纸层析法分离氨基酸实验报告

前言

纸层析法 纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离（Rf值）与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量（如光度法、比色法等）。

纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。

在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。在

做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液（石油醚）混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。

纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢；含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法 能清楚地将叶绿体中的色素分离。

图1 叶绿素的分离

氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起，氨基酸的应用在食品工业占61％，在饮料工业占30％，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。

氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用：

(1)在食品行业的应用

(2)在医药工业的应用

(3)在饲料添加剂行业的应用

(4)在化妆品行业的应用

(5)在农业上的应用

(6)在其他行业的应用

氨基酸工业还有着广阔的发展前景：

(1)传统的氨基酸生产方法

(2)运用基因工程手段生产氨基酸

(3)大力发展药用中间体,具体为：

①氨基酸及其衍生物逐渐成为药用中间体

②非天然氨基酸是合成活性药物的重要原料

③生产高附加值的非天然氨基酸

一、实验目的

(1)掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术（包括点样、平衡、展层、显色）。

(2)学习未知样品的氨基酸成分（水解、层析及鉴定）分析的方法。

二、实验原理

(1)纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流过固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。

(2)溶质在滤纸上的移动速度用比移值Rf值表示。

(3)Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。

(4)在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。材料与方法

三、实验装置与试剂

(1)氨基酸标准液(1mg/ml)

亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。

(2)80%甲醇

(3)0.1%茚三酮丙酮溶液

(4)氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL)

(5)正丁醇

实验仪器

(1)新华滤纸×1

(2)培养皿×1

(3)电热鼓风干燥箱×1

(4)吹风机×1

(5)毛细管×4

（6）针、线、尺×1

（7）钟罩(高约430mm,直径约290mm，具磨口塞)×1

实验操作

(1)滤纸

选用国产新华 1号滤纸， 6cm×7cm。在距滤纸2cm处划线，用

铅笔在线上标上四个点作为点样位子（留出缝线空间）。

（2）点样

点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清。用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.5cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用吹风机吹干，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，影响定量结果。 将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。

(3)展层

将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内 (注意滤纸不要碰皿壁)，当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置。

酸溶剂系统：

正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，茚三酮2ml。温度25℃，时间1h。

注意：使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。

（4）显色

待展层基本结束后, 置65℃鼓风箱中10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。

（5）Rf值的计算

用尺测量显色斑点的中心与原点(点样中心)之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出此值，即得氨基酸的Rf值。

四、实验数据记录及处理

1、实验数据

图2 实验结果

原点到层析斑点中心

35mm

的距离

原点到溶剂前沿的

75mm

距离

O.280mm0.467

Rf 0.467mm 0.270mm 0.747mm

mm 0.760mm

甘氨酸，脯氨

判断待测氨基酸 脯氨酸 甘氨酸 亮氨酸 酸，亮氨酸 74mm 75mm 75mm 20mm 56mm 57mm 脯氨酸 甘氨酸 亮氨酸 待测氨基酸 21mm，35mm

表1 实验数据记录

五、讨论

1、注意事项

(1)使用茚三酮显色法，必须在整个层析操作中避免手直接接触层析纸，因为手上常常有少量含氮物质。显色时它也呈现紫色斑点。污染了层析结果，因此操作时应戴橡皮手套或指套。同时也要防止空气中的氨。

(2)点样斑点不能太大，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且点样后吹风温度不宜过高，以免样品变性(斑点发黄)。

(3)展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。

(4)展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果。

2.思考

(1)为什么在展层时有时用一种溶剂系统，而有时用两种溶剂系统? 这是根据Nernst在1891年提出的分配定律：一种溶质在两种给定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数，即分配系数(Kd)。

Kd=Ca/Cb

Ca和Cb是互不相溶的两相，即A相和B相的浓度。这里的两相可以使固相、液相和气相。意思就是溶质在A和B两种溶剂组成的混合溶剂里分配时，分配比是恒定的。

(2)酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对氨基酸极性基团的解离有何影响?

酸性溶液中，有利于氨基酸的碱式电离，氨基结合质子，整个分子带正电荷；反之，碱性溶液中有利于羧基的酸式电离，氨基酸分子整体带负电荷。

(3)酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对碱性氨基酸(赖、精、组)和 酸性氨基酸(天冬、谷)的Rf值有什么影响?

酸性溶剂系统对碱性氨基酸的溶解性加强，在层析过程中易溶于流动相。所以跑得比较快，因此Rf值增大。反之，碱性性溶剂系统中酸性氨基酸Rf值增大。

（4）什么是分配系数？

在平衡状态下，组分在固定相与流动相中的浓度之比。

六、参考文献

[1] 杨丽，尤丽，叶金秀，袁燕。纸层析分离鉴定氨基酸实验的改进 ,云南民族大学学报(自然科学版) ，2011

[2] 王琳，陈仲道，马玉玲。分离氨基酸层析液制备方法的改进，济宁医学院学报，2004

[3] 陈刚，马晓，杨玉珍。关于做好“纸层析法分离氨基酸”实验的总结，生物学通报，2012

[4] 韩生彧。一种改良纸层析分离氨基酸的方法，承德医学院学报