prophyta Biologischer Pflanzenschutz GmbH (德国)。

【8】另外，在阿里巴巴查到台湾农冠的淡紫拟青霉价格为1.6万/吨。其号称生物农药，但是没有农药三证。

【9】淡紫拟青霉的固体发酵工艺研究，牟宏晶，哈尔滨理工大学，化学与粘合，2008/04

【10】固体发酵设备

上海百仑的50L固体发酵罐，85000元.

发酵池是4米宽，并排两个，一台翻抛机，包括轨道，长度大概30米，2009年造价12万元。