人参果总皂苷对人宫颈癌Hela细胞抗肿瘤作用及机制的研究

人参果总皂苷对人宫颈癌Hela细胞抗肿瘤作用及机制的研究

李丽静，张亚杰，刘佳，吴世家，张淞，郭红，王蔚，王威，王继彦＊＊

（长春中医药大学药学院中药药理教研室，长春130117）

*

目的：研究人参果总皂苷对体外培养的肿瘤细胞作用，并初步探讨其作用机制。方法：MTT法测定人参果总皂苷对

人宫颈癌细胞（Hela）细胞株的增殖的影响；电镜观察人参果总皂苷对肿瘤细胞形态学的影响；Westernblot免疫印记法检测人参果

0．25、0．50、1．00、2．00、4．00μg/ml人参果总皂苷对Hela细胞的增总皂苷对Hela细胞细胞周期相关蛋白表达的影响。结果：0．125、

透射电镜下可见细胞核染色质边集、核碎裂及凋亡小体情况，具有一殖均有抑制作用；0．5μg/ml人参果总皂苷作用于Hela细胞后，

定的促进肿瘤细胞凋亡的作用；cyclin和CDK4的蛋白表达逐渐减少。结论：人参果总皂苷对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，其作用机制可能与促进肿瘤细胞的凋亡有关诱导其凋亡使细胞停滞于G2/M期密切相关。

关键词人参果总皂苷；肿瘤细胞；凋亡；周期阻滞人参PanaxginsengC．A．Meyer为五加科人参属植物，不但

而且其茎叶亦供药用，并有广泛的生物学活性，果实其根药用，

研究较少，课题组近十年的研究表明人参果含有人参皂苷并具

有一定的生物活性，从人参浆果中分离得到人参果总皂苷，经分离鉴定含有异人参皂苷Rh3、人参皂苷Rh2、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb1、β-谷甾醇和化合物K等12个化合物及5

［1，2］

，个待鉴定化合物为观察其抗肿瘤活性及机制，进行了如下研究：

12、24、48、72h后，共同培养0、每孔加入20μl的5%MTT，再培弃上清，每孔加入150μl的DMSO，振荡10min，应用酶标养4h，

仪于570nm处测吸光度值（A）。1．2．2

人参果总皂苷对Hela细胞电镜形态学观察

6

摘要

Hela细

胞以每瓶1×10个接种于50ml培养瓶中，培养24h后，加入51500r/min离心5min，μg/ml的人参果总皂苷，培养24h后，收集贴壁及悬浮细胞，细胞沉淀用2．5%戊二醛固定，再用1%锇Epon812环氧树脂包埋，LKB-酸固定后，乙醇脱水，Ⅲ型超薄切片机半薄切片定位后做超薄切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，透射电镜下观察形态改变，并拍摄照片。1．2．3

Westernblot免疫印记法检测人参果总皂苷对相关蛋白

表达的影响5μg/ml人参果总皂苷分别作用于Hela细胞0，6，12，18，24h，提取蛋白质，进行Western免疫印记法操作，检测周期相关蛋白cyclin及其相关激酶CDK4的蛋白表达量。

1

1．1

材料与方法

试验药物人参果总皂苷为为五加科植物人参Panaxgin-sengC．A．Mey．的成熟干燥浆果中提取的总皂苷，由课题组化学人宫颈癌细胞（Hela）：细胞株购自中国协和医科

培养于含10%胎牛血大学细胞中心。按常规方法培养传代，

组提供。

1．2动物

2结果

人参果总皂苷对Hela细胞的增殖抑制作用

实验结果

2μmol/L谷氨酰胺、100U/L青霉素、100mg/L链霉素RP-清、MI-1640中，37℃、5%CO2培养箱中饱和湿度下培养，取对数生长期细胞用于实验。

1．3试剂噻唑蓝（MTT）和二甲基亚矾（DMSO）购自美国Sigma公司；RPMI-1640为美国GIBCO产品；胎牛血清（进口分0．25%胰蛋白酶-EDTA消化液，Hank＇液，装），双抗，谷氨酰胺，

0．1mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）均购自中国协和医科大学细胞中心。1．4仪器

321D型）、二氧化碳培养箱（ESPECBNA-倒置显

微镜（日本Olympus光学工业株式会社）；100级超净工作室（苏州）；离心机（北京离心机厂）；酶标仪（BioRad560型）；透射电

2．1

表明，人参果总皂苷对Hela细胞的增殖具有明显的抑制作用，并呈时-效和量-效关系；随着总皂苷浓度的增加，作用时间的延长，其杀伤Hela细胞的能力也随之增强，当浓度达到较高浓度72小时接近，时对Hela细胞的增殖抑制作用48、推测，人参果皂苷作用48h即可达到较好作用。实验结果见表1：

表1

药物浓度

（mg/ml）

0．1250．116±0．022＊＊0．082±0．013*0．250．501．002．004．00

12h

24h

±s，n=10）人参果总皂苷对Hela细胞株生长的抑制作用（x珋

OD值

48h

72h

0．082±0．025＊＊0．218±0．033＊＊

子显微镜（TECNAIG2，荷兰）。

1．5方法

［3］

人参果总皂苷对Hela细胞增殖的影响取对数生

6

调整细胞浓度为1×10/L接种于96孔培养板，长期细胞，

100μl/孔，0．25、0．50、1．培养24h后，加入不同浓度的（0．125、

0．105±0．024＊＊0．096±0．026＊＊0．099±0．035＊＊0．242±0．031＊＊0．101±0．032＊＊0．091±0．022＊＊0．092±0．036＊＊0．227±0．051＊＊0．103±0．033＊＊0．083±0．022*0．102±0．037＊＊0．056±0．042*0．090±0．012*

0．056±0．0220．366±0．031

0．095±0．041＊＊0．251±0．027＊＊0．073±0．026*0．359±0．024

0．258±0．048＊＊0．460±0．042

0．077±0．027＊＊0．098±0．036*

1．5．1

对照组0．373±0．047

00、2．00、4．00μg/ml）的人参果总皂苷，同时设阴性对照组、空白对照组（即只加培养液，不加细胞以调零），每组均设4复孔。

*

与细胞对照组比较*P＜0．05，＊＊P＜0．01

2．2人参果总皂苷对Hela细胞形态学电镜观察

＊＊

电镜下观

pt014吉林省科技厅课题课题编号：200905110；吉林省中医药管理局课题，课题编号2010-通讯作者

30h，药物作用24，已清晰可见细胞膜包裹细胞器或核样小体，

片段形成典型的凋亡小体。

通过上述Hela肿瘤细胞在人参果皂苷5μg/ml浓度作用

6，12，18，24和30h），下，随着时间的延长（0，肺癌细胞在超微结构上发生变化，细胞超微结构出现比较典型的细胞凋亡的特

从形态学上进一步证明，人生果皂苷诱导Hela细胞凋亡是征，

其抑制肿瘤细胞生长的作用机制之一（图1）

。

察，未加药物组细胞形态完整，呈略不规则形，细胞表面微绒毛

丰富，核呈不规则形，核仁明显，胞质内可见线粒体，嵴清晰，可见细胞桥小体使细胞彼此粘附连接成完整的单层细胞；加入5μg/ml的人参果总皂苷后，随药物作用时间延长，细胞呈现凋亡改变，药物作用6h，可见细胞表面微绒毛脱落，核小，胞质内部

嵴断裂，有较多溶酶体产生，药物作用12h，细胞分线粒体肿胀，

表面微绒毛消失，核仁明显，胞质内出现大量空泡状结构，药物

作用18h，细胞核内异染色体趋边凝聚呈块状，并可见胞质内髓

图1人参果总皂苷处理Hela细胞电镜形态变化

5μg/ml人参果皂苷作用：0h：A；6h：B；12h：C；18h：D；24h：E；30h：F

2．3Western免疫印记法检测人参果总皂苷对相关蛋白表达

6，12，18，24h，的影响5μg/ml人参果总皂苷作用0，随着时间

cyclin和CDK4的蛋白表达逐渐减少，的推进，推测人参果皂苷可最终引起肿瘤细胞在G2/M期积累，其诱导Hela细胞凋亡与

其影响了各周期相关蛋白和激酶的表达密切相关（图2）

。

是一胞周期连续合成不断积累而活性出现周期性变化而得名，

组结构类似、能结合并调CDK的蛋白质，统称为cyclin家族。细胞周期受细胞周期蛋白（cyclinB1）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）及其抑制剂（CKI）的共同调控。cyclinB1在G2/M期检查点发挥重要作用，其水平升高可使细胞周期阻滞在G2/

［4、5］

M期的检查点上。CDK是一组丝氨酸-Thr）苏氨酸（Ser-蛋白激酶，故称CDK家族。细胞周期检查机制障碍与肿瘤、衰老、凋亡等的发生有密切关系。对于G2/M调控点而言，其进CDK1复合物活性调控［6］。肿瘤细胞的G2/程主要受cyclinB1-M检查点失控，以致在DNA复制出现错误或复制不全的情况下仍然启动M期。cyclinD1－CDK4复合物活性，使细胞阻滞于G1期，并诱发细胞凋亡。同样抑制cyclinB1－CDK1复合物活性及CDK1蛋白表达，亦能使肿瘤细胞阻滞于G2期，并导致细

［7，8］

。胞凋亡而达到治疗肿瘤的目的

图2Western免疫印迹检测人参果总皂苷对Hela细胞周期相关蛋白及激酶表达的影响

本研究结果表明，在离体抗肿瘤实验中，人参果皂苷对Hela

细胞增殖具有抑制作用，可以诱导Hela细胞凋亡；5μg/ml人参6，12，18，24h，cyclin和CDK4果总皂苷作用0，随着时间的推进，的蛋白表达逐渐减少，推测人参果皂苷可最终引起肿瘤细胞在G2/M期积累，其诱导Hela细胞凋亡与其影响了各周期相关蛋白和激酶的表达密切相关。推测其抗肿瘤作用机制通过影响细

CDK2等）使肿瘤细胞胞周期相关蛋白cyclin及其激酶（CDK1、

堆积于G2/M期，进而诱导凋亡发生而完成抑制肿瘤细胞分裂

增殖进而杀死肿瘤细胞的全过程。

人参果为五加科植物人参的成熟果实，人参是重要的中药，在临床上广泛使用，目前对人参根、茎、叶的研究已有大量报道，

3讨论

恶性肿瘤的本质是细胞周期调节失控，进而导致细胞无限

G2/制的分裂和增殖。细胞周期的调控主要通过并通过G1/S、M两个关键限制点进行调控。Cyclin-CDK-CKI系统是真核细胞

CDK是此系统的中心，cyclin具有最重要的细胞周期调控系统，

正性调控的作用，而CKI则为负性调控因子。cyclin因其在细

而对人参果化学成分的研究报道相对较少且不深入。吉林省为人参主产地，每年产果浆千余吨，由于搓破取籽，果浆白白流失而按干品计算其中所含人参皂苷含量是人参根的3～4倍，掉，

极有开发利用价值。系统深入研究人参果化学成分及其生物活性，扩大人参的药用范围不但有其理论意义，而且还有重要的经济效益和社会效益。近年来国内外人参果的药理研究主要在对心血管系统的作用（人参果皂苷有抗休克、保护心肌作用）；对内分泌系统的影响（人参果皂苷的抗应激作用和对垂体肾上腺皮质系统功能）；抗衰老作用；对物质代谢的作用；对免疫系统的

［9］

作用等等，但是抗肿瘤作用报道较少，通过课题组系列抗肿瘤的实验研究，为人参果的开发和利用提供参考依据。

参考文献

12

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2006；37（12）∶1761～1764中草药，

penoidsaponinfromthefruitsofPanaxginsengC．A．Mey．．JAsianNatProd

Thestudyofantitumoreffectofginsengfruitsaponinsonhumancervicalcancercellsandpossibalmechanism

LiLijing，ZhangYajie，LiuJia，WuShijia，ZhangSong，GuoHong，LuYubo，WangWei，WangWei，WangJiyan

（DepartmentofPharmacology，ChangchunUniversityofTCM，JinlinChangchun

130117）

Objective：Tostudytheeffectsofginsengfruitsaponinsontumorcellsinvitro，andtoexplorethepossibalmechanism．Methods：Thegrowtheffectofginsengfruitsaponinsonhumancervicalcancercells（Hela）celllinewasdetectedbytheMTTassay；Theeffectoftatolsapo-ninsontumormorphologicalwasobservedbyelectronmicroscopy；andtheeffectofginsengfruitsaponinsonHelacellcyclerelatedproteinexpressionwasexaminedbyWesternblotanalysis．Results：0．125、0．25、0．50、1．00、2．00、4．00μg/mlginsengfruitsaponinscouldinhibitthegrowthofHelacells；0．5？g/mlginsengfruitsaponinsplayapartinpromotingtumorcellapoptosiswhenitactedonHelacells，wecanseethattheaggregationofchromatinincellnucleus，nuclearfragmentation，andapoptoticbodiesbyelectronmicroscopy；Theexpressionofcy-clinandCDK4graduallyreduced．Conclusion：Ginsengfruitsaponinshaveinhibitoryeffectontumorcells，themechanismmaybeassociatedwithpromotingtumorcellapoptosisandarrestingcellcycleinG2/Mphase．Keywords

totalsaponinsginsengfruitsaponins（人参果）；tumorcell；apoptosis；cyclearrest

葡萄籽原花青素缓解肾血管性高血压大鼠的血管重塑

*

111213

张妍，吴秀香＊＊，孙柳青，唐剑涛，靳俊峰，冯涛

2

（遵义医学院珠海校区1病理学与病理生理学教研室，计算机教研室，珠海519041；

3

枣庄科技职业学院医学技术系，滕州277500）

目的：探讨葡萄籽原花青素（GSP）对肾血管性高血压（RH）大鼠血管重塑的影响。方法：采用两肾一夹法建立RH大

并设立假手术组。术后2周，选取鼠尾动脉收缩压升至130mmHg以上的大鼠28只为RH大鼠，随机分为4组：高血压模型鼠模型，

GSP低剂量治疗组（50mg/kg）；GSP高剂量治疗组（200mg/kg）和卡托普利阳性对照治疗组（30mg/kg）。治疗6周后，组，分别测定各组大鼠尾动脉收缩压，苏木精-伊红染色法染色并观察胸主动脉形态，测量中膜平滑肌层数，中膜厚度（MT），管腔内径（LD）及

摘要

*2008］2317）；贵州省高层次人才科研条件特基金项目：珠海市科技局资助项目（No．PC20071045）；贵州省科技厅资助项目（No．黔科合J字［

＊＊

2008年58号）助经费资助项目（No．TZJF-通讯作者