黄芩道地性形成"逆境效应"的实验验证与展望

　　[摘要]逆境效应是环境对道地药材形成影响的一种表现，其主要核心思想是环境饰变通过影响药用植物基因的表达，从而影响其次生代谢产物的形成和积累，该文以热河黄芩为研究对象，从19个产区采集野生黄芩，分析其活性成分的含量，并结合近10年1―12月的气候因子的变化，得出气候因子影响黄芩活性成分积累的结论，随后以黄芩悬浮细胞为材料，模拟环境变化，检测其代谢途径中相关酶和基因的变化，从分子水平上阐述“逆境效应”对黄芩药材品质的影响。该文介绍了道地药材形成“逆境效应”实验验证的前提条件、黄芩道地性形成“逆境效应”研究思路和研究进展，并对未来研究的发展趋势进行展望，以期为其他道地药材品质形成机制研究提供借鉴。 　　[关键词]道地药材；逆境效应；热河黄芩 　　道地药材物质基础的表现形式（表型）包括药材性状组织结构有效成分的组成和含量及其疗效等，其取决于道地药材原植物的基因型及其所处的环境，即“表型=基因型+环境饰变”。早在2004年，黄璐琦等就道地药材表型特征基因型特征及环境饰变3个方面提出了道地药材形成的模式假说，即道地药材的化学组成有其独特的自适应特征；道地药材的道地性越明显，其基因特化越明显“逆境效应”能促进道地药材的形成。然而这3个假说之间并不是独立的，而是相互联系的，即“逆境效应”是外因“基因特化”是内因“化学组成自适应”是表现。但目前尚鲜有报道将环境、遗传、成分相联系，通过多学科系统研究，揭示道地药材这一复杂系统形成的内在生物学本质。 　　为更有效率的解决道地药材研究中的问题，首先需要剖析道地药材这一复杂系统的核心，在此基础上根据相关的假说设计研究模型，并通过进行受控实验、运用系统生物学的思路和方法进行研究。黄璐琦等探讨了以丹参为材料建立可控的模型进行道地药材生物学成因研究的可行性。在此基础上，本文以热河黄芩为研究对象，介绍了黄芩道地性形成“逆境效应”的实验验证思路和进展，以期为道地药材品质形成机制研究提供借鉴。 　　1道地药材形成“逆境效应”假说的核心思想 　　“逆境效应”是环境对道地药材形成影响的一种表现，即道地药材是长期适应逆境的产物，道地性可能是在经历了无数次环境胁迫中获得。 　　中药材的药效成分通常都是次生代谢产生的小分子化合物，不少研究证实了逆境会促进这类植物次生代谢产物的增加。环境饰变可以通过影响药用植物基因的表达，从而影响其次生代谢产物的形成和积累。经过长期对环境的适应，药用植物已经选择了较为适宜的自然环境，当自然环境的突然改变或在环境胁迫条件下，植物通过物理手段与其他植物竞争有限资源的能力大为降低，此时植物次生代谢产物的积累和释放将提高植物自身的竞争能力。 　　当植物体应对外界环境变化时也会产生某些信号分子，并引起植物形态或生理上的变化，调控植物的生长和次生代谢物的变化。从整体上看，这个过程在分子水平上实际上是基因组中所有基因和调控元件，在包括复制、转录、转录后加工、翻译和翻译后加工等多个层次上，并在不同时间和空间进行表达、相互作用的结果，深入了解药材生长发育的内在机制以及内外环境对基因表达的影响，将有利于阐明道地药材品质形成的分子机制。 　　2“逆境效应”假说实验验证的前提条件 　　2.1道地药材产区明确 道地性显著 传统认为河北承德所出产的黄芩质量最优，被世人称为“热河黄芩”。通过对黄芩产区的历史变迁进行了本草考证，按照时间顺序得出主流本草记载黄芩的产地主要有：湖北、山东、江苏、陕西、甘肃河南、山西、河北。而现在文献记载黄芩的产地除了上述省份以外，还包括内蒙古、辽宁、吉林、黑龙江。然而，不同产地黄芩中的活性成分含量存在明显差异，其含量的变化是药材自身适应环境变化的需要。阐释道地黄芩品质形成环境机制及其调控将为中药材的生产、采收、加工等关键技术研究与标准化提供重要的理论依据。 　　2.2药材的活性成分及其生物合成途径的明确 黄芩作为常用中药，国内外学者对其化学成分研究作了大量的工作，至今已从黄芩及其近缘种中分离出了多种类型的化学成分，其中主要是黄酮类化合物，其他成分还有萜类、甾醇、氨基酸、生物碱和微量元素等、但种类最多、生物活性最显著的是黄酮类化合物、其次是二萜类化合物。目前已建立了黄芩悬浮细胞培养体系，且在黄芩愈伤组织中也发现其含有黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、黄芩新素Ⅰ、黄芩新素Ⅱ、白杨黄素等8种黄酮类成分。 　　开展黄芩活性成分形成环境机制研究之前，首先要搞清楚黄芩体内黄芩苷是如何产生的，又是如何消耗的。目前黄芩苷等活性成分的生物合成途径已研究的比较清楚。苯丙氨酸解氨酶（PAT）首先负责将苯丙氨酸的氨基脱去，使其转化为反式肉桂酸。肉桂酸-4-羟基化酶（CAH）是该途径的第二个酶，负责催化肉桂酸4位上的羟基化，使其转化成为反式-4-香豆酸。第三个酶是4-香豆酸辅酶A连接酶（4CT），它催化香豆酸与辅酶A的酯化结合，从而使香豆酸得以活化，可被用于更进一步的合成。这一步骤生成的反式香豆酰辅酶A酯，在植物的次生代谢中是一个非常重要的中间产物，从这一物质分支开去可以形成许多重要的植物次生代谢产物。大多数的植物体内都不能大量累积查尔酮，查尔酮一经合成便经过一系列的酶促反应转化为不同种类的黄酮类代谢物，在查尔酮异构酶（CHT）催化下查尔酮-抽（苷）配基-4，5，7-三羟黄烷酮进一步合成柚（苷）配基-4，5，7-三羟黄烷酮，这个产物是形成黄芩类黄酮重要组分黄芩素和黄芩苷的前体，在黄烷酮合成酶（FNS）作用下进入黄芩苷合成途径。 　　2.3药材的活性成分植物体内生理功能明确 然而环境对植物体内黄酮积累影响的分子机制是十分复杂的。几乎所有的黄酮类化合物都具有体外抗氧化活性，可以消除活性氧（ROS）。而活性氧是植物细胞在逆境条件下迅速产生的分子，是植物对环境变化的直接反映，在植物体内黄酮同样具有抗氧化的活性。在植物体内，黄酮的氧化过程主要是受到多酚氧化酶（儿茶酚氧化酶、漆酶）和过氧化物酶的催化，而这些酶的活性又受到植物发育、环境胁迫的影响。黄酮类化合物作为活性氧清除系统中的抗氧酶的底物，与植物细胞内相关的抗氧化酶一起作用参与到抗氧化代谢中，在给出质子的同时有效地降解ROS，有较强的抗氧化效果，其积累机制受到ROS代谢的影响，与活性氧代谢有着密切的联系。 　　在黄芩体内，β-葡萄糖酸酶是与类黄酮一起起作用的起始关键酶，它在清除H2O2机制中起到了质子提供者的重要作用。黄芩悬浮细胞在过量H2O2的诱导下，可立即利用β-葡萄糖酸酶对黄芩苷-7-O-β-D-葡萄糖酸进行水解，而释放出的黄芩素马上被过氧化物酶氧化为6，7-去氢化黄酮。H2O2在过氧化反应中很快就被消耗，同时影响了黄酮的积累，β-糖苷酸酶抑制剂1，4-葡糖二酸内酯，能够明显降低黄芩细胞H2O2代谢的能力，说明β-糖苷酸酶在H2O2的代谢中起到了重要作用，其催化水解产生的黄酮在氧化成脱氢黄酮的过程中有效的还原了H2O2，同时影响到黄芩有效成分的积累，一方面，参与黄酮合成代谢的基因受到ROS信号分子的调控；另一方面，转录因子在黄酮生物合成中起着重要的作用，通过与结构基因的结合，转录因子可激活次生代谢合成途径中多个基因协同表达，从而有效启动黄酮生物合成途径。基于以上思考，可以从黄酮生物合成的调控、植物活性氧代谢机制等方面开展道地黄芩品质形成的环境机制及其调控研究，为解释道地药材的“逆境效应”提供有效途径。 　　3“逆境效应”假说实验验证的主要内容 　　3.1道地黄芩品质形成的环境限制性因子分析 主要从气候因子和物候期2个方面对道地黄芩活性成分形成关键气候因子进行了分析，首先通过收集19个黄芩主产区野生黄芩样本，对其总黄酮、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含量进行测定，并结合各产地近10年1―12月的气候因子（包括平均值、最高值和最低值）进行聚类分析、回归分析、相关性分析，结果发现根中黄芩苷含量与6，7月平均温度密切相关，黄芩素含量与2，3月降水量密切相关，而汉黄芩素与2月降水量、11月份相对湿度及日照时数密切相关，证实夏季高温和早春少雨是影响黄芩活性成分积累的关键因子。进一步与非道地产区气候因子进行比较，推断水分可能是道地黄芩限制影响因子。 　　同时，由于产地气候条件差异对黄芩生长发育也会造成影响，即不同产地各月份黄芩生长状况不同，因此引入植物物候期的概念，对栽培黄芩不同物候期生长发育及活性成分含量进行统计分析，证实展叶期和枯黄期是黄芩活性成分积累的关键时期。以上结果为进一步研究气候因子对黄芩活性成分积累影响的分子机制提供依据。 　　3.2道地黄芩形成的“逆境效应“揭示 以黄芩作为研究对象，利用植物生理学、分子生物、学化学等技术手段系统地进行了道地黄芩形成的“逆境效应”分子机制研究，证明温度水分、光照等适度环境胁迫促进黄芩活性成分的积累及其生物合成关键酶基因的表达。 　　在受控试验条件下，通过黄芩悬浮细胞培养体系和植株土壤培养体系，分析了高温、低温、土壤缺水、聚乙二醇（PFG）模拟水分胁迫、光照条件对黄芩总黄酮、黄芩苷、黄芩素、苷和苷元比例及其生物合成途径关键酶基因表达的影响。具体研究结果包括：①诱导对黄芩悬浮细胞中有效成分的积累有显著的促进作用，光诱导刺激了与有效成分积累相关基因PAL，UBGAT的表达；②水分胁迫下，黄芩根中总黄酮、黄芩素含量显著增高，叶中总黄酮含量显著提高；土壤缺水刺激了根和叶中黄芩活性成分生物合成途径关键酶基因的表达；③10%PEG模拟水分胁迫条件下，黄芩悬浮细胞中黄芩素含量显著提高，且PAL基因转录水平显著提高；20%PEG胁迫提高了UBGAT基因的表达量；④高温抑制黄芩悬浮细胞中黄芩苷、黄芩素的积累以及PAL的活性。与30℃相比，10℃处理降低黄芩根中总黄酮和黄芩苷的含量；40℃处理降低黄芩素的含量，且降低CUS转录水平而提高URGAT转录水平。以上试验结果证实，适度环境胁迫促进黄芩活性成分的积累，且PAL，CHS等关键酶基因在影响黄芩活性成分积累中发挥重要作用。 　　3.3基于逆境效应的赤霉素水平对黄芩活性成分积累调控机制 在受控试验条件下分析了高温、低温、土壤缺水、PEG模拟水分胁迫、光照条件对内源激素吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（Gas）、脱落酸（ABA）、玉米素核苷（ZR）含量变化的影响，并对黄芩活性成分及内源激素相关性进行分析，证实植物内源激素CAs在适度环境胁迫影响黄芩有效成分积累的过程中发挥了重要的作用，并构建了以赤霉素为核心的黄芩活性成分环境调控网络；具体研究结果包括：①在光照条件下，黄芩悬浮细胞中相对较高的内源TAA含量和相对较低的CAs含量有利于黄芩苷的积累；②水分胁迫下，GAs/LAA，GAs/ABA，GAs/ZR比值均呈上升趋势，与黄芩素含量变化显著相关，推测CAs在水分胁迫影响黄芩有效成分积累的过程中可能发挥了重要的作用。 　　在此基础上，利用蛋白质组学分析了土壤缺水对黄芩总蛋白表达的影响，质谱结果分析表明土壤缺水影响活性成分积累可能与GA相应蛋白、IAA生物合成关键酶、MYB转录因子有关。利用受控实验证实体外喷施GA3、萘乙酸（NAA）及其抑制剂，影响黄芩内源CA，LAA以及活性成分含量，初步构建了以赤霉素为核心的黄芩活性成分环境调控网络。 　　为了进一步验证MYR转录因子对黄芩活性成分积累具有调控作用，构建了黄芩cDNA文库，并克隆获得黄芩18个R2R3-MYB基因，利用生物信息学分析预测SbMYB2，Sb-MYB7，SbMYB8可能参与调控黄酮类化合物的积累。在受控实验条件下分析了外源GA3对黄芩SbMYBs基因以及黄芩素生物合成途径关键酶基因转录水平的影响，结果发现Sb-MYB2和SbMYB7的表达谱与SbPALs一致；SbMYB8与SbC4H和SbCHS一致，说明以上3个黄芩MYB基因可能参与调控黄芩素的积累。利用异源生物体对SbMYBs进行基因功能分析，结果表明SbMYB2和SbMYB7过表达影响苯丙素类成分的含量及其生物合成关键酶基因的转录水平。EMSA实验证实SbMYB2与PAL启动子中的调控元件box-L相互作用，从而调控PAL基因的转录；SbMYB8与CHS启动子中的调控元件GmMYB92 BS3相互作用，从而调控CHS基因的转录。体外喷施CA后对异源生物体中黄酮生物合成途径关键酶基因表达进行分析，证实SbMYB2影响黄酮的积累受到GA信号转导的影响，从而构建了以“GA-MYB-PAL/CHS-黄酮类活性成分”核心的道地黄芩品质形成基因调控网络。 　　3.4黄酮体内抗氧化代谢与黄芩品质形成的相关性 由于黄芩体内存在着一种特殊的抗氧化代谢途径，即黄芩素可以消除植物细胞在逆境条件下迅速产生的活性氧分子。因此，黄芩体内抗氧化代谢能力与其品质的形成可能具有一定的相关性。通过设计黄芩环境因子受控实验，利用化学、植物生理学、分子生物学等手段分析环境限制因子对黄芩中黄酮合成与分解的关系、活性氧代谢水平的影响，以及黄酮在黄芩适应环境变化中的作用，确定黄芩体内的抗氧化代谢与药材品质形成的相关性，筛选与活性成分代谢密切相关的黄酮氧化酶。具体研究结果包括：①利用黄芩悬浮细胞分析了不同高温处理对黄芩苷、黄芩素含量的影响。结果发现高温会影响过氧化氢酶、超氧阴离子、过氧化物酶的活性，但过氧化氢和超氧阴离子的含量未发生显著变化，细胞的质量还增加了。该结果暗示黄芩有效成分作为抗氧化剂可能参与了黄芩悬浮细胞应对高温时的反应。在此基础上，分析了高温、低温对黄芩植株根组织中有效成分的影响。结果表明高温和低温均影响POD，APX，SOD酶的活性，但低温对黄芩素生物合成关键酶PAL，UBGAT，GUS基因的转录水平影响不显著。为了进一步了解黄芩有效成分在过氧化氢清除体系中的作用，利用PAI抑制剂ATP，喷施黄芩叶片，抑制黄芩活性成分的积累，分析低温条件下对抗氧化酶CAT，SOD，POD，APX的活性，结果表明在黄芩活性成分含量降低的情况下，为了维持植物体内过氧化氢含量的平衡，过氧化氢清除系统中的抗氧化酶活性被进一步激活。另一方面，RT-PCR分析结果表明在低温和高温处理下，POD2，POD3，DHAR基因转录水平均显著变化，且DHAR的转录水平与黄芩素含量成正相关，该结果暗示POD，DHAR基因可作为候选基因，并利用基因工程的方法调控黄芩有效成分的含量。②利用PEG模拟水分胁迫，分析不同浓度PEG对黄芩悬浮细胞中黄酮类化合物积累的影响。研究结果表明，10%PEG处理可以促进黄芩悬浮细胞中游离脯氨酸和过氧化氢含量，而30%PEG处理可以促进黄芩悬浮细胞中游离脯氨酸，但抑制了过氧化氢和黄芩素的积累，也抑制了CUS和PAI活性。从以上结果可以看出，轻度胁迫可以促进抗氧化剂黄芩素的含量，而重度胁迫则抑制了黄芩素的含量。在此基础上，对轻度土壤缺水对盆栽黄芩活性成分影响的机制进行了初步解析。研究结果表明，与对照相比，12%SWC处理可以促进黄芩总黄酮、黄芩素含量的增加以及活性成分生物合成关键酶基因PAL，CHS，UBGAT，GUS的转录水平，促进了游离脯氨酸的含量，但对过氧化氢清除系统中的抗氧化酶活性的影响不显著。 　　3.5道地黄芩品质形成基因调控网络的构建 基于以上结果，构建了道地黄芩品质形成基因调控网络，见图1。在道地黄芩形成环境限制因子的作用下，黄芩中主要活性成分黄芩苷、黄芩素通过苯丙氨酸代谢途径在体内合成，其合成关键酶基因PAL和CHS分别受到MYB2和MYB8的调控，且MYB2和PAL影响黄酮的积累受到还GA信号转导的影响。黄芩苷和黄芩素之间可以在UBGAT和GUS基因的作用下相互转化，且黄芩素可以在POD的作用下进一步转化为脱氢黄芩素，参与黄芩体内清除活性氧的过程。类黄酮是生长素运输的抑制剂，生长素运输和生长素合成均影响黄芩内源生长素的积累。生长素作为信号分子可以促进过氧化氢的产生，其与CAs的拮抗作用共同参与黄芩活性成分积累的调控。 　　4展望 　　讲究“道地药材”是历代医药学家保证药材质量的成功经验，对道地药材及其品质形成机制进行研究同样对于保证中药质量具有重要的现实意义。目前道地药材的研究基本上集中在历史沿革、考证，生态环境的变迁、内源化学成分和化学组分的分离分析、有效部位和某种（类）有效成分的研究、产地间质量指标的比较等方面，且对于道地药材形成环境影响分子机制研究也仅局限于环境因子对某个或某几个基因表达水平的影响，或群体遗传多样性比较。 　　生态因素对药材道地性形成的影响，并不是这些因素的简单加权，而是一种复杂的综合效应。生物体中的基因往往也不是单独起作用的，而是一组调控因子调控一系列基因的表达，从而形成了网络状的相互关系。一般来说，一个基因的表达受其他基因的影响，而这个基因又影响其他基因的表达，这种相互影响相互制约的关系构成了复杂的基因表达调控网络。因此，几乎所有的细胞活动都被基因网络所控制。 　　在后基因组时代，从海量试验数据中挖掘基因网络，研究和揭示大量基因及其产物之间的相互作用关系，特别是不同环境条件下基因表达与调控的时空机制，将为深入系统探究其隐含的生物规律和道地药材形成的生物学本质奠定了基础。