植物查尔酮异构酶分子生物学研究进展_综述_
河北科技师范学院学报 第22卷第1期, 2008年3月
Journal of Hebei Nor mal University of Science &Technol ogy Vol . 22No . 1March, 2008
植物查尔酮异构酶分子生物学研究进展(综述)
周发俊, 王逸群, 陈由强
(福建师范大学生命科学学院, 福建福州, 350108)
3
摘要:查尔酮异构酶(CH I ) 是控制类黄酮物质合成关键酶之一, 它与植物的花色形成以及抗虫、抗病生理密切相关。概述了CH I 的生物化学功能、催化反应机理、结构类型和CH I 在植物基因工程方面应用的研究进展, 对CH I 的研究及其应用前景进行了展望。关键词:查尔酮异构酶; 分子生物学; 进展
中图分类号:O786 文献标志码:A 文章编号:1672) 012查尔酮异构酶(chalcone is omerase, CH I, EC 5. 5. 1. [1], 也是增加黄酮化合物的关键酶[2]。, , [3], , 对肿瘤和心血管等疾病的治疗与预防也有重要的药用价值[4]。另外, , 目前市场上已有多种相关保健产品上市。
, 其合成过程中多种结构酶和调节酶现已被分离研究。目前国外对CH I 的研究较多, 主要集中在其结构功能、基因克隆、序列分析及转基因表达调控研究方面, 但国内关于CH I 的研究报道还很少。
1 CH I 的生物化学功能
在异黄酮合成途径中, 查尔酮合成酶(CHS ) 催化合成反应的第一步, CH I 催化第二步反应, 由一个香豆酰辅酶A 和三个丙二酰辅酶A 在CHS 的作用下生成查尔酮。查尔酮再经过CH I 的作用形成二氢黄酮。二氢黄酮再在各种酶的催化下转化为其它各种颜色类型的黄烷酮化合物。
CH I 在植物中表达与否及表达量的高低都会影响黄酮代谢的量, 同时也会影响到植物花的颜色。如缺乏CH I 的玉
米突变体, 查尔酮积累, 玉米粒呈古铜色[5]。黄酮化合物的产量也受各种环境因子的影响, 如温度与金属离子会影响植物花色素苷的积累, 研究表明增施镁盐可以预防温度提升, 导致CH I 活性下降, 从而达到增强植物花色的作用[6～10]。
2 CH I 催化反应机理
在没有辅因子参加的情况下, CH I 催化使查尔酮分子内发生环化反应, 在结构上使一个易闭环的、离子化的双环黄色查尔酮变为有生物学活性的无色三环黄烷酮。这种环化反应需要特殊的底物, 该底物在2’位上连接的羟基发生脱氢反应, 从而发生环化。这一步骤也可以在没有CH I 的条件下在植物体内缓慢自发进行, 但在CH I 催化下可使该生化反应加速完成, 反应速率提高了107倍[11]。随着反应体系中pH 的不同, CH I 的催化效率也有所不同。当pH 为7. 5, CH I 催化活性达到90%; 而在pH 为6. 0时, CH I 催化活性仅有50%[12]。
对CH I 进行结晶后经过X 2光衍射发现紫花苜蓿(M edicago sativa ) 的CH I 在立体结构上以及催化作用的动态反应过程上具有很强的特殊性。它的催化中心由两个水分子和5个氨基酸残基(Thr 48, A la 49, lys 97, Tyr 106, Tyr 15) 组成[13]。CH I 三维结构中发生折叠现象较为特殊, 呈三明治状[14]。
3 CH I 的类型
目前已发现CH I 不仅存在于植物体内, 在真菌、细菌内也有[15]。存在于植物中的CH I 具有种属特异性。一般把植物中的CH I 分为两种类型[8]:类型I 和类型II 。类型I 的CH I 只能以62羟基查尔酮(62hydr oxychalcone ) 为底物, 如黄瓜
(Cucum is sativus ) 中存在的CH I [16]; 类型II 的CH I 既可以62羟基查尔酮(62hydr oxychalcone ) 为底物, 也可以62脱
基金项目:福建省科技厅科技项目(项目编号:2004N026) ; 福建省自然科学基金项目(项目编号:B0410009) ; 福建省教育
厅科技项目(项目编号:JB03125) 。
3通讯作者, 男, 副教授。E 2mail:yiqun20@yahoo . com. cn 收稿日期:2007211219; 修改稿收到日期:20072122
27
74河北科技师范学院学报 22卷
氧查尔酮(62deoxychalcone ) 为底物。类型II 的CH I 一般存在于豆科植物中。有趣的是在豆科植物甘草(Glycyrrhiza echi 2
nata ) 中两种类型的CH I 都存在
[17]
。蛋白质抗原交叉反应和c DNA 交叉杂交表明, 豆科和非豆科植物中CH I 类型的不
同是由CH I 蛋白结构不同所导致的[19]。
4 CH I 编码基因chi 的克隆及其转基因植物
4. 1chi 基因的克隆
1982年从大豆、菜豆中分离了CH I
表1 从不同植物中克隆得到的chi 基因
植物矮牵牛
菜豆金鱼草海棠花豌豆
紫花苜蓿翠菊
学名
Petunia x hybrida Phaseolus vulgaris A ntirrhinum m ajus M alus Pisum M itis Pueraria m ontana var . lobata Callistephus chinensis D ianthus caryophyllus R aphanus sativus (radish ) Ipo m oea purpurea Elaeagnus um bellate C itrus sinensis Glycine m ax lotus japonicus A rabidopsis thaliana Cyclam en persicum Eusto m a grandiflorum Ipo m oea batatas Solanum lycopersicum A llium cepa Fragaria x ananassa
时间
[***********][***********][***********][***********][***********][***********]2007
登录号
Y00852X16470M68326X75963D38168D63577Z67980Z67989AF031921AF028238AF061808AB011794AF276302AB073787AJ418046BD094412AB078955AB080768AY348871AY541034AB201754AB234907DQ160232DQ120521AB213651EF187439AF509335EF570112EF446163
长度/bp
[***********][***********][***********][***********][***********]835748
后
[19]
, 1988年从矮牵牛中克隆得到了两个
chi 基因, 即chi 2A 与chi 2B 基因。其中chi 2
A 基因全长726bp, 编码241个氨基酸; chi 2B 基因全长2170bp, 编码220个氨基
酸。研究表明, 在植物的不同组织中, 这两个基因的表达具有特异性
[20]
, 通常在成熟
的雄蕊和花冠中表达chi 2A, [22]
药中表达chi 2B 。, 2A 受。对
chi 2A 和chi 2B DNA 序列研究显示,
康乃馨启动子中有37bp 序列高度保守[20, 21]。萝卜
紫花牵牛1994年, 从豌豆(Pisum sativum ) 上胚轴中
牛奶子
克隆到chi 基因, c DNA 全长986bp, 编码
甜橙
233个氨基酸, 其氨基酸组成与菜豆和矮
大豆
牵牛的氨基酸序列显示较高的同源性[23]。
日本睡莲
从水母雪莲(Saussurea m edusa ) cDNA 文库
拟南芥
中分离到chi 基因与其chi 基因组序列相
仙客来
同, 均为699bp, 没有内含子的存在[24]。
洋桔梗
目前, 已从多种植物中克隆到了chi 基甘薯因, 并应用于转基因植物研究(表1) 。 对植物chi 编码氨基酸序列进行分析, 来研究不同植物间CH I 的同源性, 结果见图1。
由图1可知, 同源性最高可达94%, 像甘薯与紫花牵牛、大豆与野葛根。而大部
番茄
洋葱草莓
马鞭草V erbena x hybrida 大花美人蕉Canna generalis
Cam ellia sinensis N icotiana tabacum Gossypium hirsutum Saussurea m edusa O ncidium Go w er Ram sey Pyrus co mm unis (pear )
茶
分同源性基本上在51%～94%之间变化。烟草
陆地棉对比分析表明, chi 基因可能在整个进化过
水母雪莲程中是趋于保守的, 其同源性很高[25, 26]。
蝴蝶兰
4. 2 chi 植物基因工程
西洋梨
基于CH I 在黄酮生物合成中的重要
性,Muir 等[2]曾将矮牵牛chi 基因转入番茄并获得了转基因番茄, 表达分析显示在其果皮中黄酮类含量比对照增加了78倍、果肉中黄烷醇增加了21倍, 而在其表现型上和对照相比没有什么差别。将chs 和chi 基因导入矮牵牛并获得了超表达, 转基因植株花的颜色却发生了改变[27]。在番茄中异位表达玉米的转录因子Cc 和C1导致整个番茄果肉中黄烷酮含量增加20倍[28]。由R i 质粒介导将水母雪莲chi 基因转入新疆雪莲, 诱导出新疆雪莲发根, 在转chi 基因新疆雪莲发根中芹菜素含量比对照组提高了12倍, 总黄酮量可提高4倍[29]。将水母雪莲chi 转入烟草, 转基因烟草中总黄酮含量比野生型提高5倍[24]。这些结果表明, 应用基因工程技术将chi 基因导入到植物中, 其表达产物可以促进有益于人体健康的黄酮类化合物的生物合成, 具有开发应用的前景。
将chi 基因转入矮牵牛中, 转基因矮牵牛花色发生了改变, 而且花器官也发生了变异[30, 31]。洋葱中chi 基因突变引起CH I 酶活性的丧失, 导致洋葱变为金色[32, 33]。将chs 正义基因和chi 反义基因导入到甜橙中, 转基因甜橙中苦味物质的合成量减少, 水果的口味发生了改变, 口感更好了[33]。
1期 周发俊等 植物查尔酮异构酶分子生物学研究进展(综述
) 75
从牛奶子根的结节处克隆到类型I 的chi 基因, 原位杂交结果显示该基因在根结节处被感染的细胞中存在较多[34]。对chs 和chi 基因的转录水平表达研究结果表明, 在紫花苜蓿根尖和全部的幼根中表达量较高, 而在植物的茎、叶、花中表达量则非常低。如果人为伤害子叶则会造成在茎、叶、花中chs 和chi 的转录水平和表达量的迅速增加[35]。这些现象表明, 在一些植物中, CH I 可能参与植物的保护反应
。
图1 不同植物chi 编码氨基酸序列同源性分析
5 展 望
运用植物组织培养、分子生物学等技术将CH I 等目标酶基因在植物中过量表达来提高植物中黄酮含量, 已成为目前植物学及药学领域中重点研究内容之一。预计将有更多的植物黄酮类化合物被陆续开发而成为新型药物, 黄酮类药物的市场前景无限广阔。应用直接导入外源基因chi 或者利用共抑制和反义抑制的技术来改变植物花色, 可以大大提高花卉的观赏性。
由于目前对chi 基因表达调控机理、chi 的活性基团、稳定性、环境影响因子以及合成途径中各种酶之间相互协同或抑制等方面还缺乏全面的认识, 加强这些方面的研究工作, 无论在理论上还是在应用上都非常有意义。因此, CH I 相关的基础性研究应成为今后的重要研究课题之一。分子生物学技术在生产黄酮药物、改善药材质量、增强植物自身的逆境抗性、培育出更新颖、美丽的花卉品种等方面会发挥重要作用。
参考文献:
[1] MOUST AF A E, WONG E . Purificati on and kinetic p r operities of chatcone 2flavanone is omerase fr om s oya bean [J ].Eurj
B i oche m. 1975, 50(2) :3832389.
[2] MU I R S R, COLL I N S G J, ROB I N S ON S, et al . Overexp ressi on of petunia chalcone is omerase in t omat o results in fruit
containing increased levels of flavonols [J ].Nat B i otechnol, 2001, 19(5) :4702474.
[3] D I XON R A, P A I V A N L. Stress 2induced phenyl p r opanoid metabolis m [J ].Plant cell, 1995, 7:108521097. [4] D I XON R A, STEE L C L. Flavonoids and is oflavonoids 2a gold m ine f or metabolic engineering [J ].Trends Plant Sci,
1999, 4(10) :3942400.
[5] DONNER H K, ROBB I N S T P . Genetics and devel opmental contr ol of anthocyanin bi osynthesis [J ].Annu Rev Genet,
1991, 25:173.
76河北科技师范学院学报 22卷
[6] 林泉, 许智宏, 刘春明. 植物发育的分子机理[M].北京:科学出版社, 1998.
[7] AM I S D, DAV I D K, DAV I D F, et al . Barley chalcone falconine is omerase gene:is olati on, comparative sequence and pu 2
tative mutant analysis . Plant &Ani m al Genome ⅧConference[C ].T own &Country Hotle, San D iego, 2000, 9212. [8] NOR I M OT O S, T OS H I O A, S HUSE I S, et al . A cluster of genes encodes the t w o types of chalcone is omerase involved in
the bi osynthesis of general falavonoids and legu me s pecific 52deoxy (is o ) flavonoids in Lotus japonicus [J ].Plant Physi ol o 2gy, 2003, 131(3) :9412951.
[9] 孟繁静. 植物花发育的分子生物学[M].北京:中国农业出版社, 2000.
[10] S HAKE D 2S ACHRAY L, W E I SS D, RE UVE N IM , et al . I ncreased anthocyanin accumulati on in aster fl owers at elevated
te mperatures due t o magnesiu m treat m ent[J ].Physi ol Plant, 2002, 114(4) :5592565.
[11] BE DNAR R A, HADCOCK J R. Purificati on and characterizati on of chalcone is omerase fr om s oybeans[].B i ol Che m,
1988, 263:958229588.
[12] JOSEPH M J, NOE L J P . Reacti on mechanis m of chalcone is p r oduct
binding differences [J ].J B i ol Che m, 2002, 277(2) :1.
[13] JOSEPH M J, MAR I A NE E, A , evoluti onarily unique p lant enzy me
chalcone is bi ol ogy, () 2.
[14] A N is omerase fa m ily and fold:No l onger unique t o p lants [J ].Pr otein Sci,
2544.
[15] C, BRAUNE A, BLAUT M. First bacterial chalcone is omerase is olated fr om Eubacteriu m ra mulus[J ].A rch
M icr obi ol, 2004, 181(6) :428234.
[16] L I U Q, BONNESS M S, L I U M , et al . Enzy mes of B 2ring 2deoxy flavonoid bi osynthesis in elicited cell cultures of “old
man ”cactus (Cephal ocereus senilis ) [J ].A rch B i oche m and B i ophys, 1995, 321(2) :3972404.
[17] KI M URA Y, AOKI T, AY ABE S . Chalcone is omerase is ozy mes with different substrate s pecificities t oward 6’2hydr oxy
and 6’2deoxychalcones in cultured cells of Glycyrrhiza echinata, a legu m inous p lant p r oducing 52deoxyflavonoids [J ].Plant Cell Physi ol, 2001, 42:116921173.
[18] D I XON R A, BLY DE N E R, ROBB I N SM P, et al . Comparative bi oche m istry of chalcone is omerase [J ].Phyt oche m is 2
try, 1988, 27:280122808.
[19] M EHDYM C, LAMB C J. Chalcone is omerase c DNA cl oning and mRNA inducti on by fungal elicit or, wounding and in 2
fecti on [J ].E MBO J, 1987, 6(6) :152721533.
[20] T UNE N A J V, K OES R E, MOL J N M , et al . Cl oning of the t w o chalcone flavanone is omerase genes fr om Petunia hy 2
brida:coordinate light 2regulated and differential exp ressi on of flavonoid genes [J ].E MBO J, 1988, 7(5) :125721263.
[21] VANDER MEER IM , STT AM M E, VAN T UNE N A J, et al . Antisense inhibiti on of flavonoid B i osynthesis in petunia
anthers results in male sterility[J ].Plant Cell, 1992, 4:253.
[22] T UNE N A J V, HART MAN S A,MOL J N M , et al . Regulati on of flavanone is omerase (CH I ) gene exp ressi on in Petunia
hybrida:the use of alternative p r omoters in cor olla, authers and pollen [J ].PlantMol B i ol, 1989, 12:5392552.
[23] WOOD A J, DAV I ES E . A c DNA Encoding Chalcone ls omerase fr om Aged Pea Ep icotyls[J ].Plant Physi ol, 1994, 104
(4) :146521466.
[24] L I F, J I N Z, QU W , et al . Cl oning of a c DNA encoding the Saussurea medusa chalcone is omerase and its exp ressi on in
transgenic t obacco[J ].Plant Physi ol B i oche m, 2006, 44(729) :4552461.
[25] K AR I N S, JUN 2CH I RO N, MAM I Y, et a1. Recent advances in the bi osynthesis and accu mulati on of anthocyanins [J ].
Natural Pr oduct Report, 2003(20) :2882303.
[26] 颜华, 宋云, 李翊云, 等. 查尔酮异构酶基因的克隆序列分析及在大肠杆菌中的表达[J ].植物学报, 1997, 39
(11) :103021034.
[27] PE LLETI ER M K, BURBUL I S I E, W I N K LE 2SH I RLEY B. D isrup ti on of s pecific flavonoid genes enhances the accu mu 2
lati on of flavonoid enzy mes and end 2p r oducts in A rabidop sis seedlings [J ].PlantMol B i ol, 1999, 4(1) :45254.
[28] BOVY A, DE VOS R, KE MPER M , et al . H igh 2flavonol t omat oes thr ough heter ol ogous exp ressi on of the maize tran 2
scri p ti on fact or genes Lc and C1[J ].The Plant Cell, 2002, 14(10) :250922526.
[29] L i F X, J I N Z P, ZHAO D X, et al . Overexp ressi on of the Saussurea medusa chalcone is omerase gene in S . involucrata
hairy r oot cultures enhances their bi osynthesis of ap igenin[J ].Phyt oche m istry, 2006, 67(6) :553260.
1期 周发俊等 植物查尔酮异构酶分子生物学研究进展(综述
)
[30] 祝钦泷. 转查尔酮异构酶(CH I ) 基因矮牵牛花色改变及其花器官变异的研究[D].重庆:西南农业大学, 2004.
77
[31] T AK AMURA T, T OM I HAMA T, M I Y AJ I M A I . I nheritance of yell ow 2fl owered characteristic and yell ow p ig ments in di p 2
l oid cycla men (Cyclamen persicu m ) cultivars [J ].Scientia hort, 1995, 64:55263.
[32] KI M S, JONES R, Y OO K S, et al . Gold col or in oni ons (A lliu m cepa ) :a natural mutati on of the chalcone is omerase
gene resulting in a p re mature st op codon[J ].Mol Genet Genom ics, 2004, 72(4) :4112419.
[33] UF UK K, D I A NE L, MARK B, et al . Mani pulati on of the flavonoid bi osynthetic path way in citrus t o decrease bitter taste
and /ort o increase the flavonoid content t o have better accep tability of fruits[C ].I nternati onal ass ociati on f or p lant tissue culture and bi otechnol ogy congress, 2002.
[34] KI M H B, BAE J H, L I M J D, et al . Exp ressi on of a functi onal type 2I chalcone is omerase gene is l ocalized t o the infec 2
ted cells of r oot nodules of Elaeagnus u mbellata[J ].Mol Cells, 2007, 23(3) :4052409.
[35] MCKHANN H I, H I RSCH A M. Is olati on of chalcone synthase and chalcone omerase c s fr Medicago sa 2
tiva L ) :highest transcri p t levels occur in young r oots and r oot [J ].5:.
作者简介:周发俊(19852) , 女, 硕士研究生。:(责任编辑:石瑞珍)
of Pl an t Cha lcone Iso m era se (Su mmary) ZHOU Fa 2jun, WANG Yi 2qun , CHE N You 2qiang
(College of life Sciences, Fujian Nor mal University, Fuzhou Fujian, 350108, China )
Abstract:Chalcone is omerase (CH I ) is one of the key enzy mes that contr olled the synthesis of p lant fla 2vonoids . It is cl osely related t o fl ower col ors of p lants, insect resistance and disease 2resistant physi ol ogy . This paper briefly intr oduces the bi oche m ical functi on of CH I, its catalytic reactive mechanis m , its structural types and its app licati on in p lant genetic engineering . Pr os pects of the research and app licati on in molecular bi ol ogy are als o revie wed in the paper .
Key words:chalcone is omerase; molecular bi ol ogy; p r ogress
3
加入台湾华艺CEPS 中文电子期刊服务的声明
《河北科技师范学院学报》自2004年10月起, 加入台湾中文电子期刊服务———思博网(CEPS ) 。中文电子期刊服务———思博网是目前台湾地区最大的期刊全文数据库, 收录台湾地区300余种核心期刊的全文, 其访问地址为:www . cep s . com. t w 。自此, 读者可以通过这一网址检索《河北科技师范学院学报》于1994年起各期的全文。此外, 由于《河北科技师范学院学报》被CEPS 收录, 故凡向本刊投稿者, 均视为其文稿刊登后可供思博网(CEPS ) 收录、转载并上网发行; 其作者文章著作权使用费与稿酬本刊一次付清, 不再另付其他报酬。请各位继续支持本刊, 谢谢!
学报编辑部