副溶血弧菌免疫磁珠检验标准方法

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B66

DB32/T食品中副溶血性弧菌K 抗原、H 抗原免疫

磁珠富集增菌检验方法

连云港市产品质量监督检验所 发布

DB32/T -2010 前 言

本标准适用于食品中嗜盐性海洋弧菌---副溶血性弧菌的检验和鉴定。

本标准编制按GB/T 1《标准化工作导则》和GB/T 20001《标准编写规则》进行。

本标准由连云港市产品质量监督检验所提出。

本标准由连云港市产品质量监督检验所负责起草。

本标准主要起草人：

本标准于2008年 月首次发布。

食品中副溶血性弧菌K 抗原、H 抗原免疫磁珠富集增菌检验方法

1 范围

本标准规定了食品中嗜盐性副溶血性弧菌的免疫磁珠富集检验。

本标准适用于海洋水产品和淡水水产品及加工的含盐其它食品。

本标准检出限为 20CFU/g

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的

修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究

是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T

20001.4-2001 标准编写规定

实验原理

利用免疫学原理，采用副溶血性弧菌K 抗血清或H 抗血清（H 抗血清对海洋弧菌非特异

性结合）交联包被在磁珠表面制备成免疫磁珠，当免疫磁珠遇到菌体抗原产生结合，抗原

抗体结合完成后再施加外来磁场，使得免疫磁珠贴与试管壁不被洗脱。然后将磁场消除，

磁珠自然落入试管底部，采用非金属接种环或采用加样器将结合菌体的免疫磁珠接种到选

择性增菌液中增菌或划线与选择性平板分离培养。

3 设备与材料

3.1 低温冷冻高速离心机。

3.2 电动试管振荡器。

3.3 精密恒温水浴箱。

3.4 永磁架

3.5 天平（0.1g ）

3.6 拍打式均质器

3.7 冰箱

3.8 全支消毒自动加液器（带滤头）

3.9 非金属接种环

4 试剂及培养基

4.1 Dynabeads M-280 磁珠（日本DYNAL 社产）或其他牌号的磁珠

4.2 副溶血性弧菌K 抗血清

4.3 副溶血性弧菌H 抗血清

4.4 羊抗兔Ig (G)

4.5 LS弧菌选择性显色琼脂 见附录A

4.6 35g/L氯化钠碱性DMEM 多粘菌素链霉菌增菌液 见附录A

4.7 EDC solution 液：500mg EDC in 1ml MES buffer. Use the solution in 2min

4.8 NHS solution 液：250mg NHS in 1ml MES buffer. Use the solution in 2min

注：EDC 与 NHS 必须现用现配。

4.9 保存液：硼酸缓冲体系，0.005M 硼酸，pH9.0，0.05w/w %Tween20，0.02w/v%NaN3，

0.1w/v%BSA

4.10 BST溶液：硼酸缓冲体系，0.005M 硼酸，0.05 w/w%Tween20

4.11 MEST洗液：10mM MES，pH5.0，0.05 w/w% Tween 20

实 验 流 程

5免疫磁珠的交联制备：

5.1 将2mg 磁珠加入2mL Eppendorf管中

5.2 向管中加入500uL MEST（10mM MES，pH5.0，0.05 w/w%Tween 20）对磁粒子进行洗

涤3次（结合磁分离操作）。

5.3 加入EDC 与NHS 各2.5mg ，调整最后反应体积为500uL ，旋转器上旋转，37℃恒温，

0.5小时。

5.4 活化后，用上述的MEST 洗涤除去未反应的活化剂，再换管（去除管壁上可能吸附的

活化剂），再洗涤2遍。

5.5 再用BST 液洗涤两遍后，再分散到BST 中。

5.6 向每管中加入抗血清300 uL ，调整最后反应体积为500uL ，进行偶联，4℃，20小时。

5.7 用BST 液洗涤四次（第一次需换管，一定要洗涤干净，每次洗涤时要将磁珠重悬吹

散）。

5.8 500μL 保存液重悬偶联好抗体的磁珠。

5.9 采用DYNAL 社产 Dynabeads M-280 磁珠时用下列方法处理：

5.9.1取羊抗兔 Ig (G)0.5ml，加1ml(PBS-Tween) 液混匀。

5.9.1离心4000rpm/min，2min, 弃去上清液（PBS-Tween ）。

5.9.3加PBS-Tween 液1ml 使磁珠重新分散悬浮其中。

5.9.4加副溶血性弧菌K 免疫血清1ml ,4℃垂直于水平面、轻缓旋转振荡18h 。

5.9.5上磁，吸取液体并弃去。

5.9.6消磁，用1ml 洗液清洗，重复5.9.5步骤。

5.9.7将洗净5次后的免疫磁珠放4℃冰箱备用。

6 样品制备

6.1 冷冻样品应在45℃以下不超过15min 或在2～5℃不超过18 h解冻。若不能及时检

验, 应放于—15℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验, 若不能及时

检验, 应置于6～10℃冰箱保存, 在24 h内检验。

6.2 取样:以无菌操作进行。

6.2.1 鱼类:取鱼体不同部位。

6.2.2贝类:取内脏或含内脏的全部贝肉；如为带壳贝类, 则应先在清洁的流水中洗刷净外

壳, 然后以无菌操作打开贝壳, 取出内脏或含内脏的全部贝肉和贝液。

6.2.3甲壳类:取包括鳃及肠的部分或整体。

6.3 以无菌操作称取50 g检样放于均质袋中, 以灭菌剪刀充分剪碎。

5.4 加0.45%氯化钠稀释水150mL, 拍打均质15min, 如无均质器, 则应以剪刀尽量剪碎, 并

充分振荡。

6.5 吸取5ml 样液加入选择性增菌液中37℃培养8h 。

7实 验

7.1 将1ml 增菌液加到含有50ul 免疫磁珠小管中，室温垂直轻缓旋转振荡20min 。

7.2 上磁架，用磁场架固定磁珠吸取样液弃去。

7.3 加1ml 洗液复混后同前操作。

7.4 清洗4~5次后，加100ul PBS-Tween液使免疫磁珠和目标混匀备用。

7.5 用塑料接种环划线接种到LS 显色培养基或增菌液中培养36℃24h 。

7.6 直接样品吸附富集法：

7.6.1 吸取样品均质液5ml, 放入含有2mg 免疫磁珠试管中，室温垂直轻缓旋转振荡20min 。

7.6.2上磁架，用磁场架固定磁珠吸取样液弃去。

7.6.3加1ml 洗液复混后同前操作，用洗液清洗悬浮磁珠3次。

7.6.4用0.45%氯化钠溶液1.0ml 悬浮磁珠备检。

8 增菌培养和分离

8.1 将免疫磁珠备检液吸取0.5ml 接种到3.5%氯化钠DMEM 多粘菌素链霉菌增菌液中, 于

37℃进行选择性适时增菌培养。

8.2 将免疫磁珠备检液用非金属接种环划线与LS 选择性显色培养基或等效的弧菌选择性

培养基上37℃培养18～24 h。

6.5 副溶血性弧菌在LS 平板上的典型菌落呈圆形, 边缘整齐、湿润、粉红色带晕菌落, 直

径2～4mm 。TCBS 为绿色圆形中心突起菌落，菌落表面湿润，直径2～4mm 。在梅里埃显色培养基上为粉红色菌落，菌落呈圆形, 边缘整齐、湿润，直径2～4mm 。在科玛嘉

显色培养基上为紫红色菌落，菌落呈圆形, 边缘整齐、湿润，直径2～4mm 。

附录A

培养基及试剂

A.1 LS 培养基

A.1.1成份

硫代硫酸钠8.5g

枸橼酸钠8.0g

十二烷基硫酸钠0.2g

胆酸盐5.0g

蛋白胨5.0g

酵母膏1.0g

磷酸铁0.01g

EDTA0.2g

0.5％阿拉伯糖

0.25％葡萄糖醛酸盐

0.1％硫酸铵

0.1％霉菌浸膏

甜菜碱0.125%

丙酮酸钠0.125%

亚碲酸钾0.1%

超氧化物歧化酶0.125%

DMEM 液体25%

TWEEN-801ml

胆酸钠0.5%

多粘菌素B100IU ／ml

青霉素4000单位

林可霉素0.15g

生物素0.1g

N 甲基伞酮0.1%

Cacl 2 0.2%

硝基唑兰 0.01%

头孢硝噻吩0.01%

琼脂1.7%

用纯水定容到1000ml

PH7.6

A1.2将除抗生素、硝基唑兰、头孢硝噻吩、超氧化物歧化酶、生物素、DMEM （细胞培

养基成品）外的组分溶入950ml 水中, 微热溶解后115℃灭菌15min ，当温度降到

50℃时加入过滤灭菌的抗生素、硝基唑兰、头孢硝噻吩、超氧化物歧化酶、生物

素、DMEM 液50ml, 趁热铺平板。平板冷却凝固后4℃备用。

A2 35g/L氯化钠碱性DMEM 多粘菌素链霉菌增菌液

A2.1成份

蛋白胨5.0g

酵母膏1.0g

磷酸铁0.01g

EDTA0.2g

0.5％阿拉伯糖

0.25％葡萄糖醛酸盐

0.1％硫酸铵

0.1％霉菌浸膏

甜菜碱0.125%

丙酮酸钠0.125%

亚碲酸钾0.1%

超氧化物歧化酶0.125%

DMEM 液体25%

TWEEN-80 1ml

胆酸钠0.5%

多粘菌素B100IU ／ml

青霉素4000单位

林可霉素0.15g

生物素0.1g

陈海水调到1000ml

PH7.6-7.8

A2.2将除抗生素、DMEM 、超氧化物歧化酶、生物素以外的组份配制溶解到950ml 陈海水中

高压115℃灭菌15min ，当温度降到50℃加入过滤除菌的抗生素、DMEM 、超氧化物歧化酶、生物素混合溶液50ml, 摇匀分装到30ml 细胞瓶中室温备用。