利用核糖体展示技术筛选功能性蛋白质方法的建立

　　摘 要：核糖体展示(ribosome display)是一种体外筛选功能性蛋白质的有力的工具。利用体外转录和翻译偶联系统可以方便而快捷地完成核糖体展示。筛选系统利用一对能够紧密结合的蛋白质：人锚蛋白(ankyrin)和红血球膜带3蛋白细胞质区域(cytoplasmic domain of erythrocyte membrane protein Band 3，Cdb3)作为模式分子，希望利用cdb3蛋白通过核糖体展示亲和选择得到锚蛋白基因．用于核糖体展示的人锚蛋白基因结构由组装PCR构建，通过PCR技术引入核糖体展示所需的结构元件。在亲和筛选步骤后，只能利用红血球膜带3蛋白筛选得到锚蛋白基因，而不能利用对照牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)筛选得到，从而说明建立的核糖体展示技术能够正常发挥作用。 　　关键词：核糖体展示；体外筛选；功能性蛋白；锚蛋白；红血球膜带3蛋白 　　中图分类号：Q781 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007―7847(2006)01―0028―06 　　核糖体展示是一种体外筛选功能性蛋白质的 有力的工具。首先，Mattheakis等人建立了一种用 于能够展示和筛选肽的体外系统，随后由Hanes 和Pluckthun等人正式建立了这种功能性蛋白体 外筛选技术。迄今为止，这一技术已经被成功地 应用于体外筛选与靶分子有亲和能力的功能性分 子的相关领域。与其他的体内蛋白质筛选系统 不同的是，核糖体展示库的建立不需要细菌转化步 骤，其展示库的多样性能够得到充分保留。 　　在特定的反应条件下，蛋白质基因型和表型 可以通过mRNA-核糖体-蛋白质三联体复合物 的形式联系起来．构建的核糖体展示DNA库中， 可能包含有编码靶蛋白例如功能性蛋白的DNA 分子。DNA库在体外进行转录，转录后的mRNA 纯化后可用于体外翻译，由于构建的mRNA分 子缺乏终止子，核糖体会与mRNA的末端保持结 合状态从而形成mRNA-核糖体，蛋白质三联复 合物，在高浓度镁离子和低温条件下该复合物非 常稳定。通过亲和结合作用，利用固定在固相或 溶液中的配体，能够筛选出与其具有结合能力的 复合物。加入EDTA后，可以将结合下来的复合 物的mRNA洗脱下来．洗脱下来的mRNA经过 纯化可以用作RT-PCR从而恢复其基因型。逆 转录PCR产物也可以用于下一轮核糖体展示。 整个核糖体展示过程参照图1。 　　红血球膜带3蛋白占人红细胞膜蛋白质的 25％，是丰度最高的蛋白质，它主要包括两个结 构域：跨膜区域和细胞质区域。红血球膜带3蛋 白的细胞质区域是膜相关蛋白的锚定位点。锚蛋 白就是其中一种能够与膜带3蛋白紧密相连的外 周蛋白。我们利用这一对能够紧密结合的蛋白 质分子以验证核糖体展示技术的正确建立。 　　在核糖体展示技术中，体外转录和翻译通常 是分开进行的，在我们的这篇报道中利用体外转 录翻译偶联系统，使DNA库的体外转录和翻译同 时进行，从而更加方便和快捷地完成核糖体展示 技术。 　　 　　1 材料和方法 　　 　　1，1 构建用于核糖体展示的锚蛋白基因 　　用于核糖体展示的锚蛋白的构建由组装PCR 完成。其DNA分子模板包括一个T7启动子，转 录后的RNA分子包括一个5＇―和3＇－的茎环结 构，一个原核核糖体结合位点，Flag-tag标记的锚 蛋白基因不含终止密码子，其C末端含有一段作 为间隔子的基因序列(图2A)。 　　在第一步中，用引物1和引物2从周建忠博 上馈赠的含有cdb3的pGEX-2T质粒中扩增锚蛋 白基因。在第二步中，利用引物3和引物4从 AndreasPlOckthun教授馈赠的PAK200质粒中扩 噌噬菌体M13的羧基端作间隔子，其作用是确保 新合成的蛋白质与核糖体相连，并且能够利用间 隔子隔出合适的空间以让新合成的蛋白质正确折 叠。将前两次的PCR产物纯化以等摩尔的比例 混合，使用引物4和引物5做连接PCB，将锚蛋白 基因和间隔子连接起来，在最后一步中，将上一 步的PCR产物用引物6和引物4进行扩增，引入 T7启动子和5’-茎环结构。扩增步骤和引物序列 见图2B。 　　 　　1．2 将配体固定在微孔板的表面 　　400 ng的edb3溶于100μL的PBS中4℃ 过夜包被微孔板。包被的微孔板用PBS洗3次， 再用含5％(w／v)BSA和50 mg／LS.cerevisiae RNA(Sigma)的PBS封闭。另外，用含5％(w／v) BSA和50mg／LS．cerevisiaeRNA(Sigma)的PBS 封闭空白孔用作对照．微孔板用PBS洗5次，用 washing buffer WBT(50 mmol／L Tris-acetate pH 7．5，150 mmol／L NaCl，50 mmol／L magnesiumac－ etate，0，1％Tween-20)洗2次。所有的孔均用冰 预冷的washingbufferWBT填充满置于冰上，在用 于亲和选择前至少放置20min。 　　 　　1.3 体外转录和翻译 　　体外转录和翻译采用Invitrogen公司的Ex－ presswayTmPlusExpressionSystem，按操作手册进 行，201LL的IVPSPlus E．coliExtract，20μL的 2．5xIVPSPlus E．coliReactionBuffer，1μL的T7 EnzymeMix，1μL的75 mmol／Lmethionine，1μL 的200 μmol／LAnti-ssrAoligonucleotide，1μL的 PCRproduct，and 6μL的DNase／RNase-freewater 加入在2．OmL的EP管中，反应溶液37℃保温30 rain，用4倍体积的冰预冷的WBTH(50 mmol／L Tris-acetatepH 7．5，150 mmol／L NaCI，50 mmol／L magnesium acetate，0．1％Tween-20，2，5 g／L hep- arin，Sigma)终止反应。在上清液中加入预冷的 1／5体积的含有10％(w／v)BSA的WBT。反应 混合物在14000S，4t离心5 min后，将上清液 转移到一个新的冰预冷的EP管中。 　　 　　1.4 核糖体复合物的亲和筛选 　　把冰预冷的微孔板中的washingbuffer倾掉， 将翻译混合物转至cdb3和BSA包被的孔中．将 微孔板在冷室中轻摇l h．倾掉翻译反应液，微孔 板用WBT洗5次，随后，在孔中加入200 gL冰 预冷的elutionbufferEB (50mmol／LTris-acetate pH 7．5，150 mmol／L NaCl，50 mg／LS．cerevisiae RNA，20mmol／LEDTA)，冰上轻摇5 min以洗脱 mRNA。洗脱下来的mRNA用RNeasy kit (Qiagen)进行纯化．纯化后mRNA溶于40 p．L RNase-free I-120中，用RNase-free DNase进行处 理，去掉反应液中的DNA分子。纯化的RNA作 为模板，用引物4和引物5作RT-PCR．PCR产物 可以用作下一轮循环，或者做TA克隆和测序， 　　 　　2 结果和讨论 　　 　　2.1 构建用于核糖体展示的锚蛋白基因 　　图3表示为构建核糖体展示的锚蛋白基因过 程中每一轮的PCR产物。在第一轮PCR中我们 用上游引物1和下游引物2扩增锚蛋白。引物2 与引物3的部分序列互补。引物3和引物4扩增 丝状噬菌体M13的基因重作为核糖体展示结构 的间隔子。其作用是确保新合成的蛋白质与核糖 体相连，并且能够留出合适的空间让新合成的蛋 白质正确折叠与固定在微孔板上的肽相互作用， 通过引物5和引物6作PCR在核糖体展示结构 引入体外转录和翻译所需的启动子和核糖体 结合位点，结构中的5’-茎环结构和3’－茎环结 构对于mRNA分子的稳定性及其抗RNase作用 非常重要。5’茎环结构来源于噬菌体的基因 10，由引物5和引物6引入。3’-茎环结构来源于 噬菌体T3的早期翻译终止子，由引物4引入。 　　 　　2．2 将配体固定在微孔板的表面 　　为了避免核糖体展示中的假阳性结果，充分 封闭微孔是十分重要的。我们曾经用只含有5％ (w／v)BSA的PBS对微孔板进行包被，结果出现 假阳性结果，当我们改用含有5％(w／V)BSA和 50 mg／LS，cerevisiae RNA的PBS进行包被时， 这一问题得到解决，我们用cdb3包被微孔板的5 个孔，同时另外5个孔用BSA进行包被作为对照。 如果核糖体展示能够正确工作，只能够从cdb3包 被孔中的转录翻译混合物中扩增出锚蛋白基因。 　　 　　2．3 体外转录和翻译 　　核糖体展示技术中，转录和翻译可以偶联进 行，也可以单独进行。由于T7 RNA聚合酶需要 还原剂保持其稳定性，所以Schaffitzel etal，建议 当核糖体展示用于含有二硫键的蛋白，转录和翻 译应该分开单独进行。但Coia etat应用体外 转录和翻译偶联的兔网织红细胞裂解系统，通过 加入氧化型谷胱甘肽能够展示含有二硫键的单链 抗体。同时可以利用真核生物二硫键别构酶提 高含二硫键的蛋白质的正确折叠率。由于锚蛋白 是一种不含二硫键的蛋白质分子，所以我们在采 用体外转录和翻译偶联系统中没有采取以上两种 措施。 　　在大肠杆菌中，如果mRNA不含终止密码的 话，新合成的蛋白质会被标记上一种11个氨基酸 的肽标签。这一小肽由10SRNA编码，是ssrA基 因产物。胞质和外周胞质中的羧基端蛋白酶会降 解加上这一肽标签的新生肽。所以为了避免展示 系统中新合成的肽被降解掉，我们在转录和翻译 系统中加入了ssrA的反义寡核苷酸。 　　 　　2．4 核糖体复合物的亲和筛选 　　我们加了0．5μgPCR产物DNA分子到转录 翻译反应液中，翻译完毕以后，将反应溶液稀释 至DNA浓度为0．25、0．05、0．025、0．002 5μg用 于亲和筛选。通过在冰上冷却并且用4倍体积的 WBTH稀释终止蛋白翻译，WBTH中含有的50 mmol／L乙酸镁进一步稳定核糖体复合物．我们 将翻译混合物分别加人到5个cdb3包被和BSA 包被的微孔中。由新合成的锚蛋白，核糖体和 mRNA组成的三联复合物会与固相的cdb3蛋白 结合，洗涤掉没有结合的三联复合物以后，用elu－ tionbufferEB对mRNA洗脱，RNA纯化后用引物 4和引物5做RT-PCR。扩增出来的PCR产物具 有我们预期的相对分子质量，进行TA克隆并测 序。多个克隆的测序结果证实RT-PCR产物是锚 蛋白(图4)。相反的是，从BSA包被的孔里不能扩 增出相应的条带(图5)。图4和图5结果显示：我们 只能从cdb3包被孔中的转录翻译混合物中扩增 出锚蛋白基因，而不能从BSA包被的孔中扩增出 锚蛋白基因证明了核糖体展示技术的可行性。 　　从图4和图5可以看出，只有利用和锚蛋白 有亲和能力的cdb3才能从转录翻译混合物中亲 和筛选得到锚蛋白基因，利用对照BSA并不能亲 和筛选得到锚蛋白，说明我们建立的核糖体展示 技术能够正常发挥作用。 　　在这篇报道中，我们通过转录和翻译偶联系 统完成了核糖体展示，整个展示的筛选过程迅速 便捷。现在许多的蛋白质体外筛选系统，例如噬菌 体展示、细胞表面展示、酵母双杂交展示系统等都 需要生物活细胞的参与，必需的转化步骤限制了 库的大小，库的多样性和容量受转化效率影响。而 且在亲和选择过程中，一些细胞体内生长不好或 对细胞有毒性的候选分子会有丢失。尤为重要的 是：如果需要利用体内展示系统对靶分子进行改 造，以期获得更高亲和力和更高特异性的分子的 话，将会是非常繁琐的过程。因此，体外筛选系统 的缺点可以通过引入体内筛选系统进行解决，例 如核糖体展示系统。其展示库的多样性还可以通 过易错PCR在展示过程的RT―PCR中得到增强。 核糖体展示在筛选蛋白质方面越来越展现出其重 要性。我们可以预见其在将来会具有更加广泛的 应用。

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