烟草转基因研究进展黑龙江农业科学

（）：黑龙江农业科学２０１２７１４８～１５２

ＨｅｉｌｏｎｉａｎＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ烟草转基因研究进展

吕　靖，蒿若超，张文英，武美燕

（）长江大学农学院，湖北荆州４３４０２５

摘要：综述了近十年来的烟草转基因研究各方面取得的进展和存在的问题。重点对烟草转基因方法、外植体选择、烟草转抗旱基因研究、转抗病基因研究、转抗寒基因研究、转耐盐基因研究、转抗虫基因研究、转抗金属探讨了目前烟草转化工作中存在的问题并对逆境基因研究和其它烟草转基因相关领域研究现状进行综述，其进行展望。

关键词：烟草；转化；转化植株表现；转基因植株检测

（）中图分类号：Ｓ５７２　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００２２７６７２０１２０７０１４８０５－－－

同时由于其易进　　烟草既是重要的经济作物，

所以成为植物行组织培养和得到再生转化植株，

学科的重要研究对象，并作为模式植物在植物生

１］

。转基因烟草命科学研究中发挥着重要的作用［

介导法中常选用叶盘法，选用的叶面积一般以

２

为宜。或叶片直接用于基因枪，激０．５～１．０ｃｍ光束等射击。例如参照Ｄａｎｉｅｌｌ的方法制备包裹

，载体Ｄ并用ＰＮＡ的金粉微弹（０．６μｍ）ＤＳΦ－

［］５］

／叶盘法［１０００Ｈｅ型基因枪轰击叶片的应用４，转化烟草，培育转基因植株等研究作用上都是采用了烟草叶片。

是通过植物基因工程技术将编码特殊性状的外源通过生物、物理或化基因构建到植物表达载体上，

学等方法，导入受体烟草细胞或组织中，然后由受体细胞或组织再生得到烟草植株及其后代。通过转基因烟草育种途径，可在较短时间内培育出烟快速提高烟草抗病性、抗虫性等抗逆能草新品种，

力，从而间接地减少化学农药的使用，减轻环境

２］

。污染［

２　烟草转外源基因研究

在烟草转基因研究中，通常以提高抗逆性为最主要研究目的，分别有提高抗旱性、抗病性、抗

寒性和耐盐性等抗逆能力。随着深入研究发现，

６］

。植物的胁迫应答反应是由多基因协同控制的［

１　烟草转基因技术研究

１．１　转基因方法

从文献统计来看，我国转基因技术主要从２０００年开始快速发展起来。转基因技术种类繁目前对于植物转基因来说，主要采用农杆菌介多，

３］

。前者属于载导法、基因枪法和花粉管通道法［

以传统育种技术可以改良品种，但此技术盲目性大、效率低、周期长。随着生物技术的快速发展，

利用此技术，并辅以传统育种技术提高植物抗逆性，其目标性强、效率高、周期短。因此，通过烟草转基因研究在烟草抗性育种工作上得以广泛

］７８－

。应用［

体介导转移，后两者属于直接基因转移。农杆菌现在由于发介导法最初只能被用于双子叶植物，

现乙酰丁香酮是农杆菌介导法使用的关键，所以现在农杆菌介导法在单子叶植物转基因中也被广泛利用。

１．２　外植体选择

烟草的遗传转化多选用叶片为外植体。如在

２．１　烟草转抗旱基因研究

近几年，我国烟草种植受到干旱影响比较严重。由于干旱原因导致烟草产量及内在品质性状有所下降，例如上中等烟比例减少，叶内还原糖含量下降，总氮和烟碱含量升高，主要香气物质含量

］９１０－

。因此，减少，香气质量变差［烟草抗旱性的研究深受重视。国内外研究人员通过转基因抗旱育

１１］

种途径，取得了很好的效果。喻娜等［通过农杆

收稿日期：２０１２０４２０－－

，第一作者简介：吕靖（女，江苏省绍兴市人，在读学１９８８－）

从事烟草转双价抗菌基因研究。士，

，通讯作者：蒿若超（男，内蒙古自治区乌海市人，博１９７７－）

：士，助理研究员，从事油菜转基因育种研究。Ｅ－ｍａｉｌｈａ－

ｏｒｕｏｃｈａｏ６３．ｃｏｍ。＠１

菌介导方法，将从新疆小拟南芥中克隆得到的

得到了抗旱性显著ＡＤ基因转化到烟草中，ｐＨＲ

１２］

提高的转基因烟草植株。李新玲等［的研究表

明，利用ｒ在ｄ２９Ａ作为构建基因载体的启动子，逆境胁迫下能够启动目的基因的超量表达，从而

１４８

７期烟草转基因研究进展　　吕　靖等：

综述

大大提高植物抗逆性，为烟草转基因抗旱育种提

１３］

供了可行方法。李文正等［研究表明，番茄

抗病毒烟草品种中的效果。

赤星病也严重危害我国烟草产量及经济效益

的一种真菌性病害。由于烟草赤星病的发生受气候条件及烟草本身素质和病原菌致病性差异的影

］２２２４２５］－

。方玉达等［响［通过根癌农杆菌介导，将水稻几丁质酶基因ｎ表达的子ｔａｒ导入烟草，Ⅱ和ｂｐ

一代转基因烟草表现出对烟草赤星病病原菌的抗

２６］

将烟草碱性β性。蓝海燕等［１，３－－葡聚糖酶及菜豆碱性几丁质酶基因构建了组成型表达的双价

植物表达载体ｐ活体接菌试验ＢＬＧＣ转化烟草，转基因植株与对照相比，对赤星病的侵初步表明，

染具有较强的抵抗能力。

２．３　烟草转抗寒基因研究

在提高作物耐寒性上，抗冻蛋白起了举足轻

，重的作用。抗冻蛋白（是ｒｏｔｅｉｎａｎｔｉｆｒｅｅｚｅＡＦＰ）　ｐ一类具有提高生物抗冻能力的蛋白质类化合物的

维持总称。它能阻止体液内冰核的形成与生长，从而保护生物有机体免受结体液的非冰冻状态，

２７］２８］

。王艳等［冰引起的伤害［据已构建的大豆叶绿体表达载体ｐ设计特异性引物，将昆虫抗ＪＹ０１，冻蛋白基因ＭｐＡＦＰｌ４９插入此载体中构成叶绿

体表达载体ｐ利用基因枪轰击ＪＹ０１ＡＦＰｌ４９，－Ｍｐ法转化烟草且经过潮霉素筛选，经零下ｌ℃低温处

。结果表明，理３ｄ叶绿体型转基因烟草的耐寒表

２９］

型优于野生型烟草。甄伟等［利用从拟南芥中克隆的抗冻蛋白基因通过叶盘法导入到烟草内。

ＪＥＲＦｓ基因在烟草体内超表达可激活中下游抗

从而能够明显提高烟草抗旱逆功能基因的表达，１４］

性。戴秀玉等［成功将海藻糖合成酶ｏｔｓＡ基因转入烟草，得到的转基因植株在耐旱性方面明显提高。国外研究学者在烟草抗旱转基因研究做了

［５］

成功地将甘露糖大量的工作。Ｔａｒｃｚｎｓｋｉ等１ｙ

醇－提高了烟草根细１－磷酰脱氢酶基因转入烟草，

胞的渗透能力，增强烟草根部吸收水分的能力，从而提高烟草的抗旱能力。脱落酸与植物逆境适应

［６］

关系密切，将脱落酸（诱导基因Ｉｍａｉ等１ＡＢＡ）转入烟草后，在干旱胁迫下诱导转基因烟草体内

产生大量Ａ从而提高了烟草抗旱性。ＢＡ，２．２　烟草转抗病基因研究

烟草病害严重，我国记载的就有近４０种。苗期病害以炭疽病最为严重，其次是立枯病和猝倒花叶病和黑胫病发生最为普病。在大田生长期，遍，危害也最严重。在高温高湿的烟草种植区，青枯病常常造成毁灭性危害。此外，局部地区也因为赤星病、蛙眼病、白粉病和根结线虫病造成严重危害。以研究广泛性及成熟性主要讨论两种：烟

，草普通花叶病毒（ＴｏｂａｃｃｏＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓＴＭＶ）　　病以及赤星病。

烟草在整个生育期均可感染烟草普通花叶病

在一般年份的发病率约为２严重的达毒，５％，

［７］１８］

。陈青等［在烟草花叶病毒移动蛋５０％以上１

白基因的研究上，根据烟草花叶病毒蚕豆株系（的已知序列合成引物，经ＰＴＭＶ－Ｂ）ＣＲ扩增

通过电解质渗漏法检测转基因烟草的抗寒性，结

果显示转基因烟草抗寒性有一定的提高。任艳利

３０］等［利用ＰＣＲ及染色体步移法从新疆小拟南芥

获得ＴＭＶ－基因。利用载体Ｂ的移动蛋白（ＭＰ）

启动子Ｃ通过三亲交配ａＭＶ３５Ｓ控制下，ＢＩ１２１，ｐ

及叶盘法将基因导入烟草，转化植株抗病性显著

１９］

提高。鲍威尔等［将ＴＭＶ病毒外壳蛋白基因（导入烟草体内，得到转ＴＭＶ外壳蛋白基ＣＰ）

２０］

因的烟草工程植株。赵明敏等［将同源于ＴＭＶ外壳蛋白的ＳｉＲＮＡ通过农杆菌介导方法导入烟草内，发现其对ＴＭＶ的侵染有干扰作用，大大减轻了转基因烟草感染ＴＭＶ的枯斑数。律凤霞２１］等［依据Ｒ以ＴＭＶ复制酶基因ＮＡ干涉机制，为靶标基因，经Ｒ构建Ｔ－ＰＣＲ反应获得靶序列，靶序列反向重复结构的ＲＮＡ干涉双元载体。用根癌农杆菌介导法，培育转基因植株。结果表明，试验培育的ＲＮＡ干涉转基因烟草６７％对ＴＭＶ呈现高度抗性，并证实了ＲＮＡ干涉技术在培育

的基因组中克隆ＣＢＦ基因的同源序列

构ＤＱ２０７４０４。以植物表达载体ｐＢＩ１２１为基础，建了由组成型启动子３５Ｓ调控ＡＣＢＦ的表达载ｐ

采用叶盘法转化ＣＢ１１１。通过根癌农杆菌介导，ｐ

烟草，ＰＣＲ检测初步证明ＡＣＢＦ基因已整合到ｐ

烟草基因组中，转基因植株在低温、干旱和高盐胁

［１］迫下的耐性都可提高。Ｚ将水稻基Ｏｈａｏ等３ｓ－

使转基因烟草比野生ＳＰＸｌ基因分别转入烟草，

型更耐寒。

２．４　烟草转耐盐基因研究

由于人类不合理的开发大自然，已造成全世

８２８２　　

盐碱土地。在我国１×１界３．８×１０ｈｍ０ｈｍ

［２］

。我国有盐碱耕地中就有１０％耕地为盐渍化３

２（，地１国土资源数据）严重影响我国０００万ｈｍ　

农业产量的发展。培育耐盐植物刻不容缓，烟草

１４９

综述

　　　　　黑　龙　江　农　业　科　学７期

作为双子叶植物的模式生物，国内外学者在其研

３３］

究上也取得了一定成效。刘文奇［等将ＯＰＢＰ１基因对烟草进行遗传转化，获得的转ＯＰＢＰ１基

经鉴定，该转基因烟草植株的耐盐因的烟草植株，

３４］

能力明显增加。张海娜等［利用小麦超氧化物歧化酶基因Ｔ采用农杆ａＳＯＤ１．１和ＴａＳＯＤ１．２，

３９］

利用人工合成的密码子优化后用。王友如等［

的透明颤菌血红蛋白（基因与人工合成的ＶＨｂ）

ＧＦＭｃｒＩＡ基因构建成双价基因植物高效表达ｙ

通过根癌农杆菌介导转化烟草，研究结果表载体，

明此转基因植株既高产又具有抗虫性。Ｇｕｌｂｉｔ－

［０］—Ｏ利用Ａｔｉｎａｒｉｃｉ等４ｏＰＲｌ作为启动子构建ｃｒｌＡｃ基因表达载体对烟草进行遗传转化。转ｙ

基因烟草植株受到机械损伤后，ｃｒｌＡｃ蛋白含量ｙ

菌介导的遗传转化技术，获得了过量表达Ｔａ－

ＳＯＤ１．１和ＴａＳＯＤ１．２的转基因烟草植株。在与对照相比，在生理生化表达差异ＮａＣｌ处理下，

３５］

上表明转基因植株耐盐性提高。秦智慧等［发

该酶属于Ｄ现ａｅｄＳ基因编码产生ＡＣＣ脱氨酶，－可以降低逆境乙烯的合成量。Ｃｓ脱巯基家族，ｙ

利用农杆茵介导的叶盘法将ＣａＭＶ３５Ｓ２启动子－和ｒｏｌＤ启动子驱动下的ａｃｄＳ基因转入烟草

在含有卡那霉素的ＭＳ培养基上ＮＣ８９叶片中，

＋

。转化烟草分析结果表明，与对筛选得到Ｋａｎ

照相比，两种启动子驱动下的转基因烟草耐盐性

迅速增加，对棉铃虫和烟草天蛾起到很强的毒性

作用。

２．６　烟草转抗重金属逆境基因研究

随着工业的迅猛发展，重金属污染也日益显著。为保证植物正常生长，对于抗重金属逆境的

４１］研究必要性不可小觑。姜廷波等［利用农杆菌

介导法将大豆铁蛋白基因ＳｏＦｅｒｌ和内源反义铁ｙ蛋白基因ＮｔＦｅｒ２的ｃＤＮＡ分别导入烟草基因组。将转基因株系移栽到铁离子浓度不同的培养转大豆铁蛋白基中生长２个月后进行比较表明，

基因烟草株系的生长量明显高于非转基因烟草株

系，而转内源反义铁蛋白基因烟草株系的生长量则明显低于非转基因烟草株系。铁蛋白过量表达提高了烟草耐低铁能力，而铁蛋白抑制表达则降

４２］低了烟草耐低铁能力。支立峰等［将飞蛾豆

结果表明转基因５ｃｓ基因转化到烟草中并表达，ｐ

均有增强。但是ｒｏｌＤ启动子驱动下的转基因植

［６］

株的耐盐性最强。Ｄ将含有甜菜碱合成ｕａｎ等３

＋

／基因的转基因烟草植物与含有液泡膜ＮａＨ＋

逆向转运蛋白基因（的转基因烟草通过ＡｔＮＨＸ）

有性杂交的方式，将甜菜碱合成基因和液泡膜＋／ＮａＨ＋逆向转运蛋白基因整合到烟草植物中，获得了含这两个异源基因的转基因烟草。在细胞和整株水平上进行耐盐性鉴定，结果表明含有这两种异源基因的植株比单独转入其中一个基因的

［７］

利用差显杂转基因株系耐盐性更高。Ｇｕｏ等３交法在棉花ｃＤＮＡ文库中找到一个锌指蛋白基

，因Ｇ将该基因在烟草中超表达后发现转ｈＺＦＰｌ基因烟草对耐盐性有所提高。

２．５　烟草转抗虫基因研究

虫害在作物生长过程中不可避免。据报道全世界每年因虫害造成的损失约占农作物总收获量的２０％～３０％。烟草是最早应用分子生物学和基因工程研究的作物之一，自１９８７年首次获得转

植物转抗虫基因研究获Ｂｔ内毒素基因烟草以来，

得长足发展，尤其是烟草作为模式植物，已经形成

一套较为成熟的转基因技术流程，获得一大批抗

３８］虫转基因烟草品种。韩蓓等［将苏云金芽孢杆菌ｃ构建了核心毒素基因表达载ｒ１Ａａ进行改造，ｙ

烟草的细胞中脯氨酸的含量明显增加，细胞与重

４３］

将印度金属镉的结合能力提高４倍。魏嵬等［

芥菜的植物络合素合酶基因ＢＰＣＳ１转入烟草ｊ

中，经过生理指标测定，转基因烟草的脯氨酸含量、可溶性糖含量、丙二醛含量明显高于对照品种，转基因烟草表现出对重金属镉、锌、镍较强的

４４］抗性。陈虹等［将柽柳的金属硫蛋白基因转化到烟草中，转基因植株对重金属镉的抗性比对照

显著提高。

２．７　其它

除了提高植物抗逆性以外，以人类应用为目的的转化也开始快速发展。出现很多以烟草转化为媒介，向人类生产生活息息相关的研究领域发

４５］

展，实现多学科之间的贯通。例如，陈超等［的研究将构建的高效表达人源抗狂犬病毒单克隆抗体载体通过叶盘法转化到烟草中，经过检测发现，６株烟草均成功表达人源抗狂犬病毒抗体。黄丽

４６］

华等［将薤白ＥＰＳＰｓＡ基因转入烟草品种

获得转薤白ＥＷＳ３８中，ＰＳＰｓＡ基因烟草。该转基因烟草的愈伤组织及幼苗表现出对草甘膦有较

并对烟草进行遗传转化。转基因烟草对初孵体，

棉铃虫致死率平均到达６对初孵甜菜夜蛾０％的，平均达到７最高致死率均可达到０％的致死率，

并对昆虫的生长发育有明显的抑制作９０％以上，１５０

７期烟草转基因研究进展　　吕　靖等：

综述

４７］

强的耐受性。李缨等［建立植物中表达乙型肝

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ＢＩＡｌ３０１中，并将重组的载体转入农杆菌再通过农杆菌浸染的方法转化烟草。ＬＢＡ４４０４，

对筛选所得的转化苗进行鉴定。结果转化株叶片进行β染色呈蓝色，表明靶ＧＵＳ）－葡萄糖苷酸酶（基因被转人烟草并表达。结论表明烟草能够成功地表达乙型肝炎表面抗原。刘惠荣等

［４８］

通过农

杆菌介导法将毛白杨ＣＣｏＡＯＭＴｃＤＮＡ反向导　入烟草。ＰＣＲ、ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ点杂－交检测表明，ＣＣｏＡＯＭＴｃＤＮＡ已反向整合到烟　

草基因组中并在转录水平表达。将转基因株系移栽温室３个月后，以Ｋｌａｓｏｎ法测下部茎木质素含量。与对照相比，大部分转基因株系木质素含量均有不同程度的下降，其中下降最多的达３７％，表明抑制植物内源ＣＣｏＡＯＭＴ的表达可有效地降低木质素含量。

３　存在的问题及今后研究展望

烟草作为转基因研究的模式植物，在转基因研究方面取得了很大的成果，通过转化方法获得的高抗性烟草植株在生产中得到广泛应用。但随着烟草转基因的研究越来越深入和范围越来越广，研究中出现的问题也越来越多，主要表现在转基因沉默、基因漂移、转基因抗病植株抗性不稳定以及抗病性转基因的生态威胁、转基因植株生长发育异常、转基因导致器官变异以及对烟草品质的影响。但是，技术上存在的缺陷是可以在研究中得到完善的。在今后研究方面，研究学者应加强基础性研究与实际生产生活密切联系，不仅要

保证农业生产上的高培育出高抗性的转化植株，

产优质，同时还要拓宽研究领域，借助烟草转化的平台，为其它植物的转基因研究提供参考，挖掘有

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１５１

综述

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　　　　　黑　龙　江　农　业　科　学７期

ｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｆｕｎａｌｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｓａｌｔ　　　　　　　－ｇｔｏｂａｃｃｏｂｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｗｉｔｈＧＺＩＲＤ２ｌＡａｎｄＧＺＩＰＲ５ｅｎｉｃ　　　　　ｙｇｇ　　

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［］，，，３７ｕｏＹｉｎｈｕｉＹｕＹｕｅｉｎＷａｎＤｏｎｅｔａｌ．ＧｈＺＦＰ１，ａ　Ｇ　　　ｇｐｇｇｇ　

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