荧光定量pcr原理
中山大学
博士后研究工作报告糖原合成酶激酶-3B对恶性胶质瘤细胞分
化的影响及机制
Effectandmechanismsofglycogensynthasekinase一3B(GSK-3肛)ondifferentiationof
malignantgliomacells
英文缩略语
DMEM
FBS
EDTA
MTT
PBS
DT,r
SDS
GFAP
RNAi
siRNA
GSK一3B胛Y删1㈣”㈣%㈣删—●肌I主要英文缩略词表英文全称中文全称Dulbecco’SModifiedEagleMediumDMEM培养基佗talbovineserum胎牛血清ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt乙二胺四乙酸3一(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide四甲基偶氮唑蓝phosphate-bufferedsaline磷酸缓冲液dl-dithiothreitol二硫苏糖醇sodiumdodecylsulfate十二羟硫酸钠fibrillaryacidprotein胶质纤维酸性蛋白RNAinterferenceRNA干扰smallinterferingRNA小干扰RNAsynthasekinase-3p糖原合成酶激酶-3Dglialglycogen
中文摘要
目的:研究糖原合成酶激酶一3B(GlycogenSynthaseKinase,GSK一3B)对恶性胶质瘤细胞分化的影响及其机制。
结果:Westernblot结果显示,GSK-3B蛋白表达在对霍乱毒素诱导分化敏感的恶性胶质瘤C6、U-87MG细胞株中显著高于对霍乱毒素诱导分化不敏感的U-251、T-98G细胞株(尸<0.05)。体外激酶实验显示,在胶质瘤细胞诱导分化过程中GSK-3B激酶活性明显增强。使用GSK-3B抑制剂或RNA干扰沉默GSK一3B表达,可抑制霍乱毒素诱导的敏感细胞株C6、U-87MG的分化。重组质粒介导GSK-3B过表达,与空质粒组相比,GSK-3B过表达可使对霍乱毒素诱导分化不敏感的0-251、U-87MG胶质瘤细胞重新分化。激光共聚焦及Westernblot实验证明,GSK-3B激活后从细胞浆进入细胞核,启动胞核内cyclinD1出核,cyclin被胞浆中蛋白酶水解,从而控制胶质瘤细胞分化。免疫组织化学法检测29例人恶性胶质瘤组织组织和8例正常脑组织,GSK.3D在人恶性胶质瘤组织高表达。结论:GSK-3B是调控恶性胶质瘤细胞分化的关键分子,激活的GSK一3B以细胞浆/核迁移方式入核诱导cyclinD1核/浆迁移、降解从而控制恶性胶质瘤的诱导分化。
Abstract
Malignantgliomaspersistasamajordiseaseofmorbidityandmortalityinadult.Differentiationtherapyhasemergedasapromisingcandidatemodality.However,themechanismrelatedisunknown.Hereweshowthatglycogensynthasekinase一3B(GSK-313)ishighlyexpressedandactivatedduringthecholeratoxin-induceddifferentiationinsensitiveC6andU87一MGmalignantgliomacells.GSK一3DinhibitorsorsmallinterferingRNAsuppresstheinduced—differentiationinsensitiveC6cells.Conversely,overexpressionofaconstitutivelyactiveformofhumanGSK一3D(pcDNA3一GSK一3D—S9A)mutantinresistantU251gliomacellsrestorestheirdifferentiationcapabilities.Inaddition,GSK-3ptriggerscyclinD1nuclearexportandsubsequentdegradation,whichisnecessaryfordifferentiationinC6andU251gliomacells.AnalysisofhumangliomatissuesfurtherrevealedGSK一3pasahallmarkofcancercell’Sdifferentiationpotential.ThesetimingssuggestthatGSK-3Disadifferentiationfatedeterminant,andshednewlightsonthemechanismbywhichGSK-3BregulatescyclinD1degradationandcellulardifferentiationingliomas.
己I√I吉口
胶质瘤是中枢神经系统内最常见的原发性肿瘤。其侵袭性强,恶性程度高,生长快,病程短,治疗效果差,是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一【l】。目前手术治疗仍是脑胶质瘤的首选治疗方法,但难以做到真正的彻底切除,术后复发快,患者生存期短。其它治疗包括放射治疗、化疗、基因治疗、免疫治疗,疗效仍差,死亡率居高不下,总体生存期仍然没有显著提高【2'31。我们必须从其它方面着手,努力去寻找治愈胶质瘤的新策略。
癌细胞的诱导分化和分化疗法作为肿瘤治疗的一条新的途径,近年来研究非常活跃。该疗法促进幼稚的分化肿瘤细胞回转到成熟的分化型遗传学途径上来,进而逆转肿瘤细胞的恶性表型,从而达到治疗的目的。其特点在于不杀伤肿瘤细胞,而是诱导肿瘤细胞分化正常或接近正常细胞。诱导分化对肿瘤细胞不是杀灭而是一种“细胞改造"措施,对正常细胞不产生毒副反应作用H1。前期研究发现一种生物毒素霍乱毒素可诱导恶性胶质瘤细胞分化嘲。但这种分化的机制目前并不清楚。
~
糖原合成激酶3[3(glycogensynthesisl(ir潞e一3p,GSK一313)是一种多功能丝氨酸/苏氨酸激酶,是糖原代谢过程中的重要限速酶。GSK.3D还可通过磷酸化多种底物蛋白,参与多种细胞生理过程的调节,包括胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、血管生成、微管的稳定与细胞运动等[61。GSK.3D与肿瘤的关系目前报道很少,且这些研究的结果并不一致。一部分观点认为GSK.3p可一部分观点认为GSK.3p可通过调节Wnt/13-catenin信号通路,使癌基因IB-eatenin磷酸化而降解:从而抑制肿瘤增殖【7,8】;另一种观点则认为GSK.3p可通过上调NF.kB介导的基因转录,起到促进细增殖、抑制凋亡的作用【9,101。这些研究都集中于GSK.3p对肿瘤细胞增殖与凋亡的作用,GSK.3D是否与恶性肿瘤的分化相关,目前报道很少。Ougolkov发现GSK.3D聚集于低分化的胰腺癌细胞核中,抑制GSK.3p活性可抑制胰腺癌细胞的增殖。而GSK.3p是否与恶性胶质瘤诱导分化是否相关,国内外尚未见相关报道。
材料和方法
1.材料
1.1细胞
1.1.1细胞株培养
C6大鼠胶质瘤细胞株,人U87.MG,U251,T98G胶质瘤细胞株均购自ATCC(AmericanTypeCultureCollections,USA)。
1.1.2人胶质瘤细胞的原代培养
3
超净台内取出瘤组织块,PBS漂洗,用眼科剪剪成lrain大小的组织块,然后在含0.25%胰酶的消化液中37℃磁力搅拌消化10min,加入血清终止消化,滤网过滤,离心800rpm5~8min,弃上清,加入条件化培养基(RPMll640+10%FBS+lOOU/ml青霉素/链霉素),轻轻吹打。调整细胞浓度为lx106/ml,转至培养瓶,置入5%C02、37℃恒温、保湿细胞培养箱培养。
1.2主要试剂及配置
1.2.1主要试剂
高糖型DMEM(Dulbeceo’SModifiedEagleMedium):Gibco,Invitrogen,USA;胎牛血清(FetalBovineCalfSerum,FBS):PAA,Australia;
二甲基亚砜(Dimethylsulfide,DMSO):Sigma,USA;
胰蛋白酶(Trypsin):Gibco,Invitrogen,USA;
乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt,EDTA):上海生工:
青一链霉素Penicillin/Streptomycin:Invitrogen,USA;
Forskolin(Forskolin):Sigma,USA:
四甲基偶氮唑蓝(四唑蓝,3一(4,5-dimethylthiazol一2-y1)一2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT)-Sigma,USA:
Hochest333258:Sigma,USA:
脱氧核糖核酸酶(RNAase):BoehringerMannheim,Germany;2
Triton—X100:Sigma,USA;
GFAP:Cellsignalingtechnology,USA;
生物素.羊抗小鼠二抗:武汉博士德;
DAB试剂盒:武汉博士德;
1.2.2试剂配置
1.2.2.1DMEM培养基:
高糖型DMEM培养基粉剂13.5g,碳酸氢钠3.7g溶于1000ml去离子三蒸水,磁力搅拌l"--2h。过滤除菌,分装,4℃保存。每100mlDMEM培养液加10ml胎牛血清、青霉素和链霉素各10万单位。
1.2.2.2消化液
O.5g胰酶,0.02gEDTA充分溶解fl000ml磷酸缓冲液(phosphate—bufferedsaline,PBS)(0.01mol/L,PH7.4),磁棒搅拌3"一4h,过滤除菌,分装,--20℃保存。
1.2.2.3细胞冻存液:
由DEME完全培养液和DMSO按9:l配制而成。
1.2.2.4PBS缓冲液:
准确称取0.20gKCI,0.20gKH2P04,8.00gNaC!,2.89gNa2HP04.12H20溶于1000ml三蒸水中,5.6%NaHC03调PH值7.0~7.2之间。高压灭菌,4。C保存备用。1.2.2.5MTT溶液
250mgMTT溶解于30mlPBS(0.01mol/L,PH7.4)在电磁力搅拌器上搅拌30min,0.22gm的微孔过滤器除菌,分装,4。C保存,两周内有效。
1.2.2.6碘化丙碇(propidiumiodide,PI)储存液
准确称取PI5mg,RNA酶O.5mg,加蒸馏水至10ml,5.6%NaHC03调PH3
值7.2~7.4,置于4"C避光保存。
1.3主要仪器
洁净工作台:HealForce,HongKong;
倒置相差显微镜:Nikon,Japan;
C02细胞培养箱:Heraeus,Germany;
高速离心机:Eppendo吒USA;
台式低温高速离心机:Eppendo吒USA;
加热磁力搅拌器:IKA@.WERKEGmbH&Co.KG,Germany;
EXL800酶标仪:Bio.TekInstruments,Germany;
自动酶联免疫检测仪Model2550:Bio--Rad,USA;
FACScanCalibur流式细胞仪:BectonDickinson,Germany;
2.方法
2.1细胞培养
2.1.1C6细胞培养
胶质瘤细胞株按常规方法生长在含10%胎牛血清、100U/ml青霉素及100I-tg/ml链霉素的DMEM完全培养基中,置5%c02,37℃恒温密闭式孵箱(相对湿度95%)内培养传代,倒置显微镜观察生长情况。约2"-'3天传代一次,取处于对数生长期细胞用于正式实验。
2.2细胞形态学观察
10州ForSkolin分别作用2、6、12、24、48、72h时,在倒置相差显微镜下观察细胞形态学的变化情况。以l‰DMSO作为溶剂对照(下同,不再特殊表明)。
2.3GSK-311干扰
以24孔细胞培养板为例,常规消化收集细胞后,将细胞接种于24孔培养板。转染前一天换用不含抗生素、含有血清的培养基。待细胞生长至密度为40%~4
50%时,进行转染。用不含抗生素和血清的培养基将LipofectamineTM20004ttl稀释至100pl,混匀后室温放置10min,然后将l4pl10laM的siGSK.3D加入上述稀释液,吹打混合均匀,室温放置20min。500lal完全培养液稀释以上稀释液后加入培养孔中。转染后48h进行实验。
2.4重组质粒介导GSK-3p过表达
pcDNA—GSK-3pS9A质粒(Emory大学毛子旭教授惠赠)实验室馈赠,扩增后使用EndofreePlasmidMaxiKit(QIANGEIN)试剂盒抽提质粒,酶切、测序鉴定。细胞密度为70"--'80%时,分别用50plOpti.MEM稀释2pl脂质体转染试剂LipofectamineTM2000和0.8pg的HIF.1a过表达质粒,混匀后室温放置5min,然后将两者混合均匀,室温放置20min,加入含500pl完全培养液的细胞培养孔中。RT-PCR、Western.blot观察瞬时转染pcDNA.GSK.3DS9A效率,检测转染pcDNA.GSK.3BS9A对C6细胞分化的作用,以pcDNA3.0为阴性对照。
2.5激光共聚焦
去除培养基,固定,封闭液封闭,GSK.3D、cyclinDI单克隆抗体孵育过夜,再分别以cy3或ey2标记的相应二抗孵育45min,PBS漂洗后Hoechst33258孵育5min,漂洗,激光共聚焦显微镜明确GSK.3B、cyclinDI在霍乱毒素诱导的恶性胶质瘤细胞分化过程中的亚细胞定位,以及GSK.3p基因沉默及过表达恶性胶质瘤细胞在霍乱毒素作用下GSK.3D、cyclinD1亚细胞定位。
2.6免疫组化
细胞爬片置于35m/ll培养皿内,10ng/ml霍乱毒素处理48h后,取出爬片,磷酸缓冲液(phosphate.bufferessaline,PBS)中浸洗后,4%多聚甲醛固定20min,PBS浸洗5minx3次,甩去多余液体,新鲜H202封片室温处理20min以消除内源性过氧化物酶活性。PBS缓冲液中浸洗5minx3次。滴加正常山羊血清封片室温孵育20min,不洗,甩去多余液体。滴加一抗(PBS代替一抗作为阴性对照),湿化盒中4"12过夜。甩去多余液体,PBS液冲洗5minx3次。拭去多余液体,滴加生5
物素标记的二抗,置于37℃温箱孵育30分钟。甩去多余液体,PBS液冲洗5minx3次。拭去多余液体,滴加链霉素抗生物素一过氧化酶标记的抗体液置于37℃温箱孵育30min。甩去多余液体,PBS液冲洗5minx3次。DAB显色使用武汉博士德生物技术有限公司DAB显色试剂盒。取蒸馏水lml,加试剂盒中A,B,C液各一滴,混匀后加至切片。室温下显色,显微镜下观察,控制反应时间,蒸馏水浸洗中止反应。显微镜观察结果。
2.7蛋白免疫印迹
2.7.1材料
主要试剂:丙烯酰胺(Acrylamide),N,N'-亚甲基丙烯酰胺(Bis—Acrylamide),二硫苏糖醇(DTD,甘氨酸(Glycine),十二羟硫酸钠(SDS),TEMED"Sigma,美国;过硫酸铵(ammomiumpersulfate),Tris:GibcoBRL,美国;Tween-20・Fluka,美国;脱脂奶粉(Non-fatdrymilk):Bio.Rad,USA;0.451amPVDF纤维素膜:BoehringerMannheim,德国;GFAP、PCNA、13-actin抗体:CST,美国;Anti—mbbit-IgG—HRP,Anti—mouse—IgG-HRPAmi-biofin-IgG-HRP,LumiGLO@Reagent和Peroxide化学发光剂盒,BiotinylatedProteinMarker(BroadRange):NEB,美国;分析纯甲醇(methan01),中速定性滤纸,保鲜膜,纤维垫片:国产;通用显影粉,酸性定影粉:广州天朗涂料化工有限公司;5x7inchX—myfilm-Fuji,日本。BCAproteinassaykit:hyclonepierce,USA;nuclearextractkit:activemotif,USA:
主要仪器:Mini.PROTEINIICell型垂直板电泳仪,MiniTrans.BlotTransferCell型转移电槽,PowerPae300型电源:Bio.Rad,美国;曝光盒,中速增感屏:国产。
缓冲液配方:
转移缓冲液
25mMTrisbase
0.2Mglycine
20%methanol(pH8.5)
TBS
50raMTris-HCI(pH7.4)6
150raMNaCl
TBST
50mMTris—HCI(pH7.4)
150mMNaCl
0.1%Tween.20
2.7.2方:法
2.7.2.1制胶:按下表分别配制lO%的分离(separating)胶以及4%的浓缩(stacking)胶2.7.2.2细胞蛋白的抽提
不同药物处理后的C6细胞,弃去培养基,冰冷的PBS洗一遍,弃尽PBS,加100肛ll×SDS[62.5mm。1.L.1晡s.HCI(PH6.8),2%w/vSDS,lo%w/V甘油,50mm01.L以DTT,0.1%溴酚蓝】,静置5min,刮取并收集细胞裂解产物至1.5mlEP管中(以上过程均在冰上操作)。上述样品置于沸水煮5min,10000rpm离,L,30s。2.7.2.3蛋白定量
采用BCAproteinassaykit(Pierce,ine,USA),具体操作按说明书进行。BCA蛋白定量法是基于bicinchoninicacid(BCA)显色的原理设计的,具有不受DTT等还原剂及其他去垢剂干扰的优点,为目前公认的灵敏度和准确性均较理想的蛋白质定量分析方法。本研究在具体操作中采用增强的试管法,标准曲线有效测定7
范围为5-250l_tg/ml,具体操作步骤如下:
a)制备牛血清白蛋白(BSA)标准曲线(相关系数R=0.985)
b)配制BCA检测试剂
+2
2ml含BCA的A液+40ttl含Cu的B液,且PA:B=50:l,室温下混匀,加入10斗l样品,control管加等量双蒸水。
c)置37℃水浴作用30min,冰水混合物冷却5min
d)在蛋白质与核酸测定仪上用562hill波长测蛋白质OD值
e)根据标准曲线计算蛋白质浓度
2.7.2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳
取上清20I_tl,-于200v采用12%的分离(separating)胶以及4%的积)罢(stacking)胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳45min。
2.7.2.5转膜
.1.I
完整的将凝胶取下,于转移缓冲液(25mm01.L
20%(w/vTrisbase,0.2Irtm01.Lglycine,methanol,PH8.5)中静置5m氓转移于转移夹靠负极的一方,将事先在转移缓冲液中浸泡30min的硝酸纤维膜(Porablot,德国,孔径为0.451un)紧贴其上,排除气泡,在转移缓冲液中100v低温转移60min。
2.7.2.6抗体标记
.1.1
取出硝酸纤维膜(NC膜),在1xTBS(20mm01.LTrisbase,137mm01.L‘NaCI)中轻摇5min,用封闭液(1xTBST(1xTBS,0.1%w/vTween.20),5%w/v脱脂奶粉)室温封闭2h,在10ml一抗稀释液中(1xTBST,5%non.fatmilkorBSA)把NC膜和一抗(GFAP及Ki.67一抗的稀释比例均为l:looo)共同轻摇孵育,4"C过夜。次日,用1xTBST洗|NC膜3次(每次15ml,5rain),把NC膜与溶解在10ml封闭液中的与HRP.结合的二抗(适当比例稀释)和HRP-结合的抗生物素抗体(1:looo)室温下共同孵育lh。
2.7.2.7曝光8
用lxTBST洗NC膜3次(每次15ml,5min),与10ml1xLumiGLO(含0.5
底物A,0.5mlml20x20x底物B,9.0ml水)室温下轻摇Imin。排去过量的液体,在暗室中使其与X光片在增感屏中紧密接触,使X光片感光数秒到数分钟。显影,定影,冲洗,晾干,拍照并进行计算机图象分析。
2.8统计方法
所有数据用均数士标准差表示,运用SPSS10.0统计软件包,采用one—WayANOVA方差分析,并且在P<0.05被认为是具有统计意义。
结果
1.CSK-ap在分化过程中激活及高表达
如图l所示,磷酸化的GSK.3D(失活的GSK.3D形式)随时间而逐渐降低,提示GSK.3B激酶在分化过程中激活。提示GSK.3D在恶性胶质瘤诱导分化过程中可能其主要作用。进一步比较可诱导分化的C6胶质瘤细胞株及不可诱导分化的U25l细胞株,发现在可诱导分化的C6细胞株,GSK.3p表达大大高于不可诱导分化的U25l细胞株(>5倍)。9
A
隧蕊秘孽p-OSK-3a&嵋1
GSK-兔
0l3691224
Time(hours)
蝴镰期嘴舷缈。,糍邸s妊3酽
瓣髯瓣鬻憎锋一女c,sg-筇
0l3691224
Time(hours)
B
3
20
0
Tare(hours)
C
移j
霸黑黔零缪’舅篓爹荔—豪添纛罨懑GSK-3p
一镰麟嘲麟期曦缸,一峰GAPDH
C6U87U251T98G
1.2
孳
乏
蒌O.8
昌
墅O.4
墨酲
0
C6一●~工一‘。U87U25l鹳18G
1.GSK一3DisactivatedandhighlyexpressedinC6gliomacells
ofp-GSK一31)ser9andGSK-3plevelsinC6cellstreated诵ml0
choleratoxinforthetimeindicated.(B)ImmunoblotofGSK一3plevelsinthe
celllines.
IOFigure(A)Immunoblotng/mlindicated
2.干扰CSK-3p抑制恶性胶质瘤细胞分化
使用siGSK.3p2号片段,可发现干扰效率达至tJ91.6%,且呈计量依赖性,可有效进行后继试验(图2A、B)。图2C、D显示,成功转染siGSK一3B的C6细胞可成功阻断霍乱毒素引起的细胞形态改变和GFAP上调。提示干扰GSK一3D可抑制恶性胶质瘤细胞分化。
AC—
siRNAs
¨赣燃黝彬css:-3pNoMockNeg群l坭桕
和鬻豢灞瞻
o
,
皇80篇
n
誓∞
o
o40288
}
曩
■
宙撕■■■圆圈圈圈瑚.—●_。。
NoMeekN咯#1嚣2嚣3
B撕”t口q“十i
瓣谬燃蝴镌GSK-3p…Ⅲ物渤劳吁铹~一熟缓GFAP
■,●謦奠黪馨懋GAPDH钥劳—劳—赡——糯铂黪GAPDH
Neg。’’。++。’’’
MockNeg兰墨!壁siGSK-a¥—。‘。。。。。++
siGSK-3p(riM)Cr一+一+一+
Figure2.SilencingGSK-3BabrogatesdifferentiationabilityofC6cells
(A—B)ImmunoblotofGSK-3Dproteinlevelsaftertransfectionwithdifferentnumber(A)orindicatedconcentration03)ofsiGSK一3pfor48h.Mockcontrolcellsreceivedtransfectionreagentonly.(n-3,ttest,幸P<0.05,}幸P<0.01versusthenegative).(C-D)Morphology(C)andimmunoblotofGFAPandPCNAlevels(19)inGSK一3DknockdownC6cellssubsequentlystimulated、啊thcholerato)【infor48h.
3.GSK-3fl过表达启动恶性胶质瘤细胞分化
在霍乱毒素不可诱导分化的U251胶质瘤细胞(其GSK.3p表达低,图IB),使用活化的pcDNA3一GSK一3p-S9A质粒转染,可观察到成功转染GSK一3p.S9A质
粒的U251细胞呈现明显的星形细胞特征,出现较多细长突起,GFAP表达升高,PCNA表达降低(图3A、B)。GSK一3D-S9A对霍乱毒素可诱导分化的U87MG胶质瘤细胞也有相似的作用(图4)。
A
B
糯燃GSK-3p
黼—嘲黪GFAP
捌黪—懈Pc凇
_—一GAFDH
vector●一
S始一手
3・OverexpressionofactiveGSK一3DpromotesdifferentiationofU251glioma
ofU251cellstransfectedwithGSK一3DS9Amutants(S9A)or
vector(pcDNA3).(B)U251cellstransfectedwithGSK一3DS9Aoremptyfor48hfollowedbywesternblottingforGSK-3DandGFAPexpression.12Figurecells.(A)Morphologyemptyvector
A
-—-GSK-3J3
--GAPDH
pcDNA3S9A
B
pcDNA3SgA
Morpllology
Hoechst
33258
Figure4.OverexpressionofactiveGSK-3ppromotesdifferentiationofU87-MGglioblastomacells.CellstransfectedwithGSK一3pS9Amutants(S9A)oremptyvector(pcDNA3)for48hfollowedbymorphologicalevaluationorbywestern-blottingforGSK一3DandGFAPexpression.
4.GSK-3p、cyclinD1核浆转位控制恶性胶质瘤细胞分化
磷酸化的GSK。3B位于胞浆内,是其失活状态,在某些因素刺激下去磷酸活化的GSK.3B从胞浆移位至胞核,在苏氨酸286位点磷酸化位于胞核的cyclinD1,磷酸化的cyclinD1从胞核转位至胞浆,被胞浆中的蛋白酶体降解。我们应用免疫荧光的方法检沉JGSK.3p、cyclinD1的亚细胞定位,图5A可见霍乱毒素作用后GSK.3B大部分位于胞核,而对照组的C6细胞GSK.3fl贝,lJ位于胞浆,提示霍乱毒素可去磷酸活化GSK.3B。而未经处理的C6细胞qbcyclinD1绝大部分位于胞核,经
霍乱毒素作用6h后cyclinDI荧光强度大大降低,可能是转位至胞浆中被降解;而在MGl32预处理的C6细胞中,可清楚的见到绝大部分cyclinDl位于分化的胶质瘤细胞胞浆中。
霍乱毒素可磷酸化cyclinD1,促进其核浆转位,GSK.3B在这种核浆转中起着关键性的作用,阻断GSK一3D的激活即可阻断蛋白酶体对活化的cyclinD1的降解作用(图5A)。U251细胞GSK一3p过表达则可促进对cyclinDl的出核降解作用(图5B)。进一步证明GSK.3p在恶性胶质瘤细胞分化中的重要作用。14
GSK.3BGsK.38
.入hochestICvchnDImergehoch∞'t/CvrlinD1merge
C■●knI佃咖
+MGU|2■
NegsiGSK-3p
BtG辨3P
ICvclinsehDIcmergeohC
●・-●蛐Dl
-●●●蛐
C-okn幻%h・4-・+
liGSK-弛・++
D
S'Acy,-UaDI
CZJ巴工jo—删
Chokra眈m・+・+
・好sK・3p・++
F
。●L●l。yclimDI
Vb“.4--一阳矗
S9A-4-
S’AF田础m
卫。…P…IA-I●—■■■一
Vedof+
S,▲+卫唾G132
Figure5.GSK一3ptriggerscyclinD1nuclearexportanddegradation
(A—B)SubcellularlocationofGSK一3pandcyelinD1inC6gliomacells.CellsweretransfectedwithsiGSK-3p(一)ornegativecontrolsiRNA(awe)for48hfollowedby
treatmentwith10ng/mlcholeratoxinintheabsenceorpresenceof10UMMG132for24h.Cellswerefixedandstainedwithanti—GSK-313(green)andanti-cyclinD1(red).Nucleiwerestainedwithhochest33258(blue).Opticalsectionswerecapturedusingaconfocalmicroscope.(C-F)CyelinD1protein(CandE)andmRNA(DandF)levelsinGSK-3DknockdownC6cellssubsequentlystimulatedwithcholeratoxinfor48horGSK.3BS9AtransfectedU251cells.
6.GSK-3p在霍乱毒素敏感的人恶性胶质瘤组织中高表达
取29例临床恶性胶质瘤组织(II-IV级),发现GSK-3p表达显著高于正常脑组织(表I,图6)。且这些恶性胶质瘤原代培养细胞对诱导分化剂霍乱毒素敏感,GSK.3D抑制剂SB216732、LiCI能抑制霍乱毒素诱导的分化(图7)。16
Table1SummaryofGSK-3[iimmunohistochemistryinhumanmalignant
gliomatissues17
B
59
们
2罗焉
o≤38
譬
摹i
20
3
0+抖卅0一盔酡■■■_
+4-b0¨
GSK-3pp-GSK-3酽16
Figure6.ExpressionofGSK-3pinhumanmalignantgliomatissues.(A)GSK-3pand
immunocytochemistryofstainedsectionsfromrepresentativetissuesof
gliomasandnormalbrains.(B)PercentageofpatientswithmalignantgliomasintheirGSK.3Dandp-GSK.3pY216immunostainingscored+(positivestainingfor<1O%),++(positivestainingfor10-60%),or卅(positivestainingfor>60%1.p-GSK.3BY216primary
AControlCT
一
B一一
一・一’一_p.GSK.31&sets
●-'_一—I',—・GSK.313
036912丝
Tune(ho璐)
C-锄_-—豁・GFAP
—-。_一・一。-—一PCNA{
——,l■-I_II_IGAPDH
CT一+一一一一
SB216732一一++一一
L℃l一一一一++
Figure7.PhosphorylationofGSK-3Dinprimaryhumanmalignantgliomas・(A)Morphology(a-b)andGFAPimmunofluorescence(c-d)inhumanmalignantgliomacellstreatedby10ng/mlCTfor48h.(B)Immunoblotofp-GSK-3p删andGSK-3plevelsinCT-treatedhumanmalignantgliomacells.(C)ImmunoblotofGFAPandPCNAlevelsinhumanmalignantgliomacellspretreatedwith10mMLiCIor10laMSB216732for2handthentreatedwitIlCTforfurther48h.19
诱导分化治疗
胞分化是由幼稚细
程。近年来,肿瘤
种细胞分化紊乱,引起细胞分化抑制的特异性基因在一定条件下是可逆的【11】。诱导分化治疗正是基于上述认识而产生,它可解除肿瘤细胞的发育缺陷,使其进一步分化并逆转其增殖、浸润、转移等恶性表型,使之最终成为正常或接近正常的细胞,从而成为控制肿瘤的一种新途径。
目前分化诱导剂诱导瘤细胞分化的确切作用机制尚未明确,目前认为可能与调节肿瘤细胞周期;调节信号传导通路;调控癌基因表达;细胞因子通路等因素有关。充分了解肿瘤分化过程以及这一过程的调控环节,将有助于恶性肿瘤的诱导分化研究。
我们研究发现,GSK.3D水平与细胞可诱导分化能力密切相关,在霍乱毒素可诱导分化的恶性胶质瘤株GSK.3p高表达,而霍乱毒素不可诱导分化瘤株GSK.3D表达水平低;且GSK.3B活性在胶质瘤细胞分化过程中逐渐升高。强烈提示GSK.3B在恶性胶质瘤细胞分化过程中的重要作用。GSK.3p干扰可抑制胶共聚焦实验进一步确认,在恶性胶质瘤细胞分化过程中伴随GSK.31]/eyclinDI蛋白核浆转位。因此,可以认为,GSK.313可能是恶性胶质瘤诱导分化的标志性蛋白,在特异性细胞诱导分剂存在下,活化入核,与核内的cyclinD1相互作用,
DI出核降解,从而控制恶性胶质瘤的分化。
CyclinDI苏氨酸残基286或288位磷酸化可促进其降解【12,13,141。GSK.3B是目前唯一报道的在n鹏.286位点磷酸化cyclinD1的激酶【151。GSK--3I]去磷酸激
D1磷酸化【l们。磷酸化的cyclinDI
从胞核转位至胞浆,经蛋白酶体泛素化作用发生水解。GSK.36最初认为是调节质瘤细胞分化,而GSK一3D过表达可启动不可诱导分化的胶质瘤细胞分化。激光启动cyclin活后,从胞浆转位至胞核,使位于胞核的cyclin胰岛素反应组织中糖原合成的一个重要的丝氨酸/苏氨酸激酶,胰岛素通过PKB/Akt通路可使GSK3失活从而促进糖原合成;其后的研究发现它参与肿瘤发生、细胞增生、分化及细胞周期调节等多种细胞活动【1他¨。这些功能大多源自其对众多参与这些过程的关键蛋白的磷酸化作用。我们的实验结果显示,霍乱毒素
物学、分子生物学等方法深入探讨GSK一3D在恶性胶质瘤细胞分化过程中的关键性作用,阐明GSK-3B调控恶性胶质瘤分化的信号通路及分子机制。有望为恶性胶质瘤的诱导分化研究提供高度原创的理论成果,并为临床恶性胶质瘤诱导分化治疗提供新的靶点和实验依据。
参考文献
1.TrogD,FountoulakisM,FriedleinA,eta1.Iscurrenttherapyofmalignantgliomas
forpatients?Proteomicsevidenceofshiftsingliomacellsexpressionunderclinicallyrelevanttreatmentconditions.Proteomics,2006,S,WuQ,McLendonRE,eta1.Gliomastemcellspromoteradioresistanceby
activationoftheDNAdamageresponse.Nature,2006,
120):756-760.
WJJr,ScottCB,HortonJ,cta1.RecursivepartitioninganalysisoffactorsinthreeRadiationTherapyOncologyGroupmalignantgliomaNatlCancerInst,1993,85(9):704—710.
LeszezynieckaM,RobertsT’DentP'eta1.Differentiationtherapyofhumancancer:
scienceandclinicalapplications.PhannaeolTher,2001,90:105—156.
Li《Yin形WangX,Zhu彤HuangrYanGCholeratoxininducesmalignant
celldifferentiationviathePKA/CREBpathway.ProcNatlAcadSciUSA.
S,HallA.Cde42regulatesGSK一3betaandadenomatous
colitocontrolcellpolarity.Nature.2003;421(6924):753—756.21beneficialpatterns6:2924.2930.2.Baopreferential444(73.Curranprognostictrials.J4basic5glioma2007;104(33):13438-134436.Etienne-Mannevillepolyposis
7.Hinoi,T.,Yamamoto,H.,Kishida,M.,Takada,S.,Kishida,S.,Kikuchi,A.Complexformationofadenomatouspolyposiseoligeneproductandaxinfacilitatesglycogensynthasekinase-3beta-dependentphosphorylationofbeta-cateninanddown—regulatesbeta-catenin.JBiolChem.2000,275,34399—34406.
8.RaskK,NilssonA,BrannstromM,eta1.Writsignallingpathwayinovarianepithelialtumours:increasedexpressionofbeta-cateninandGSK3beta.BrJCancer.2003;89:1298-1304.
9.Ougolkov,A.V,Bone,N.D.,Femandez-Zapico,M.E.,Kay,N.E.,Billadeau,D.D.Inhibitionofglycogensynthasekinase一3activityleadstoepigeneticsilencingofnuclearfactorkappaBtargetgenesandinductionofapoptosisinchroniclymphocyticleukemiaBcells.Blood.2007,110,735-742.
10.Ougolkov,A.V,Femandez・Zapieo,M.E.,Savoy,D.N.,Urrutia,R.A.,Billadeau,D.D.Glycogensynthasekinase-313participatesinnuclearfactor-KB-mediatedgenetranscriptionandcellsurvivalinpancreaticcancercells.CancerRes.2005,65,2076—2081.
11.BeereHM,HickmanJA.Differentiation:asuitablestrategyforcancerchemotherapy7.AnticancerDrugDes,1993,8(4):299—322
12.DiemJA,ZindyF,SherrCJ.InhibitionofcyclinD1phosphorylationonthreonine-.286preventsitsrapiddegradationviatheubiquitin-proteasomepathway.GenesDev,1997,11:957-972.
13.SpinellaMJ,FreemantleSJ,SekulaD,eta1.RetinoicacidpromotesubiquitinationandproteolysisofcyclinD1duringinducedtumorcelldifferentiation.JBiolChem,1999,274:22013-22018.
14.GermainD,Russell气ThompsonA,eta1.UbiquitinationoffreecyclinDIisindependentofphosphorylationonthreonine286,JBiolChem,2000,275:12074-12079.
15.MoriJ,Takahashi—YanagaF'MiwaYeta1.Differentiation-inducingfactor-1inducescyclinDIdegradationthroughthephosphorylationofThr286insquamous
cellcarcinoma.ExpCellRes,2005,310(2):426-433.
16.ChenC,JackJ,GarofaloR.S.TheDrosphilainsulinreceptorisrequiredfornormalgrowth.Endocrinology(Baltimore),1996,137:846-856.
17.WangYLamJB,LamKS,eta1.Adiponectinmodulatestheglycogensynthasekinase一3beta/beta-cateninsignalingpathwayandattenuatesmammarytumorigenesisofMDA—MB-231cellsinnudemice.CancerRes,2006,66:11462—11470.18.HuangM,KamasaniU,PrendergastGC.RhoBfacilitatesc-MyeturnoverbysupposingefficiemnuclearaccumulationofGSK一3.Oneogene,2006,25:1281—1289.19.MaurerU,CharvetC,WagrnanAS,eta1.Glycogensynthasekinase一3regulatesmitochondrialoutermembranepermeabilizationandapoptosisbydestabilizationofMCL-1.MolCell,2006,21:749—760.
20.OrmeMH,GianniniAL,VivancoMD,eta1.Glycogensynthasekinase一3andAxinfunctioninabeta-catenin—independentpathwaythatregulatesneuriteoutgrowthinneuroblastomacells.MolCellNeurosci,2003,24:673—686.
21.ManoukianAS,WoodgeaJR.Roleofglycogensynthasekinase一3incancer:regulationbyWntsandothersignalingpathways.AdvCancerRes,2002,84:203—229.
附件
1)个人简历
1978年8月出生,主要从事神经药理学与肿瘤药理学研究。
2007年10月~今,中山大学附属第三医院,博士后
2004年7月"一2007年9月中山大学,药理学专业,获医学博士学位2001年7月"--2004年9月武汉大学,药理学专业,获医学硕士学位1996年7月"-'-'2001年9月武汉大学,临床医学,获医学学士学位2)在站期间发表的论文和论著
1.曼皑,LuH,“GYanGGlycogensynthasekinase一3pregulatesastrocytic
differentiationofU87一MGhumanglioblastomacells.ActaPharmacolSin.Accepted.
2.LuH,地奉(co-firstauthor),ShuM,TangJ,HuangYZhouYLiangYYanG
Hypoxia-induciblefactor-1alphablocksdifferentiationofmalignantgliomas.FEBS】.2009;276(24):7291-304.
3)在站期间获得的科研基金及承担的其它课题
l国家自然科学基金青年项目(编号:30801408):缺氧诱导因子HIF.1a在
恶性胶质瘤分化中的作用及分子机制。项目负责人。
2第四十三批中国博士后科学基金面上资助项目(编号:20080430805):缺
氧对恶性胶质瘤分化的作用及机制研究。项目负责人。
3第一批中国博士后科学基金特别资助项目(编号:200801266):缺氧对恶
性胶质瘤分化的作用及机制研究。项目负责人。
4)在站期间参加国内外学术会议情况
2009年4月18~21日参加在河南省郑州市召开的十一届全国生化与分子药理学学术会议,发表论文摘要“糖原合成酶激酶.313对恶性胶质瘤细胞分化的影响及机制"。
4)在站期间承担教学和/或工作情况在站期间参与承担研究生实验及论文写作指导工作。
Page1of23ActaPharmacologicaSinica,2
3
4
5
6
7
8Glycogensynthasekinase一313lregulatesastrocytic
differentiationofU87・・MGhumanglioblastomacells《:趣|1玉
‰?I葫
YaIIL11砧,HuiminLU猫,GangL11・,GuangmeiYAN2'+
03謦
。DepartmentYat-Sen
∥:豫oflnfectiousDiseases,ThirdAffiliatedHospitalofSun“
"Uhifersity,Guangzhou,510630,P.R.China
2
DepartmentofPharmacology,ZhongshanSchoolofMedicine。SunYat・Sen
矽j誊。
Un如ef戳t)}t?Guangzhou,510080,P.R.China私
矽二j。“豫:F…pt
稃Thesetwoauthorscontributedequallyto,themanuscript.宰№w抽mc咄spon出nees的uM嘞妒镜bcad电cs∥scd::#。。Emailligangl31@hotmail.eom;ygm@mail.sy毹edu.cn
,龆
。《。篱蟹。肇镕+%雾t红纱
喙鲰,l
294Tai-yuanRoad,Shanghai200031,ChinaEmaihaps@mail.shcnc・ac.cnhttp:ilwww・chinaphar-com
DecisionLetter(APS-10899.R1)
From:aps@mail.shcnc.ac.cn
To:ly9029@163.com
CC:aps@maU.shcnc.ac.cn
Subjeet::APS—DecisiononAPS一10899.R1-Accept
.Body:08一Jan一2010
DearDr.Li:
Itisapleasuretoacceptyourmanuscriptentitled”Glycogen
synthasekinase一3betaregulatesastrocyticdifferentiationof
U87一HGhumanglioblastomacells”initscurrentfomfor
publicationintheActaPharmacologicaSinica・
Therevisedmanuscriptneedfurtherstyleandlanguagerevision.
WewillsendittothePublisherforcopyediting,whichwilltake2—3
weeks.Pleasewaitwithpatience.
Thankyouforyourfinecontribution.OnbehalfoftheEditorsofthe
ActaPharmacologicaSinica,welookforwardtoyourcontinued
contributionstotheJournal.
Sincerely,
Editor,ActaPharmacologicaSinica
aps@mail.shcnc.ac.cn
DateSent:08-Jan-2010
Hypoxia—induciblefactor-1饶blocksdifferentiationofmalignantgliomas
HuiminLul,・,YanLil,2,鼍,MinfengShul,JianjunTan91,YijunHuan91,YuxiZhoul,YingjieLian93andGuangmeiYanl
1DepartmentofPharmacology,ZhongshanSchoolofMedicine.SunYat-SenUniversity.Guangzhou,China
2DepartmentofInfectiousDiseases.ThirdAffiliatedHospitalofSunYat-SenUnivers.吖.Guangzhou.China
3DepartmentofPathology.FirstAffiliatedHospitalofSunYat-SenUniversity.Guangzhou.China
KeywordsAberrantdifferentiationisacharacteristicfeatureofneoplastictmnsforma-CREB-bindingproteinlCBP)/’p300;cobaltdon,whilehypoxiainsolidtumorsisbelievedtobelinkedtoaggressivechloride;differentiation;HIF-1《malignantbehaviorandpoorprognosis.However,thepossiblerelationshipbetweengliomashypoxiaanddifferentiationinmalignanciesremainspoorlydefined.HereCorrespondenceweshowthatratC6andprimaryhumanmalignantmiomacellscanbeG.Yan.DepartmentofPharmacology.inducedtodifferentiateintoastrocytesbythewell.knownadenylatecyclaseZhongshanSchooIofMedicine.SunYat-Senactivatorforskolin.However.hypoxia.induciblefactor—l伍expressionstimu.University.74ZhongshanRoadmIatedbythehypoxiamimeticscobaltchlorideordeferoxamineblocksthisGuangzhou.510080.ChinadifferendafionandthiseffectivenessisreversibleuponwithdrawaloftheFax:186)20名7330578
Tel:IB6)20.87333258hypoxiamimeucs.Importantly.knockdownofhypoxiainduciblefactor.1疆
byRNAinterfeFencerestoresthedifirerentiationcapabilitiesofthecells。
E-mail:ygm@mail.SySU.edu.crl
eveninthepresenceofcobaltchloride.whereasstabilizationofhypoxia.
。Theseauthorscontributedequelfytothisinduciblefactor—I俚throughretardedubjquitjnationbyvonHippel—Lindauworkt11morsuppressorgenesilenceabrogatestheinduceddifferentiation.More・
over。targetingofHIF.1usingchetomin,adisrupterofHIF.1bindingto
IReceived26August2009.reviseditstranscriptionalco.activatorCREB.bindingprotein(CBP)/p300.ab01.2October2009,accepted14Octoberishesthe
2009Jdifferendation.inhibitoryeffectofhypoxia.induciblefactor-l覆.Administrationofchetominincombinationwithforskolinsignificantlydoi:10.1111/i.1742-4658.2009.02441.xsuppressesmalignantgliomagrowthinaninvivoxenograftmodel.Analy-
sisof95humangliomatissuesrevealedanincreaseofhypoxia—inducible
factor-Iaproteinexpressionwithprogressingtumorgrade.Takentogether,
thesefindingssuggestakeysignaltransductionpathwayinvolving
hypoxia.induciblefactor-ldthatcontributestoadifferentiationdefectin
malignantgliomasandshedsnewlightontheditierentiationtherapyof
solidtumorsbytargetinghypo】【ia—induciblefactor-la.
。丝!垒匹::!!;!!!:CBP(uniprotkb:Q笪坚望!)ph.vsicallyinteracts(塑!:塑!:)withHifla(uni-
protkb:竺!!!塑)byantibaitcoimmunoprecipitation(竖!j!!竖)
Introduction
Deviationfromthetissue/lineage-specificdifferentia-tumorigenesis【l】.TheaberrantlydifferentiatedcellstionprogramisoneofthefundamentalaspectsofshowabnormalgrowthcharacteristicsanddistinctAbbreviations
CBP.CREB-bindingprotein:CREB.cAMP-responsiveelementbindingprotein;DFO,deferoxamine;FBS.fetalbovineserum;GFAP.glialfibrJllawacidprotein:Glut・1.glucosetransporter-1;HIF・1.hypoxiainduciblefactor一1:MTT.3-t4.5-dimethylthiazol一2-y1)・2,5-cliphenyl‘letrazolJumbromide;PCNA.proliferatingcellnuclearantigen;pVHL.vonHippoI-Lindautumorsuppressorprotein;siRNA.smallinterferingRNA;VHL.yonHippeI-Lindau;VEGF.vascularendothelialgrowthfactor.
FEBSJournal278(2009)7勰1-73D4o2009TheAulhorsJournaleomp始Uono2009FEBS7291
致谢
感谢我的导师李刚教授以及博士导师颜光美教授。从课题的选题、开展,到实际问题的讨论、解决,均得到了导师细致而关键的指导和帮助,使本文的工作得以顺利完成。两年年来导师严谨的科学态度,锲而不舍的钻研精神和远见卓识的创新精神,是我学到的最宝贵的精神财富,将使我受益终生。
衷心感谢科研科张勇科长,韩莉老师与祖晨曦老师,为本研究的顺利进行提供了各种帮助与支持。最后感谢我的先生、父母与妹妹多年来给予的关心与支持。