间接免疫荧光--甲醇固定法
06-14
间接免疫荧光——甲醇固定法
1、 弃培养基，用PBS 洗盖玻片。（一定要洗干净将死细胞除尽，否则影响观察采图）
2、 把盖玻片投入到-20度预冷的100%甲醇中，-20度冰箱10min （可以盛在用过的六孔板或60mm 的皿里，非常好用，建议用六孔板，空深不会溅出液体/面积小省试剂）
3、 用PBST （含0.1%Tween20）洗固定的盖玻片，5-10min/次*3次（Tween20起到透化的作用，以利于抗体进入细胞内与抗原结合）
4、 然后用10%NGS或BSA （PBST 配置）温育10-30min 。（此步后，玻片可暂存于4度的70%乙醇中，一星期后仍可获得理想的结果。封闭血清推荐用与二抗同种来源的血清，不可用与一抗同源的血清，以避免抗体交叉反应）
5、 弃blocking buffer，室温加一抗（用1%BSA的封闭液稀释）温育1h 或37度温育30min ；
6、 用含PBST 室温洗，5-10min/次*3次；
7、 二抗（用1%的封闭液稀释）室温温育至少30min ；注意避光；
8、 用PBST 室温洗，10min/次*3次
9、 DAPI 复染，50uL 室温静置5min
10、 细胞面朝下放在一滴10uL anti-fade 的载玻片上，用指甲油或Gelvetol （封片剂）等封片，显微观察。
Reference:
《分子克隆实验指南系列：细胞实验指南》科学出版社2001.2月第一版p1006-1007