环境污染物的蚕豆根尖微核试验

环境污染物的蚕豆根尖微核试验

实验内容

随着工农业生产的迅速发展，新的化学物质和工业“三废”不断地进入人们的生活环境，它们中有许多可能对遗传物质产生损害并造成致癌、致畸、致突变等遗传毒理效应的环境致突变物，可对人类健康和生存构成严重危害。微核试验(Themicro nucleu stest, MNT)是以动植物为材料，采用细胞生物学手段，观测其出现的微核率来表示材料受遗传损伤程度的一种检测遗传毒物的方法。微核是无着丝点的染色体断片，在有丝分裂后期不能向两极移动，所以游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，即可在它附近看到一到几个很小的圆形结构，直径大约是细胞直径的 1 ／ 20 － 1 ／ 5 ，这就是微核（ micronucleus ）。微核是常用的遗传毒理学指标之一，指示染色体或纺锤体的损伤。由于这种损伤会因细胞受到的外界诱变因子的作用而加剧，而微核产生的数量又可与诱变因子剂量的强弱呈正比，因此可以用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度。

蚕豆(Vicia faba)是一种理想的细胞遗传学研究材料。蚕豆的染色体大，数量少(2n=12),根尖中含有较多的分裂相细胞，非常适合显微观察，而且蚕豆根尖细胞周期中的大部分时间对诱变剂敏感，便于遗传毒性检测实验，因此，早在1959年，放射生物学家已经用蚕豆的根尖细胞来进行X射线的遗传损伤研究。到了上世纪70年代，蚕豆根尖染色体畸变技术已发展得相当成熟，作为一种检测化学品遗传学毒性的方法为人们所知并被广泛采用。蚕豆根尖微核试验在 1986 年已被中国环保局列为一种环境生物测试的规范方法，它作为一种环境变异的检测手段，在我国不少地区的环保部门和医疗卫生系统中都有广泛的应用。

蚕豆根尖微核试验在对水体污染物、空气污染物、农药、重金属、化妆品、工业化学品等的致突变性检测方面，都得到了较广泛的应用，在此仅以农药污染的蚕豆微核实验为例介绍其相应的实验方法与步骤，学生在具体开展相关环境污染物的蚕豆根尖微核试验时可参考使用。

（一）实验仪器、试剂和材料

A．实验材料：蚕豆种子

B. 实验器材

[1] 光学显微镜

[2] 试管(10ml)×2

[3] 蚕豆发芽盒

[4] 其它：镊子、手术刀、载玻片、盖玻片、滤纸等。

C. 试剂

[1] 环磷酰胺：用其与水可溶剂配置系列溶液：0%（对照），5%，10%，20%。

[2] 卡诺氏固定液：将乙醇和冰醋酸以3：1(V/V)混和配制；

[3] 水解分离液：盐酸与95%酒精1：1混合；

[4] 改良苯酚品红染液母液：将3.0g碱性品红溶解在100ml 70%乙醇中，以1:9的比

例将其与5%苯酚溶液混和，即得到改良苯酚品红染液母液。

[5] 苯酚品红染液：将45ml母液，6ml冰醋酸，6ml 37%甲醛混合均匀。

[6] 改良苯酚品红染液：20ml苯酚品红染液加入180ml 45%乙酸和3.6g山梨醇，静

置两周后使用。

（二）实验方法与步骤

1. 蚕豆种子的浸种与催芽

浸种准备好的蚕豆种子，按需要量放入盛有自来水的烧杯中，置于25 摄氏度的温箱中预热。如室温超过25度，即可在室温下进行浸种催芽（约24小时）。催芽待种子吸胀后，用纱布松松包裹置解剖盘或烧杯中，保持湿度，在25摄氏度的温箱中催芽12h-24h，待种子出生根露出2 mm-3 mm时，选取发芽良好的种子，放入铺有薄薄一层的湿脱脂棉的解剖盘中，仍置于25摄氏度温箱中继续催芽，注意保持湿度。再经过36h-48h，种子大部分初生根长至1.5—3.0cm，根尖发育良好，这时就可用于监测水样或检测药物溶液诱变效应。

2． 染毒与修复培养

每组选择6-8粒发芽良好的蚕豆种子，用配制好的不同浓度的农药溶液染毒处理6小时后（使根尖完全浸入处理水样中，）取出后用蒸馏水冲洗（3次,每次2-3分钟），并移至蒸馏水中修复培养22—26小时（蒸馏水浸住根尖）。

3. 材料固定

借助于物理方法或化学药剂的作用，迅速透入组织和细胞将之杀死，并且使其结构和内含物如：蛋白质，脂肪，糖类以及核物质与细胞器等，在形态结构上尽可能保持生活时的完整和真实状态，同时更易于染色，可以较清楚的显现细胞在生活时不易看清的结构。 吸取约5ml卡诺氏固定液于10ml试管中，用刀片或小剪刀切取经过处理的长约0.5-1.0cm的幼根，放入试管内，用试管塞盖紧，室温下固定20-24h，固定液的用量为材料体积的15倍以上。

4. 水解分离

水解分离的作用是去除细胞内未固定的蛋白质, 同时使胞间层的果胶类物质解体，细胞分散而易于观察。用镊子取固定好的蚕豆根尖，放在试管内，加水解分离液2ml，室温下处理8-20min，倒去水解分离液，再加入固定液2ml，软化5min，软化对细胞壁起腐蚀作用。然后倒去固定液，用蒸馏水反复冲洗使材料呈白色微透明，以镊子柄轻压能压碎为佳。

5. 染色和压片

切取蚕豆根尖分生组织放在载玻片上纵横切成几段，放在载玻片上，以十字压片法覆以载玻片，用镊子柄或铅笔头轻敲几下，再用拇指用力下压使细胞充分分散，注意不要移动玻片，然后分开两玻片，各滴上1-2滴染液，染色20-30min后加上盖玻片，注意不要产生气泡，最后用吸水纸吸去多余染液。

6. 镜检

在40×10倍镜显微镜下，凡小于主核1/4以下的，同主核有相同染色效果的，圆形、椭圆形或其他类似的形状的染色物质都可以算作微核。

注意事项:

A． 经过固定的材料如不及时使用，可以经过90%酒精换到70%酒精中各半小时，换入70%酒精，0—4℃保存半年，再观察时换用固定液再处理一次，效果较好。

B． 环磷酰胺使用剂量过大，会导致细胞核变形，而非形成微核，故在实验中应多设浓度梯度处理或进行预实验。