_互补与蓝白斑筛选机制的探究

生物技术通报

#研究报告#

BIOTECHNOLOGY BULLETIN

2010年第8期

A-互补与蓝白斑筛选机制的探究

周玉亭 曹建斌

(运城学院生命科学系,运城044000)

摘 要: 针对高校生物科学实验教学中存在的问题,着重探究了基因重组试验中的A-互补与蓝白斑筛选机制,精心设计了5组试验,结果指出,经双酶切的质粒载体自身不能环化,也不能成功转化;蓝白斑筛选中的蓝斑通常来源于商品载体中的环状质粒或者线性载体自连后的转化产物;重组子一般为白斑,但在一定条件下,白斑也会变成蓝斑。在此基础上作了进一步的讨论,为今后的教学实践和科学研究提供借鉴和指导。

关键词: A-互补 蓝白斑筛选 重组子

TheResearchintoMechanismofA-complementation

andBlue-whiteScreening

ZhouYuting

CaoJianbin

(YunchengCollege,DepartmentofLifeScience,Yuncheng044000)

mentsincollegeteaching,theresearchexploredthemechanismofA-comple- Abstrac:t Basedonthequestionsofbiologicalexperi

mentationandblue-whitescreeningandpreciselydesigned5experiments.Theresultsshowedthatplasmidvectorcouldnotformloopi-tselfortransformsuccessfully.Thebluepatchcanbecommonlyfromcircularplasmidortransformationproductsofsel-fligation.There-combinantsusuallydisplaywhitepatches,butthewhitepatchescanbecomeblueunderspecificconditions.Theresultsprovideddirec-tionsforfutureresearchandteachingpractice.

Keywords: A-complementation Blue-whitescreening Recombinant

基因工程(geneengineering)是20世纪70年代以后兴起的一门新技术,即用人工的方法,把遗传物质DNA分离出来,在体外进行基因切割、连接、重

组,然后再转移到生物体内并进行表达的技术。基因工程中的关键一步是将目的基因与DNA载体连接成重组DNA,获得重组子,并把重组子筛选出来。近年来,建立了许多方法来筛选重组子,其中较为常用的是利用A-互补原理,根据菌落的蓝白颜色进行

[1]

筛选。

A-互补是指E.coliB-半乳糖苷酶的两个无活性片段(N端片段和C端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。现在使用的许多质粒载体都带有一个E.coliDNA的短片段,其中含有B-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。在

收稿日期:2010-03-22

基金项目:运城学院2009年度院级基础研究项目(JC-2009020)作者简介:周玉亭,男,副教授,研究方向:植物学;E-mai:[email protected],男,,mai:lcaoanbin2006com

这个编码区中插入了一个多克隆位点,可在此处插入外源DNA片段。这种类型的载体适用于可编码B-半乳糖苷酶C端部分的宿主细胞。尽管宿主

和载体编码的两个片段都没有活性,但他们能够融合为具有酶活性的蛋白质,在含有底物X-gal的培养基中形成蓝色菌落。当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后,导致N端片段丧失A-互补能力,因此,带有重组质粒的宿主细胞将形成白色菌落。

基因重组与蓝白斑筛选是现代基因工程的关键技术之一,因此也是目前我国高校生命科学专业开设的基础实验之一。笔者在教学实践中,针对基因重组这一实验分别参考了魏群主编的5分子生物学

[2,3]

实验指导6第1版和第2版,结果却显著不同:

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按第一版的方案,将目的基因和载体用单一酶切后,简单地沉淀回收,连接转化,在LB平板上长出了蓝、白斑,取得了预期的结果;而按照第2版方案,将

目的基因和载体用双酶切,产物经电泳分离、切胶回收,再连接、转化,结果在LB平板上只长出了白斑,而不能长出如教材中所预期的蓝斑。由此,笔者认为,有必要对蓝白斑筛选的机制问题进行一次探讨,诸如:在转化与蓝白斑筛选操作中,线性的载体能否够成功转化,形成蓝斑的载体从哪里来,重组载体转化后是否一定会形成白斑,为何有些白斑会变蓝,重组转化只有白斑出现是否属于正常现象,为了回答这些问题,设计了本试验。

1.5 含目的基因PODa的重组质粒的酶切、连接、

转化

将重组质粒(PODa片段+pGEMVector)采用SpeI和NcoI双酶切后,经琼脂糖凝胶电泳分离并分别回收,获得PODa基因片段和线性质粒。再将二者用T4DNA连接酶重新连接、转化后,筛选重组子,方法同1.2。1.6 线性质粒的转化

将1.5中双酶切后获得的线性质粒转化E.coliTOP10菌株,方法同1.2。

2 结果与分析

2.1 目的基因PODa与载体pGEM-TVector的重组

转化

基因PODa与载体pGEM-TVector重组后,在LB平板上筛选重组子。结果显示,在平板上长出两种颜色的菌落。重组质粒转化子为白斑,而未重组质粒转化子为蓝斑。2.2 载体pGEM-TVector的转化

将商品载体pGEM-TVector转化E.coliTOP10菌株,结果显示,只在LB平板上长出少数几个蓝色的菌落。说明商品载体pGEM-TVector中存在着非线性的环化载体。在T4DNA连接酶作用后,蓝斑显著增多,说明部分载体发生自连环化。

2.3 重组质粒的转化

重组质粒(PODa片段+pGEMVector)的转化效率要比连接产物的转化效率高,涂板16h后,E.coliTOP10菌落出现白斑,几乎长满了整个平板,继续培养至40h,菌落中有些白斑变为蓝斑,说明培养基中有少量的X-gal被降解。

2.4 含目的基因PODa的重组质粒的酶切、连接、

转化

重组质粒经SpeI和NcoI双酶切后,获得PODa基因片段和线性质粒(图1)。将二者对应的条带进行切胶、回收、纯化,再连接、转化后培养,在LB平板上长出白色的菌落,但无蓝色菌落出现。

2.5 线性质粒的转化

将1.5中双酶切后获得的线性质粒转化E.coliTOP10菌株,在LB平板上没有长出任何菌落,说明1 材料与方法

1.1 试剂、质粒及菌株

DNA聚合酶、限制性内切酶SpeI和NcoI、T4

DNA连接酶等来源于大连宝生物TaKaRa公司,核酸分子量标准为TIANGEN公司产品,琼脂糖为上海Sangon公司产品;LB培养基、氨苄青霉素、IPTG、X-gal为北京鼎国公司产品;其余试剂均为国产分析纯。克隆载体pGEM-TVector为Promega公司产品;受体菌E.coliTOP10为TIANGEN公司产品。杜仲过氧化物酶Eucommiaulmoidesperoxidasea基因(PODa,AY714072)片段(3c端,长度为630bp的一段序列,下同)。重组质粒(PODa片段+pGEMVector)。1.2 PODa片段、pGEM-TVector的重组与转化

利用PCR技术,将目的基因PODa从重组质粒(PODa片段+pGEMVector)中扩增出来,经琼脂糖凝胶电泳分离并切胶回收后,T4DNA连接酶,于16e温度下与载体pGEM-TVector连接过夜。然后将连接产物转化E.coliTOP10菌株,在含有IPTG和X-gal的LB平板上筛选重组子。

1.3 空载体pGEM-TVector的转化

将商品载体pGEM-TVector转化E.coliTOP10菌株;pGEM-TVector用T4DNA连接酶作用后,转化E.coliTOP10菌株,方法同112。1.4 重组质粒的转化

将重组质粒(PODa片段+pGEMVector)直接转化E.coliTOP10菌株,然后筛选重组子,方法同1.[1]

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3 讨论

在基因工程技术中,将外源基因DNA插入到质粒载体上,构建重组质粒时,外源DNA片段与质粒载体的连接以及转化过程都存在一定的效率,因此最后生长出来的菌落并不是都带有目的基因的。这就需要采用特殊的方法筛选出可能含有目的基因的重组体克隆。

本试验通过5种方案来研究质粒的转化过程及

M.DNAMaker;1,2.重组质粒;3.重组质粒双酶切后线性载体与目的基因分离

A-互补与蓝白筛选机制。试验结果证明:

图1 重组质粒的双酶切结果

表1 转化试验结果汇总

序列 1 2

转化用DNA

PODa片段、pGEM-TVectorpGEM-TVectorpGEM-TVector

3 4 5

重组质粒

PODa片段、pGEM VectorpGEM Vector

来源说明PODa为PCR产物Promega公司Promega公司

从阳性克隆中提取并电泳纯化分别经SpeI、NcoI双酶切并电泳纯化

经SpeI、NcoI双酶切并电泳纯化

T4连接酶连接 转化结果

T4 T4 无 无 T4 无

蓝斑+白斑蓝斑蓝斑白斑白斑无

补充说明

常规PCR产物克隆线性载体自连

可能存在少许环状质粒阳性对照DNA重组

载体无法自连,转化失败

(1)线性质粒载体转化不成功。经双酶切的质粒载体自身不能环化,也不能成功转化。在大肠杆菌中尚未发现线性质粒的存在,酶切后的线性质粒载体如果进入大肠杆菌后有可能遇到自身复制上的障碍,或者被宿主细胞中的酶所降解,因而其转化菌在筛选培养基上不能长成菌落。

(2)蓝斑是环状质粒转化子形成的。pGEM-TVector载体是在pGEM载体的基础上改造而成,两个3c端都有突出T,很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3c端加上一个突出的碱基A,刚好能与pGEM-TVector3c端的T互补连接,可以提高PCR产物的连接和克隆效率。进行转化后,在含有IPTG、X-gal的平板上培养时,可以通过蓝白筛选,判断载体中有无DNA片段的插入。理论上讲,末端带有T碱基的载体是无法自我连接成环状的,而试验又证明线性质粒又不能成功,,此,可能的接近合理的解释是商品pGEM-TVector载体中存在少量环状质粒和平末端的线性载体(末端无突出的T碱基,在T4连接酶作用下少数可以自连成环状);在参考魏群的方法

[2,3]

进行基因重组

时,单酶切方案中有蓝斑出现,是由于载体自连;而双酶切方案中,只有白斑而不能长出蓝斑的原因是:双酶切后的载体无法自连,非重组的线性载体又不能转化。

(3)一般转化后的重组子会形成白斑,有些情况下这些白斑会逐渐转变成蓝斑。白斑是由于外源DNA插入LacZ基因中,造成A-互补失败,以至于不能降解生色底物X-ga;l对于时间长了白斑会变成蓝斑的现象,这里给出一个合理的解释:DNA插入后,LacZ会表达并合成出融合蛋白,在一定条件下(如插入DNA序列不长,且不改变LacZ的读码框),融合蛋白还有着较低的酶活性,经过较长,降解

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来。在试验中,有些白色菌落并不一定是真正的重组子,因为载体自身的缺失或非目的基因的插入,都有可能使转化的细胞获得相同的特征,所以,重组质粒转化宿主细胞后,对转化菌落必须进

一步筛选和鉴定。

参考文献

[1]SambrookJ,RussellDW.分子克隆实验指南[M].北京:科学出

版社,2002.

[2]魏群.分子生物学实验指导[M].北京:高等教育出版社,

1999:12.

[3]魏群.分子生物学实验指导(第2版)[M].北京:高等教育出版

社,2007:11.

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