恶性疟原虫抗原与铜绿假单胞菌去毒外毒素的偶联

Vol. 30No. 5中国生物制品学杂志2017年5月第30卷第5期Chin J Biologicals May 2017，

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·基础研究·

恶性疟原虫ＰｆＥＭＰ１蛋白Ｎ-末端片段

与铜绿假单胞菌去毒外毒素的偶联构建

吴慧珍，刘晓，李梦梦，钱锋，徐沪济

上海200003第二军医大学附属长征医院风湿免疫科，

摘要：目的将恶性疟原虫红细胞膜表面蛋白1（Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1，PfEMP1）N -末端区段（N -terminal segment ，NTS ）共价偶联到重组铜绿假单胞菌去毒外毒素（recombinant exoprotein A ，rEPA ）上，构建NTS -rEPA 偶联蛋白，以提升NTS 的免疫原性。方法用偶联试剂Sulfo -EMCS 将马来酰亚胺基团加到rEPA 上，利用NTS 所携带的1个自由巯基将NTS 共价连接到马来酰亚胺化的rEPA 上，形成NTS -rEPA 偶联蛋白，通过分子排阻层析从偶联反应产物中去除未偶联的蛋白。采用Ellman 反应测定rEPA 上所携带的马来酰亚胺基团数量以及NTS -rEPA 偶联蛋白的偶联比，SDS -PAGE 鉴定纯化的偶联蛋白。结果通过偶联试剂Sulfo -EMCS 在每摩尔rEPA 上加上了4. 3摩尔的马来酰亚胺基团；NTS 与马来酰亚胺化的rEPA 反应生成了NTS -rEPA 偶联蛋白，偶联比为4. 1；通过分子排阻层析去除了未偶联的蛋白，得到了纯化的偶联蛋白。结论成功构建了NTS -rEPA 偶联蛋白，为今后针对NTS 的研究奠定了基础。

关键词：恶性疟原虫；红细胞膜表面蛋白1；铜绿假单胞菌；外毒素；化学偶联

中图分类号：R382. 3+1Q782文献标识码：A 文章编号：1004-5503（2017）05-0467-05

Conjugate construction of Plasmodium falciparum erythrocyte

membrane protein 1N -terminal segment to Pseudomonas

aeruginosa exoprotein A

WU Hui -zhen, LIU Xiao, LI Meng -meng, QIAN Feng , XU Hu -ji

Department of Rheumatology and Immunology, Shanghai Changzheng Hospital,

Second Military Medical University, Shanghai 200003, China Corresponding author:QIAN Feng, E -mail:[email protected];

XU Hu -ji, E -mail:[email protected]

Abstract ：Objective To construct conjugate NTS -rEPA by covalent conjugation of the N -terminal segment （NTS ）of Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1（pfEMP1）to recombinant Pseudomonas aeruginosa exoprotein A （rEPA ）so as to enhance the immunogenicity of NTS. Methods Malemide groups were added to rEPA with a chemical linker Sulfo -EMCS, to which NTS was covalently conjugated via a free sulfhydryl group carried. Un -conjugated proteins were removed by size -exclusion chromatography. The number of malemide groups added on rEPA as well as the conjugation ratio of the NTS -rEPA conjugate were measured by Ellman reaction, while the purified NTS -rEPA was identified by SDS -PAGE. Results About 4. 3moles of malemide groups were added onto rEPA by using the chemical linker Sulfo -EMCS. NTS -rEPA conjugate was formed by the reaction between NTS and maleimide modified rEPA, of which the conjugation ratio was 4. 1. SDS -PAGE showed that the un -conjugated proteins were removed and the conjugate was purified. Conclusion NTS -rEPA conjugate was successfully constructed, which laid a foundation of further study on NTS.

Key words ：Plasmodium falciparum ; Erythrocyte membrane protein 1（EMP1）; Pseudomonas aeruginosa ; Exoprotein; Chemical conjugation

（Plasmodium 恶性疟原虫红细胞膜表面蛋白1

falciparum erythrocyte membrane protein 1，PfEMP1）

[email protected]；通讯作者：钱锋，E -mail ：

徐沪济，E -mail ：[email protected]

是一个相对分子质量在200000～400000之间的

蛋白家族，其分子包含1个氨基末端区段（N -terminal segment ，NTS ）、若干个Duffy 结合样结构域（duffy binding like domain ，DBL ）、若干个富含半胱氨酸间

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1个跨膜区、1个C2结构域和1个C -末端区隔区、

［1-2］

段。PfEMP1由恶性疟原虫的var 基因编码，1个

测试；化学偶联剂Sulfo -EMCS （一端带有NHS 酯，另一端带有马来酰亚胺基团）、检测用的Ellman 试

剂和L -半胱氨酸盐酸（L -cysteine ·HCl ）均购自美国Thermo Scientific 公司；16／60Superdex 200层析柱和AKTApurifier 层析仪均购自美国GE Healthcare 公司。

1. 2马来酰亚胺化反应将rEPA 溶解在PBS -EDTA （PBS ，5mmol ／L EDTA ，pH 7. 2）缓冲液中，调节蛋白浓度为2mg ／ml ，Sulfo -EMCS 粉末用PBS -EDTA 缓冲液溶解，加入蛋白溶液中，使Sulfo -EMCS 的终浓度分别为1、2、4、8mmol ／L ，室温缓慢摇动反应1h 。反应完毕，迅速用孔径大小为5kDa 的离心过滤器多次过滤去除剩余的Sulfo -EMCS 。偶联试剂Sulfo -EMCS 一端的NHS 酯可通过亲核反应作用于蛋白的伯胺基，在生成酰胺键的同时将另一端的马来酰亚胺基团加到蛋白上，见图1。

1. 3偶联反应将含自由巯基的NTS 用孔径大小为5kDa 的离心过滤器转换缓冲液至PBS -EDTA 缓冲液中，调节蛋白浓度为0. 5mg ／ml ，同时调节马来酰亚胺修饰的rEPA 浓度为2mg ／ml 。过量的NTS 加入到马来酰亚胺修饰的rEPA 中，室温缓慢摇动反应1h 。马来酰亚胺基团能与巯基反应生成稳定的硫醚键，从而将两个蛋白偶联在一起，见图1。

恶性疟原虫染色体基因组有多达60个var 基因拷贝，但每个生长周期仅有1个var 基因最终获得表达，var 基因可分为A 、B 、C 3大群，众多的var 基因

［3］

导致PfEMP1的高度变异。

寄生恶性疟原虫的红细胞与正常红细胞之间会发生黏附，产生所谓的“玫瑰花结（rosetting ）”现象，这是造成患者微血管阻塞进而导致重症疟疾（如脑型疟）的一个重要原因［4］，PfEMP1作为疟原虫的一个配体参与了“玫瑰花结”的形成。PfEMP1能与血液中多个蛋白以及红细胞膜上的一些受体结合，如纤维蛋白原、白蛋白、血型A 和B 抗原、硫酸乙酰肝素和补体受体1等，从而使细胞间发生黏附，PfEMP1氨基端的NTS -DBL1α片段在“玫瑰花结”形成中起关键作用［5］。研究显示，能够瓦解“玫瑰花结”的抗体与抗重症疟疾具有相关性，发生重症疟疾的患者体内缺乏瓦解“玫瑰花结”的抗体，而NTS -DBL1α片段所激发的抗体就具有这种瓦解“玫瑰花结”的能力，且对寄生红细胞具有调理作用［5-12］，因此，NTS -DBL1α片段是重症疟疾预防和治疗性疫苗的潜在抗原。

为了揭示和定位NTS -DBL1α片段上的功能性表位，有必要制备针对NTS -DBL1α片段上不同区段的多克隆抗体和单克隆抗体，但NTS -DBL1α中的NTS 是一个免疫原性极低的片段，即使使用强佐剂都难以激发高水平的抗体应答。将半抗原与载体蛋白偶联可使半抗原成为完全抗原，类似的将低免疫原性抗原与载体蛋白偶联可提高抗原的免疫原性［13］。铜绿假单胞菌外毒素（exoprotein A ，EPA ）是一个高免疫原性的蛋白，作为载体已应用于多种病原体的偶联疫苗［13］。本实验以突变去毒的EPA 为构建NTS 与EPA 的偶联物，以期提高NTS 偶联载体，的免疫原性。1材料与方法

1. 1蛋白、偶联试剂及仪器恶性疟原虫PfEMP1-NTS 序列为A 群var 基因R29R +var 1编码的序列（aa ：1-83），序列中含有1个半胱氨酸，C -末端设

［6］

图1NTS 与rEPA 偶联构建示意图

Fig 1. Schematic diagram of conjugation between NTS and rEPA

置了6组氨酸标签用于蛋白的纯化，重组NTS 由E. coli 表达，纯化后的NTS 溶解在含5mmol ／L β-巯基乙醇的PBS 溶液中，以抑制分子间二硫键的形成，由美国国家健康研究院过敏疾病和传染病研究所提供，重组EPA （rEPA ）由该研究所提供（E. coli 表

达［13］；巯基化的Pfs25为本室保存［14］，用于偶联）

1. 4偶联蛋白ＮＴＳ-ｒＥＰＡ的纯化采用分子排阻层析。载体蛋白rEPA 在偶联反应中被基本消耗掉后，

未被偶联的NTS 包括二聚体由于与偶联蛋白有较大的相对分子质量差距，可通过分子排阻层析一步

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M r

M

1

2

3

4

5

去除。将16／60Superdex 200层析柱与AKTA -purifier 层析仪连接，用PBS （pH 7. 2）平衡层析柱，平衡后将偶联反应产物推射入上样环中，以PBS 为层析液进行分子排阻层析，流速1ml ／min ，收集不同流出组分，每管2ml 。

1. 5ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析蛋白电泳在非还原条件下进行，蛋白样品与上样缓冲液等量混合，96℃处理6min ，上样4%～12%Tris -glycin SDS -PAGE 梯度电泳胶，恒流电泳，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色至胶背景透明。1. 6Ｅｌｌｍａｎ反应

检测溶液中的自由巯基采用直

116

976655

200000

[1**********]0

[***********]006000

蛋白质marker ；1：rEPA ；2~5：分别以1、2、4和8mmol ／L Sulfo -M ：

EMCS 处理的rEPA 。

接Ellman 反应，而检测溶液中的马来酰亚胺基团采用间接Ellman 反应，按照Ellman 试剂操作指南进行。进行直接Ellman 反应时，将过量Ellman 试剂加入溶液中，室温反应15min ，在酶标仪上读取A 405值，与L -cysteine ·HCl 的Ellman 反应标准曲线对比，得出溶液中自由巯基的量（每摩尔蛋白含有的自由巯基摩尔数）。进行间接Ellman 反应时，在溶液中加入过量的L -cysteine ·HCl ，室温反应1h ，加入Ellman

试剂，检测反应后剩余的L -cysteine ·HCl ，计算得到消耗掉的L -cysteine ·HCl 量，从而推算出溶液中马来酰亚胺基团的量（每摩尔蛋白平均含有的马来酰亚胺基团摩尔数）。

1. 7平均偶联比的测定采用直接Ellman 反应测定偶联反应结束后反应产物中剩余的自由巯基的量，以及反应前NTS 溶液中自由巯基的量，得出在偶联反应中消耗掉的自由巯基的量，计算得到偶联蛋白的平均偶联比（每摩尔rEPA 上带有的NTS 摩尔数）。2结果

2. 1ｒＥＰＡ的马来酰亚胺基团修饰SDS -PAGE 分析显示，在与各浓度的Sulfo -EMCS 反应中，rEPA 相当稳定，未发生明显的蛋白聚合或降解，见图2。用巯基化的Pfs25对马来酰亚胺修饰的rEPA 进行偶联检测，当过量加入巯基化的Pfs25，除1mmol ／L Sulfo -EMCS 修饰的rEPA 外，其余浓度Sulfo -EMCS 修饰的rEPA 均能被消耗掉，即用这些浓度的Sulfo -EMCS 对rEPA 进行马来酰亚胺基团修饰时，每个rEPA 分子均能带上至少1个马来酰亚胺基团。本实验选择2mmol ／L 浓度的Sulfo -EMCS 与rEPA 反应，制备马来酰亚胺化的rEPA ，用于与NTS 的偶联反应，间接Ellman 反应检测得出，每摩尔rEPA 平均

加上了4. 3摩尔的马来酰亚胺基团。

图2马来酰亚胺化rEPA 的SDS -PAGE 分析Fig 2. SDS -PAGE profile of malemide modified rEPA

2. 2ＮＴＳ与ｒＥＰＡ的偶联反应SDS -PAGE 分析显示，在偶联反应中过量加入NTS ，使得马来酰亚胺化

的rEPA 在偶联反应中能够完全消耗掉，NTS 在转换缓冲液后，因去除了还原剂β-巯基乙醇而生成了一定量的二聚体（图3泳道2）；偶联反应后，生成了不同偶联比的NTS -rEPA 偶联蛋白（图3泳道3），而马来酰亚胺化的rEPA 在NTS 过量加入的情况下已基本消耗掉。Ellman 反应检测偶联反应中消耗掉的自由巯基数量，经计算得出，NTS -rEPA 偶联蛋白的平均偶联比为每摩尔rEPA 含有4. 1摩尔的NTS 。2. 3偶联蛋白ＮＴＳ-ｒＥＰＡ的纯化层析图谱及收集的各层析组分的SDS -PAGE 分析显示，分子排阻层析可将偶联蛋白与未偶联的NTS 完全分离开来（图4和图5）。合并相关收集管中的蛋白并浓缩，得到纯化的NTS -rEPA 偶联蛋白（图3泳道4），这是一个含有不同偶联比的混合偶联产物。

M r [**************]

[1**********]0

M 1234

[***********]006000

M ：蛋白质marker ；1：马来酰亚胺化的rEPA ；2：在PBS -EDTA 缓冲液中的NTS ；3：NTS 与rEPA 的偶联反应产物；4：NTS -rEPA 偶联蛋白。

图3NTS -rEPA 偶联蛋白的SDS -PAGE 分析Fig 3. SDS -PAGE profile of NTS -rEPA conjugate

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4540

[1**********]050-5

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

120

m A U

体积（ml ）

图4偶联反应产物的分子排阻层析图谱

Fig 4. Size -exclusion chromatographic profile of conjugate

M r

M 1

2

3

4

5

6

7

8

910

M

11

12

[1**********]819

200000116

976655

[1**********]0

[***********]006000

M ：蛋白质marker ；1～19：样本覆盖了层析图上从第1个峰的起始至第2个峰结束的区域。

图5分子排阻层析分离成分的SDS -PAGE 分析

Fig 5. SDS -PAGE profile of fractions seperated by size -exclusion chromatography

3讨论

蛋白分子上的一些基团可被用来进行偶联反应，如伯胺基，伯胺基包括N -末端氨基和赖氨酸的氨基，一个蛋白分子通常含有多个伯胺基，处在蛋白分子表面的伯胺基理论上均可被用来进行蛋白偶联，在利用伯胺基与偶联试剂反应时，一个蛋白分子可被加上多个连接基团。从马来酰亚胺基团修饰rEPA 的反应中可见，反应产物并不均一，即每个rEPA 分子上带有的马来酰亚胺基团的数量并不相同，导致最终的偶联产物是含有不同偶联比的混合产物。如偶联试剂Sulfo -EMCS 的浓度偏低，则会有部分rEPA 无法加上连接基团，由于rEPA 与低偶联比NTS -rEPA 的相对分子质量很接近，要从偶联反应产

15］

物中去除未偶联的rEPA 难度较大［13，有。同时，

未偶联的rEPA 不利于偶联蛋白平均偶联比的计

算，这就需要偶联试剂达到一定的浓度，使每个rEPA 能够带上至少1个马来酰亚胺基团，本实验中确定的Sulfo -EMCS 浓度（2mmol ／L ）符合该偶联实验的要求。

NTS 含有1个半胱氨酸，半胱氨酸上的自由巯基可被用来进行蛋白偶联，NTS 无需外加连接基团。但NTS 在转换缓冲液去掉原缓冲液中的还原剂后，NTS 之间因氧化形成的二硫键而产生了一定量的二聚体，由于二聚体丧失了自由巯基，无法直接被用于蛋白偶联，但在无还原剂的情况下，并不是所有的NTS 均会形成二聚体，这就确保了通过该流程能够形成偶联蛋白。在偶联反应中加入过量的NTS ，目的在于使rEPA 在偶联反应中全部反应掉，这有利于偶联蛋白的纯化，也有利于平均偶联比的计算。

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NTS -rEPA 偶联蛋白是一个含有不同偶联比的混合

产物，由于NTS 仅含有1个自由巯基，非常直观地显示，rEPA 的马来酰亚胺化产物是非均一的。

平均偶联比是偶联蛋白一个非常重要的参数，不仅可作为偶联蛋白生产的质控指标，也是计算偶联蛋白中组分蛋白浓度的基础，偶联蛋白的平均偶联比通常是通过测定偶联蛋白和组分蛋白的氨基酸成分来计算的［16］，但蛋白氨基酸成分测定需要特定的仪器，测定费用也较昂贵。由于NTS 仅含有1个半胱氨酸，1个自由巯基对应1个NTS 分子，因此在偶联反应中，所消耗掉的自由巯基的量就对应于参与反应的NTS 量，这样即可通过测定反应中消耗掉的自由巯基间接推断加到rEPA 上的NTS 量，也就是偶联蛋白的平均偶联比。本实验中NTS -rEPA 偶联蛋白的平均偶联比为4. 1，一致于rEPA 上所加的马来酰亚胺基团的平均量4. 3。如是两个较大分子之间的偶联，由于空间位阻的存在，前一个数值一般会小于后一个数值。

综上所述，本实验成功构建了NTS -rEPA 偶联蛋白，为提高NTS 的免疫原性从而制备针对NTS 的多克隆或单克隆抗体奠定了基础，同时建立的该蛋白偶联流程也可应用于其他类似蛋白或多肽的偶联。

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收稿日期：2016-12-01编辑：何巍