经典微生物学系统实验论文

对α-淀粉酶的系统性研究

朱习爱，谭顺耀，李兴周，时有才

（云南大学 生命科学学院生命科学系 云南 昆明 650500）

摘要：α-淀粉酶是一种重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业。本文通过一系列实验，对α-淀粉酶酶活力（碘比色法和DNS法）、α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测、菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定、产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验、α-淀粉酶酶蛋白的提取和纯化和酶（纯化后）生物学特性测定等七个方面的内容进行系统的研究，进一步加深了对该酶性质方面的理解，提高了实际操作能力。

关键字：α-淀粉酶，酶活力，菌株，正交试验

第一章 α-淀粉酶酶活力测定

通过对碘比色法和DNS法的学习，掌握α-淀粉酶酶活力测定的原理及操作步骤。

1.材料和方法

1.1 碘比色法

1.1.1材料：碘原液，比色稀碘液，标准比色碘液，pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，2%可溶淀粉溶液，标准糊精溶液，标准终点色溶液，蒸馏水，相关玻璃仪器（试管、移液管、滴管）等。

1.1.2原理：酶促催化反应分解淀粉等底物（反应物）产物为麦芽糖、糊精等。反应式：淀粉→红色糊精。淀粉及糊精检测原理：碘检测

淀粉（紫蓝色，30分子以上）→红色糊精（红棕色，7-30分子）→无色糊精，7分子以下）→麦芽糖（不显色）→葡萄糖（不显色） 1.1.3 方法：

1.2 DNS法

1.2.1材料：3，5-二硝基水杨酸氢氧化钠；酒石酸钾钠；重蒸苯酚；无水亚硫酸钠，标准麦芽糖溶液，0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液，1%马铃薯淀粉溶液，麦芽糖，蒸馏水，相关玻璃仪器等。

1.1.2原理：淀粉酶催化产生的还原糖（麦芽糖等）能使3,5-

二硝基水杨酸还原，生成棕红

色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：

淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位样品（重量或体积）在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 1.1.3 方法：

1.1.3.1 标准曲线的制作 相关试剂加入表： 试 剂

标准麦芽糖溶液 （mL） 蒸馏水 （mL） 麦芽糖含量 （mg） DNS试剂 （mL）

管 号 1 0 2.0 0 2.0

2 0.4 1.6 0.4 2.0

3 0.8 1.2 0.8 2.0

4 1.2 0.8 1.2 2.0

5 1.6 0.4 1.6 2.0

6 2.0 0 2.0 2.0

2 结果

计算公式： 2.1碘比色法

Ｎ——为酶的稀释倍数（控制反应时间）

2.2 DNS法

N-酶液稀释倍数 10-反应时间为10min

将实验数据带入excel得到标准曲线方程：Y=0.545X-0.029 由方程和上式可计算出α-淀粉酶酶活力为500（u/ml）

蛋白质含量（mg/mL）=（1.45×A280－0.74×A260）×N A280=0.4 A260=0.42代入上式得蛋白质含量为27（mg/ml） 比酶活力为18.52（u/ml）.

3 讨论

通过对α-淀粉酶酶活力的测定，让我们掌握了碘比色法和DNS法测定酶活力，两种方法在不同的条件下有不同的适用范围，各自也有各自的优缺点。碘比色法在实验中要严格控制温度及反应时间，测定管及空白管不能混淆，以减少误差；在DNS法中，关键是标准曲线的正确制作，会利用相关软件求出回归方程，了解分光光度计的原理及操作方法。在以后的工作研究中具有重要意义。

第二章 α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化检测、菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定、菌株产酶培养基组成优化正交试验

1.材料和方法

1.1材料 马铃薯浸液，玉米淀粉，琼脂，可溶性淀粉，Na2HPO4 .12H2O，（NH4）2SO4 ，NH4Cl，豆粕粉浸出液，培养基，无菌吸管，无菌水，涂布器，CaCO3等。

1.2 方法

1.2.1 α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测

1.2.2 α-淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定 1.2.2.1初筛发酵培养

实验操作流程

灭菌

准备发酵培养基 灭菌

冷却后接种环接种

恒温摇瓶培

养

酵液棉花过测定酶活力确定1-2株复发

酵菌株

（1瓶/株）

一级液体活化菌

种

液体菌种接种于发酵培养基（3-5瓶/株） 灭菌

准备发酵培养基

恒温摇瓶培

养

酵液棉花过测定酶活力

1.2.3 产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验

实验操作流程

测定发酵液酶活力

酶活力高的发酵液合并

离心（12000转/分钟，10分钟

收集上清液 加入2倍体积的

-20℃冷冻

保存

用时提前水浴溶化 冷冻离心（4000转

混匀后

/分钟，10分钟）量取250mL放入1 再加入100mL

去上清乙醇混合液（统一收集）

-20℃预冷无水乙醇脱水处理 0℃预冷无水乙醇（500mL）

冷冻离心（4000转/

轻摇后

分钟，10分钟）

上清乙醇液（统一

收集）

沉淀室温真空干燥（备用）

2 结果

2.1α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测

细培养皿菌号 总菌落数 数 CFU/g 菌培养皿落号 数 菌落数

CFU/g 产淀粉比例

1

2

3

平均

1

2

3

平均

1

2

3 87

平均 84

1 23

2 15

3 5

平均 14

无法计数 无法计数

81 85 4.2*108 平均

1

2

1 2 3

平均

1 2 3 3 0

无法计数 无法计数

0 1 1.67*106 4.0%

平均 0.3

1 1

2 2

3 0 平均 1

1 2 3 4 5 6 7 8

15 13 14 12 14 13 12 14

6 5 3 4 3 3 3 4

2.5 2.6 4.7 3.0 4.7 4.3 4.0 3.5

7 6 1 5 1 2 3 4

2.2 α-淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定 2.2.1 初筛菌株α-淀粉酶活力计算记录表（表三） 菌株编号

分

1 2 3 4

反应时间

秒

稀释倍数

分钟 ＞15.5 ＞15.5 ＞15.5 ＞15.5

10 10 10 10

酶活力单位（u/ml）

15 30 30.96

2.2.2复筛菌株α-淀粉酶活力计算记录表（表四） 重复瓶号 1 2 3 4 平均

分 15 13 8 9 11.4

反应时间 秒 0 0 30 0 7.5

分钟 15 13 8.5 9 11.375

稀释倍数 10 10 10 10 10

酶活力单位（u/um） 32 37 56.4 23.4 42.2

2.3 产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验 2.3.1直观分析（表五） 试验号 因素 实验1 实验2 实验3 实验4 实验5 实验6 实验7 实验8

A 淀粉 2 2 2 4 4 4 6 6

B 麦麸 0 1 2 0 1 2 0 1

C KH2PO4 0.0 0.1 0.2 0.1 0.2 0.0 0.2 0.0

发酵液酶活力单位 实验结果 94.86 117.65 116.5 73.85 94.49 90.57 198.35 137.14

实验9 均值1 均值2 均值3 极差 因素 A淀粉 B麦麸 KH2PO4 误差

6 109.670 86.303 156.523 70.220 偏差平方和 7672.084 117.061 1617.092 9406.24

2 122.353 116.427 113.717 8.636 自由度 2 2 2 6

0.1 107.523 108.527 136.447 28.924 F比 2.447 0.037 0.516

134.08 F临界值 5.140 5.140 5.140

2.3.2方差分析表（表六）

2.3.3 主体间效应的检验（表七）

3 讨论

3.1 从样品平板菌落计数结果和点接平板培养后碘液显色反应结果可以看出，样品平板菌落在稀释度为10-4,10-5时，菌落数较密集，可能由于操作上的问题或菌落本身及培养条件不同，产淀粉酶菌株占总菌数的4.0%，比例较低，根据表二可知，菌株3和5的D/d比值最大，可知其产酶量最大。

3.2 在初筛的时候，目的是找出酶活力最强的菌株编号，所以当每一瓶的反应时间超过最短反应时间后我们就没有再继续测了，所以1、2、3号菌株为了节省时间就没有测得最终反应时间。

由表三可以看出，1、2、3、4号菌株中酶活力最强的为4号菌株，但是在相同条件下与其他组相比，酶活还是较低。

通过表四可以看出，复筛用的是酶活力最大的菌株，通过摇瓶培养，酶活力进一步提高，酶活力最高的为第三瓶。经过本次试验，是我们了解了利用微生物摇瓶发酵培养有了一个全面的认识，对实际生产有重要的指导意义。同时，实验耗时较长，需要足够的耐心才行。

3.3 政教优化实验无论在发酵工业中，还是在科学研究中都有广泛用途，虽然在3个周之内不可能让我们完全掌握有关知识，但是本实验让我们了解了优秀

菌株的筛选流程，提高了我们的实际操作能力，掌握了正交实验的基本方法和步骤，涉及因素，但存在不足的一点就是数据分析软件不会用，这点需要我们大大提高。

第三章 α-淀粉酶酶蛋白的提取和纯化及相关生物学特征的测定

1.材料和方法

1.1相关材料:样品管，离心管，胶头滴管，试剂瓶，层析装置，缓冲液，氢氧化钠，氯化钙，氯化钠，相关玻璃仪器等。 1.2 方法

1.2.1 α-淀粉酶酶蛋白的提取和纯化 1.2.1.1 粗酶提取

测定发酵液酶活力

酶活力高的发酵液合并

离心（12000转/分钟，10分钟

收集上清液 加入2倍体积的

-20℃冷

保存

用时提前水浴溶化 冷冻离心（4000转

混匀后

/分钟，10分钟）量取250mL放入1 再加入100mL

去上清乙醇混合液（统一收集）

-20℃预冷无水乙醇脱水处理 0℃预冷无水乙醇（500mL）

冷冻离心（4000转/

轻摇后

分钟，10分钟）

上清乙醇液（统一

收集）

沉淀室温真空干燥（备用）

1.2.1.2 离子交换层析

装柱平衡调整 准备梯度洗脱液

0.5mol/L NaOH再生 分别加入梯度洗脱仪中（左

测定恒流泵的流速并调整至蒸馏水水洗

冲液平衡

柱子

1.2mL/mL流速上样12min

1.2mL/min

高右低）

更换缓冲液进停泵 连接梯度洗脱器 液10min

（注意排管道内空气）

调节泵速至0.6mL/min，开泵

提前打开所有仪器设备电源，并进行预调节，熟悉仪器 等待10分钟，分部收集器正常转动1管后，离开

启动电脑色谱软件，熟悉软件

12小时以后观察结果，并进行后继

检测

调节紫外检测器，打开1个新的洗

脱色谱图

计时3.5分钟后，打开部分收

集器

设置分部集器（10

管/10min）

1.2.2 酶蛋白生物特性研究

1.2.2.1 最适PH值的测定

准备稀释好的酶液（DNS法测定酶活力，40℃、pH6.0反应显色后，OD540=0.4~0.5）

先配制pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 2倍浓度磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液；

用蒸馏水配制2%马铃薯淀粉溶液（121.3℃，20min处理充分溶解）； 1.2.2.2 最是温度的测定

准备稀释酶液，按要求加入相关试剂

2.结果

2.1 离子交换层析结果

发酵液

所取样品量 （mL或g）

取样量所占样品总量的比例

所测样品酶活力单

位 （U/mL

所测样品蛋白质含量 （mg/mL

总酶活力（U）

总蛋白（mg）

比酶活力 （U·mg-1）

回收率 纯化倍（%）

数

纯化过程

（酶）体积（mL）或酶粉的质量（g）

或U/g） 或mg/g）

171750.0 131564.2 54259.8

发酵酶液

250ml 250ml 1 687.0 50.022 12505.5 13.7 100 1

粗酶粉 离子交换层析 层析后所得

2.97g 1.02g 0.343 2236.2 8.485 499.2 263.6 76.7 19.2

20.18g 16.28g 0.807 843.3 1.792 115.3 470.6 31.6 34.4

17.81g

2.2蛋白含量测定

蛋白质含量测定

2.3 酶活力测定

酶活力测定

2.4 酶蛋白生物特性研究 2.4.1 最适温度的测定：

在540nm下测得稀释5000倍酶液吸光度，带入标准曲线：y=0.5386x+(-0.0131)，计算麦芽糖含量。公式：α-淀粉酶酶活力(U/mL)=（麦芽糖克数×N）/10

分析： 温度30℃至50℃之间酶活力随温度升高逐渐增大且50℃时酶活力达

到最高值；温度50℃至80℃之间酶活力随温度升高而下降。在本实验设计条件下测得最适温度为50℃。 2.4.2 最适PH的测定 ：

在540nm下测得稀释5000倍酶液吸光度，带入标准曲线：y=0.5386x+(-0.0131)，计算麦芽糖含量。公式：α-淀粉酶酶活力(U/mL)=（麦芽糖克数×N）/10

分析：PH在1至4范围内酶活力随PH升高逐渐增大且PH=4时酶活力达到最高值；PH在4至6范围内酶活力随PH升高而下降。在本实验设计条件下测得最适PH值为4。

2.4.3米氏方程与双倒数作图法

在540nm下测得稀释5000倍酶液吸光度，带入标准曲线：

y=0.5386x+(-0.0131)，计算麦芽糖含量。 公式：反应速度V mg/(mL·min)=（麦芽糖克数×N）/10*25 利用1/[S]和1/V进行直线回归：

分析：回归方程为：1/V = 0.042+(0.087)1/[S]； 截距=1/Vmax=0.042；斜率=Km/Vmax=0.087，所以Vmax=23.81mg/(mL·min)，Km=2.0715mg/ml。 2.4.4蛋白质电泳检测——单一蛋白条带

从上图看出，经电泳检测后，蛋白质呈单一条带，没有出现多条带，说明了实验中所用的酶蛋白相对来说比较纯。

2.4.5酶蛋白的分子量测定 （一）标准曲线的制作 蛋白种类 磷酸酶b 牛血清蛋白 卵清蛋白 碳酸苷酶 胰蛋白酶抑制剂 溶菌酶

来 源 兔子肌肉 牛 鸡蛋白 牛 大豆 鸡蛋白

MW（Da） 97,200 66,409 44,287 29,000 20,100 14,300

回归曲线为y=5.072-1.294x

2.4.6酶蛋白分子量计算

相对迁移率mR =样品迁移距离（cm）/染料（溴酚蓝）迁移距离（cm） 以标准蛋白质分子量的对数值（Lg）对相对迁移率作图（计算出回归方程），得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。

从上图可以看出， 经过聚丙烯酰胺电泳检测后，图像呈单一的蛋白条带，说明酶蛋白相对较纯，但是可能由于操作上的原因，蛋白条带不是很明显。由于蛋白质分子量不同，在胶上的迁移距离和速度就不同，这就排除了蛋白质分子所带的电荷和形状影响，从而测定蛋白质的分子量。

以标准蛋白质分子量的对数值（Lg）对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。

回归曲线为y=5.072-1.294x，待测样品相对迁移率为0.21，从标准曲线上查出其分子量为63,096。

3.讨论

通过对α-淀粉酶酶蛋白的提取和纯化实验，使我了解生物酶类的提取方法和

原理，主要有等电点沉淀法，盐析沉淀法，有机溶剂沉淀法，复合沉淀法几种，各有各的优点，酶蛋白提取及操作时需要注意降低温度，尽快纯化，不要剧烈震荡，避免氧化，要避免吸附损失和污染，一提高纯化效率。今后工作中要多注意发酵液留样，测定酶活力时注意控制好温度，准确检验比较分析酶的提取纯度。在对蛋白质纯化时，利用离子交换层析对酶蛋白进行纯化，进一步加深了对聚丙烯酰胺凝胶的理解。

对α-淀粉酶酶蛋白的最适温度时，稀释酶液不需预热，因为酶在高温预热下容易造成失活，不好控制。反应测定时需要直接加入，为使未预热酶加入时对反应体系温度影响最小化，酶浓度在反应体系中又可以保持不变（反应体系中预先加入一定量蒸馏水，可以使加入酶液稀释至原需要浓度），这就需要加入小体积的高浓度（高10倍以上）的酶液（酶液和反应体系的体积比=1：19）。对照管在40℃下反应，先加DNS剂，酶液最后加入。最适PH值的测定，稀释酶液要在测定温度下预热5分钟。

参考文献：

【1】云南大学生命科学学院微生物实验中心程立忠实验讲义

The systematic research on the activity of α - amylase

Z

hu Xiai, Tan Shunyao, Li Xingzhou, Shi Youcai

(College of life science Yunnan University Yunnan Kunming 650500) Abstract: The α - amylase is an important enzyme, it widely used in food processing, food industry, brewing, fermentation, the textile industry and the pharmaceutical industry. Through a series of experiments, on the activity of α - amylase enzyme activity (iodine colorimetry and DNS), α - amylase producing strain (bacterial) purification and detection, strain fermentation screening, screening and determination of enzyme activity, producing α - amylase enzyme composition of culture medium optimization, orthogonal test the α - amylase enzyme protein extraction and purification and enzyme (purified) determination of biological characteristics of seven aspects of the system, to further deepen to the understanding of enzyme properties, improving the practical operation ability. Keywords: α - amylase, enzyme activity, strains, orthogonal test