凝胶电泳常见问题分析

凝胶电泳常见问题分析

请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED 还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解决？

参考见解：过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED 通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。胶聚合时间长可能是TEMED 失效了，过硫酸铵固体时间过久也会失效的。

一个让PAGE 胶很快聚合的方法：

不 要先配AP （过硫酸铵）溶液，因为AP 很容易变质。在保证TEMED 和AP 质量的情况下，每次配胶时，直接称一定量的AP 粉剂溶入液体状态的PAGE 中， 这样可以保证AP 的催化能力，而且可以多加一点。配25ml 的PAGE 胶，加0.03克AP 粉剂，最后加入25ulTEMED ，20分钟左右就可以凝固 （当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的PAGE 在孔里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置）。

DNA 电泳的MARKER 怎么是扭曲的？

参考见解：

1、 配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的. 最好是同时配制. 电泳时缓冲液高过液面1－2mm 即可。

2、 电泳时电压过高, 可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后比较漂亮了. 然后再调电压。

3、 上样时尽量慢慢加样, 等样品自然沉降后再加电压。

跑出的DNA 带模糊？

参考见解：

1、 DNA降解：避免核酸酶污染。

2、 电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH 值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。

3、 所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA 链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。

4、 DNA上样量过多：减少凝胶中DNA 上样量。

5、 DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。

6、 有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。

7、 DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA 。

有不规则DNA 带迁移?

参考见解：

1、 对于λ/Hind III片段cos 位点复性：电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。

2、 电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓

冲液。

3、 DNA变性：以20mM NaCl Buffer稀释DNA ，电泳前勿加热。

跑出的DNA 条带带弱或无DNA 带？

参考见解：

1、 DNA的上样量不够：增加DNA 的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。

2、 DNA降解：避免DNA 的核酸酶污染。

3、 DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。

4、 对于EB 染色的DNA ，所用光源不合适?? 应用短波长（254nm ）的紫外光源。

跑出的DNA 带缺失不完整是怎么回事?

参考见解：?

1、 小DNA 带走出凝胶?? 缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。

2、 分子大小相近的DNA 带不易分辨?? 增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。

3、 DNA 变性：电泳前请勿高温加热DNA 链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA 。 DNA 链巨大，常规凝胶电泳不合适?? 在脉冲凝胶电泳上分析。

做PCR 电泳后跑电泳，目的基因是489BP 的，结果每次切胶回收后再跑电泳就变成500多了，快到600了？为什么？

参 考见解：有时只靠电泳结果判断是不准确的，同样的片段每次跑的远近会有不同。有经验显示目的片段是1300多，结果就跑到1000的marker 下面去 了，后来证实片段没有问题。也有做的一个片段也是这样，是490BP. 理论上两个条带一样，可是PCR 结果显示就是大小不一致。然后回收以后的检测结果又 全部都一样了，后来又拿去做了下一个测序，才知道根本没有问题。

跑完PCR ，暂时不方便胶回收，条带已经切下来放到ep 管里了，这个能保存么？会不会有不良影响？

参考见解：还有个问题，pcr 的产物可以不可以直接拿来做模板再进行pcr 。我试过，可是总是出现一个拖尾亮条，没有带，是什么原因呢？

割下来的胶放在-20保存两个星期完全没有问题。切下来的胶放在4度冰箱中4、5小时没有问题回收的效果也很好。

凝胶回收DNA 实验的关键在哪里?

参 考见解：最关键的是切胶之后, 溶胶的那一步. 切胶的时候要尽量把多余的琼脂糖凝胶切干净, 按照实验步骤, 第一步应该是将胶充分的溶化. 这以后步一定要做充 分, 保证凝胶已经完全溶解了. 加乙醇这步也很关键，当凝胶溶解后最好多过几次柱子。还有就是洗脱的那一步。洗脱的时候最好用加热到60度 的洗脱液洗脱，如果实在效果不好可以分两次洗脱。

切胶的时候如何能切的准呢？条带的位置肉眼很难判断出来，如何判断条带的位置呢？

参 考见解：可以将产物与Marker 一起电泳，染色后，在紫外灯下观察结果，跟Marker 进行相比，就知道要的是哪条带。注意，紫外灯下切胶速度要快，否 则

DNA 会降解，另外，紫外线对身体伤害很大，特别是眼睛，请注意采取保护措施（比如在专门的箱子里切，带眼镜等）。|||RNA 用具要用10%的NaOH 浸泡过液，再用DEPC 水冲洗干净 70%的乙醇用过 国产分析乙醇有杂质，

RNA 酶还会有，并带入其它污染|||多谢楼主, 非常好的内容, 与其它几个帖子配合得太好了!