甲胎蛋白异质体

甲胎蛋白异质体

甲胎蛋白异质体（Variants of AFP or molecular heterogenetic of AFP ）是一种单链糖蛋白，含糖量约为4％左右。不同组织细胞合成的AFP ，其糖链结构有所不同，对植物凝集素的结合能力也不相同，此种糖链结构不同的AFP 称为AFP 的亚型或变异体，也称为AFP 分子异质体。近年来对AFP 异质进行了电泳、糖链结构及与植物凝集素结合能力等方面进行了深入研究。有资料表明，AFP 异质体存在着分子大小和电荷量的差异。淀粉胶电泳将人肝癌血清AFP 分为4种亚型；用SDS 聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳发现AFP 可分为分子量72kD 和kD 两种成分；等电聚焦结合交叉免疫电泳可使胎儿AFP 分成10种等电点不同的异质体。这表明AFP 异质体存在着电泳不无一性，这与其一级结构差异有关。其C －末端结构基本相同，N 末端至少有3种不同结构，这能否产生AFP 电泳异质性有待于证实。AFP 结构中的糖链主要由甘露糖、半乳糖、N －乙酰葡萄糖和唾液酸，并以寡糖单位的形式组成。AFP 异质体糖链结构的差异主要表现在分支结构的不同，刀豆素A （ConA ）结合型和非结合型AFP 异质体的糖链结构模型差异表现在一个分支中有无－GLcNAc-Gal-NeuNAc 结构。对人肝癌AFP 糖链结构电泳研究发现，其寡糖分为中性（N ）、酸性（A 1，A 2）三种成分。进一步研究证实N 两分支末端均由半乳糖组成，A 1两分支末端分别为半乳糖和N －乙酰神经氨酸，A 2则均为N －乙酰神经氨酸。卵黄囊肿瘤的AFP 其ConA 亲和性组占50％左右，肝癌腹水中与LCA 结合的AFP 糖链中具有与Asn 连接的N －乙酰基葡萄糖胺残基，而在非结合型异质体的糖链中无此成分。

根据AFP 与外源性凝集素（Lectin ）结合能力的差异，可分为不同的变异体。采用扁豆凝集素（LCA ）／刀豆素A 亲和电泳或层析技术能将AFP 分为LCA ／ConA 非结合型AFP （AFP －N －L ／AFP －N －C ）和LCA ／ConA 结合型AFP （AFP －R －L ／AFP －R －C ）两种。新的Lectin 的应用，使AFP 在糖链结构上异质体达9种之多。AFP 异质体的命名方法为：从阴极开始在LCA 亲和电泳上AFP 的条带依次为L 1、L 2、L 3；在E －PHA 亲和电泳上AFP 的条带依次为P 1、P 2、P 3、P 4、P 5；用ConA 时按AFPC 1、C 2命名；alloA 时按AFPA 1、A 2、A 3命名。AFPL 2、L 3完全不能分离，存在中间成分时按AFPL 2、L 3命名，AFPP 4、P 5分离不充分时命名为AFP －P 4＋AFP －P 5。因此，AFP 对不同的Lectin 反应所表现的异质体不同，故可用于疾病的鉴别诊断。

AFP 异质体亲和交叉免疫电泳检测法

【原理】

根据AFP 对刀豆素（ConA ）或小扁豆凝集素（LCA ）结合能力的不同，可区别原发性肝细胞癌与非原发性肝癌引起的AFP 升高，提高AFP 对肝癌的诊断价值。此法原理是将检样于含LCA 的琼脂糖凝胶中电泳，与LCA 结合型AFP 在电泳时被阻留，而非结合型AFP 则向阳极侧泳动。然后，与首次电泳的方向垂直，在含抗AFP 的琼脂糖胶中作第二次电泳。此时被首次电泳分离的AFP 异质体，将分别于含抗AFP 的凝胶板中形成沉淀峰, 根据峰的大小即可了解结合型或非结合型AFP 所占的比例。

【试剂】

1. 小扁豆凝集素（LCA ）。

2．抗AFP 血清：同ELISA 法。

3．10.0g/L琼脂糖：琼脂糖1.0g 加0.25mol/L pH8.6巴比妥缓冲液100ml ，沸水浴中使溶，加入NaN 3使达1.0g/L，按需要量分装后密塞，4℃保存。

4．125I －AFP 。

【操作】

1．将10.0g/L琼脂糖融化后，在6cm×12cm洁净玻板之一侧浇注2cm×12cm（厚1.6cm ）凝胶条（约需3.84ml 凝胶液），凝固后于距内缘2～3mm 处切割一0.5cm×10cm的槽。

2．用巴比妥缓冲液将LCA 稀释成2mg/ml（－20℃可保存1个月），取80μl加入冷至56℃的已融化琼脂糖凝胶1ml 中，混匀后浇注于上述槽中。待凝固后，于此胶条上距阴极端0.5cm 处打一直径0.2～0.3cm 的孔，距此孔4.5cm 处打第二个孔（第二份检样）。

3．两孔内各加一份待测血清，加样量5～10μl。以1.0g/L溴酚蓝为指示剂，10V ／cm 稳压电泳，至白蛋白泳出4cm 时关闭电源。

4．将抗AFP 血清按效价与融化并冷至56℃的琼脂糖胶液混合（琼脂糖最终浓度为9.0g/L，抗AFP 达最适浓度），并浇注玻板的其余部分（4cm×12cm），约需含抗血清胶液7.68ml ，使凝固。

5．于LCA 胶条下1.5mm 处空白凝胶内切割一0.2cm×10cm的细槽，槽内注入混有1.0g/L

溴酚蓝5μl的125I －AFP 20μl（约6万～7万cpm ）。如混入0.35ml 融化的10.0g/L琼脂糖胶液中浇注更好。10V ／cm 稳压电泳，电泳方向与第一次电泳垂直。至白蛋白泳出4cm 时终止。

6．电泳结束后，用滤纸覆盖于凝胶板表面，置37℃干燥后，于暗室覆盖X 光底片，室温曝光48h ，显影，定影后观察。

【结果判断】

将X 光胶片置坐标纸上，以峰两侧水平线作基线，峰形下总面积（小格数）为100％，各所占面积（小格数）与总面积的百分比即AFP 异质体的百分比。

AFP 异质体亲和电泳免疫印迹法

【原理】

将含AFP 的待检血清置于含LCA 的琼脂糖凝胶中电泳。LCA 结合型AFP 泳动速度慢，而CA 非结合型AFP 泳动速度快，形成前后2条区带。用吸附有抗人AFP 抗体的硝酸纤维素（NC ）膜进行免疫印迹，再依次与酶标记抗人AFP 抗体和酶底物反应则显色。NC 膜上可呈现2条着色区带，透明后用光密度计扫描，得出结合型与非结合型AFP 所占百分比。

【试剂】

1．小扁豆凝集素（LCA ）。

2．马抗人AFP 抗体。

3．兔抗人AFP －HRP 。

4．结合马抗人AFP 抗体的硝酸纤维素膜（简称马抗人AFP －NC 膜）；将NC 膜剪裁成与凝胶板相同大小，浸于最适稀释浓度的马抗人AFP 抗体溶液中，5min 后取出，电吹风吹干，4℃保存，4周内稳定。

5．洗涤液：150mmol/L NaCl溶液，含0.05% Tween-20。

【操作】

1．用25mmol/L Tris-巴比妥缓冲液（pH 8.6）配制10g/L琼脂糖凝胶（内含2.0g/L LCA），浇注玻板。凝胶厚度为1.0mm ，长8cm ，宽度视标本数而定，一般为1cm 宽／每份标本。在负极侧0.5cm 处，切一条7mm 长、1mm 宽的加样槽，槽内加待检血清4μl。电压15V ／cm ，电泳45min 。电泳毕，取下琼脂糖凝胶板。

2．将马抗人AFP －NC 膜先用蒸馏水浸湿，仔细地覆盖于琼脂凝胶板上，再在NC 膜上加数层滤纸，上面置10g/cm2的重物。约经30min ，凝胶板上AFP 电泳区带即转印至NC 膜上。

3．将免疫印迹的NC 膜浸入用20g/L牛白蛋白溶液最佳稀释的兔抗人AFP －HRP 溶液中，37℃，经1h 后取出。NC 膜用洗涤液洗3次。最后将NC 膜浸入酶底物溶液（DAB ＋H 2O 2）中，待显现出二条棕黄色区带后，用蒸馏水冲洗数次，终止反应。

4．在阴极侧的区带为LCA 结合型AFP ；阳极侧的区带为LCA 非结合型AFP ，NC 膜在空气中干燥后，用十氢萘透明，用光密度计在波长490nm 扫描，打印出二条区带的百分数。

【参考值】

阴性

【临床意义】

1．AFP 是一种糖蛋白，其寡糖链有多样性，AFPV 与植物血凝素中的小扁豆以集素（Lens culinaris agglutinin, LCA）亲和力不同，而分为LCA 亲和的（LCA －R ）和与LCA 非亲和（LCA －N ）的两部分，原发性肝癌的AFP 糖链中存有异质体。

2．AFPV 检测能鉴别良恶性肝病，如LCR －R ≥25％者多数（80％以上）为原发性肝癌。LCA －N 高者为良性肝病，如急慢性肝炎，肝硬化等。

3．对病程预后的判断：如肝癌切除后，AFPV 随AFP 转阴而消失，若AFP 未转正常，但甲胎异质体含量明显下降的患者复发的危险性少，而AFP 含量下降，AFPV 含量相对恒定者，则术后容易复发。